《《生物化学》教学课件：第10章DNA的生物合成（11采用）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《生物化学》教学课件：第10章DNA的生物合成（11采用）（116页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、目录目录第第10章章DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )目录目录复制复制(replication) 是指遗传物质的传代，以是指遗传物质的传代，以母链母链DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNADNA的生物合成有三种方式：的生物合成有三种方式：复制复制逆逆转录转录损伤损伤DNA的修复合成的修复合成目录目录n本章主要内容：本章主要内容： 复制的基本规律复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程复制的过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA损伤（
2、突变）与修复损伤（突变）与修复复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节目录目录复制的方式复制的方式 半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) n复制的基本规律复制的基本规律 目录目录一、半保留复制是一、半保留复制是DNA复制的基本特征复制的基本特征 DNA生生物物合合成成时时，母母链链DNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为
3、为模模板板(template)按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的子子链链。子子代代细细胞胞的的DNA，一一股股单单链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股单单链链则则完完全全从从新新合合成成。两两个个子子细细胞胞的的DNA都都和和亲亲代代DNA碱碱基基序序列列一一致致。这种复制方式称为这种复制方式称为半保留复制半保留复制。n半保留复制半保留复制的概念的概念: :AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCA
4、TGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNAn 子链继承母链遗传信息的子链继承母链遗传信息的几种可能方式几种可能方式全全保保留留 半半保保留留 混混合合式式 亲代亲代DNA子代子代DNA（四）半保留复制的证明（四）半保留复制的证明实验实验细菌可以利用细菌可以利用NH4Cl作氮源合成作氮源合成DNA轻链14N-DNA重链15N-DNA轻、重链DNA混合半保留复制第一代DNA半保留复制第二代DNA半保留复制第三代DNA细菌在含细菌在含NH4Cl 的普通培养液的普通培养液中培养后提取中培养
5、后提取DNA把细菌放在含把细菌放在含15NH4Cl 的培养液中培养的培养液中培养若干代后提取含若干代后提取含15N的的“重重”DNA把含把含15N-DNA的细菌放回含的细菌放回含NH4Cl 的普通的普通培养液中培养培养液中培养20分钟后提取子一代分钟后提取子一代DNA把含把含15N-DNA的细菌在含的细菌在含NH4Cl 的普通培的普通培养液中培养养液中培养40分钟后提取子二代分钟后提取子二代DNA将轻链将轻链DNA和重链和重链DNA混合混合把含把含15N-DNA的细菌在含的细菌在含NH4Cl 的普通培的普通培养液中培养养液中培养60分钟后提取子三代分钟后提取子三代DNA普通培养液培普通培养液培
6、养细菌的轻链养细菌的轻链DNA在密度梯在密度梯度离心时区带度离心时区带在离心管上方在离心管上方子二代子二代DNA密度梯密度梯度离心分析时有介度离心分析时有介于重带与轻带之间于重带与轻带之间的中间带轻带两种的中间带轻带两种将轻链和重链将轻链和重链DNA混合后密混合后密度梯度离心时度梯度离心时在离心管中有在离心管中有与轻、重链对与轻、重链对应的两条区带应的两条区带子三代子三代DNA密度梯度离心分析时仍有中密度梯度离心分析时仍有中间带和轻带两种，间带和轻带两种，以后各代以后各代DNA分子密度梯度离心结果相分子密度梯度离心结果相同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。含含1
7、5NH4Cl培培养液培养的重养液培养的重链链DNA在密在密度梯度离心时度梯度离心时区带在离心管区带在离心管下方下方子一代子一代DNA密度梯密度梯度离心分析时致密度离心分析时致密带介于重带与轻带带介于重带与轻带之间，没有单独的之间，没有单独的重带和轻带重带和轻带实验结果说明实验结果说明子一代子一代DNA双链中双链中一股是一股是15N单链，从亲代接受和保留下来的；单链，从亲代接受和保留下来的；另一股是另一股是14N单链，完全是新合成的。单链，完全是新合成的。Messelson和和Stahl的实验支持半保留复制。的实验支持半保留复制。半保留复制的意义半保留复制的意义按半保留复制方式，子代按半保留复制
8、方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱碱基序列一致基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的息，体现了遗传的保守性保守性。遗传的保守性是物种遗传的保守性是物种稳定性稳定性的分子基础，但的分子基础，但不是绝对的不是绝对的。在强调遗传恒定性的同时不能忽视其在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性变异性。目录目录原原核核生生物物复复制制时时，DNA从从起起始始点点(origin)向向两两个个方方向向解解链链，形形成成两两个个延延伸伸方方向向相相反反的的复复制制叉，称为叉，称为双向复制双向复制。 二、二、DNA复制从起始点向两个方向复制从起始点向两个方向延伸
9、形成双向复制延伸形成双向复制复制中的放射自显影图像复制中的放射自显影图像（眼睛状图形）（眼睛状图形）（大肠杆菌（大肠杆菌DNADNA经放射性标记后电镜下观察结果）经放射性标记后电镜下观察结果）terA环状双链环状双链DNA及复制起始点（及复制起始点（ origin）B复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉（replication fork）C复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各
10、自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构E.coliorigin目录目录真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子的的复复制制。习习惯惯上上把把两两个个相相邻邻起起始始点点之之间间的的距距离离定定为为一一个个复复制制子子(replicon) 。复复制制子子是是独独立完成复制的功能单位。立完成复制的功能单位。 53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制3目录目录复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）目录目录5 3 解链方向解链方向
11、35领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)3 5 3355领头链连续复制，领头链连续复制，随从链不连续复制，随从链不连续复制，这就是复制的半不连续性这就是复制的半不连续性DNA的两股单链走向相反，一股为的两股单链走向相反，一股为5至至3，另，另一股（互补链）为一股（互补链）为3至至5 。复制叉上两股母链。复制叉上两股母链也是走向相反。也是走向相反。子链沿母链模板复制，只能从子链沿母链模板复制，只能从5向向3延伸。延伸。同一个复制叉上只能有一个解链方向。同一个复制叉上只能有一个解链方向。 顺着解链方向生成的子链，复制是连续顺着解链方向生成的子链，
12、复制是连续进行的，这股链称为进行的，这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为不连续复制的链称为随从链随从链。冈崎片段冈崎片段复制中的不连续片段称为复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。三、三、DNA一股子链复制的方向与解链方向一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制相反导致半不连续复制目录目录顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，复复制制是是连连续续进进行行的的，这股链称为这股链称为领头链领头链(lead
13、ing strand) 。另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为随随从从链链(lagging strand) 。复复制制中中的的不不连连续续片段称为片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领领头头链链连连续续复复制制而而随随从从链链不不连连续续复复制制，就就是是复复制的半不连续性。制的半不连续性。 目录目录DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA R
14、eplication目录目录n参与参与DNA复制的物质复制的物质:底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP；聚聚合合酶酶(polymerase): 依依赖赖DNA的的DNA聚聚合合酶酶，简简写为写为 DNA-pol；模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链；引引物物(primer): 提提供供3 -OH末末端端使使dNTP可可以以依依次次聚合；聚合；其他的酶和蛋白质因子。其他的酶和蛋白质因子。目录目录n nDNADNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代复制是模板依赖性的，必须要以亲代复制是模板依赖性的，必须要以亲代复制是模板依
15、赖性的，必须要以亲代DNADNA链链链链作为模板。作为模板。作为模板。作为模板。 nDNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解解成单链，它才能起模板作用。成单链，它才能起模板作用。n n亲代亲代亲代亲代DNADNA的两股链的两股链的两股链的两股链解开后，可分别作为模板进行解开后，可分别作为模板进行解开后，可分别作为模板进行解开后，可分别作为模板进行复制。复制。复制。复制。（一）模板（一）模板一、模板、底物、引物一、模板、底物、引物目录目录n n以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP
16、，dTTP。（二）底物（原料）（二）底物（原料）目录目录n 核苷酸和核苷酸之间生成核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键磷酸二酯键是复制是复制的基本化学反应的基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPin聚合反应的特点聚合反应的特点: :DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行。方向进行。目录目录n n引物酶引物酶( (primeraseprimerase) )本质上是一种依赖本质上是一种依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶（聚合酶（DDRPDDRP），），该酶以该酶以DNADNA为模板，为模板，聚合一段聚合一
17、段RNARNA短链短链引物引物(primer)(primer)，以提供自由以提供自由的的3-OH3-OH，使子代使子代DNADNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。n n引物酶需组装成引物酶需组装成引发体引发体才能催化才能催化RNARNA引物的合引物的合成。成。（三）（三）RNA引物引物目录目录3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNARNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶u全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)u简称：简称：DNA-polu活性（作用）有两方面：活性（作用）有两方面：u53
18、的的聚合聚合活性，活性， 延延53 方向方向延长脱氧核苷酸延长脱氧核苷酸链。链。u核酸核酸外切外切酶活性（两种情况）酶活性（两种情况） u3 5 外切酶活性，外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。u5 3 外切酶活性，外切酶活性，能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。二、二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合聚合酶催化核苷酸之间聚合核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5 外切酶外切酶活性活性能辨认错配的碱基对，能辨认错配的碱基对，并将其水解。并将其水解。5 3 外外切酶活性能切除切酶活性能切除突变的突变的 DNA片段。片段。 目录目录（一）原核生物的（一）原
19、核生物的DNA聚合酶分为三型聚合酶分为三型DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶三种酶共同点三种酶共同点： 5 3 聚合酶活性聚合酶活性 3 5 外切酶活性外切酶活性目录目录n功能：功能：DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C
20、 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录目录DNA-pol （120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。目录目录n功能：功能：DNA-pol (250kD)是原核生物复制延长中真正起催
21、化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。(Pol 活性高于活性高于Pol ：每分钟达每分钟达105次聚合反应次聚合反应 。)10个亚基组成的不不对称二聚体对称二聚体滑动夹子滑动夹子（两个亚基）（2围绕双螺旋形成一个 环，模板链从该环通过）稳夹模板并沿模板滑动 复合物复合物 夹子装载核心酶核心酶（、 亚基）亚基有亚基有5 3方向聚合作用（105/分）。亚基亚基具有35核酸外切酶 活性，起校读作用目录目录（ 亚基）亚基）（核心酶）（核心酶）3 3 5 5 目录目录（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引
22、物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶注：五种酶共同点注：五种酶共同点 5 3 外切酶活性外切酶活性目录目录三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据功能是复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复
23、制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录目录（一）（一）核酸外切酶活性核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配在复制中辨认切除错配碱基并加以校正碱基并加以校正核核核核酸酸酸酸外外外外切切切切酶酶酶酶( (exonucleaseexonuclease) )是是是是指指指指能能能能从从从从核核核核酸酸酸酸链链链链的的的的末末末末端端端端把把把把核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸依依依依次次次次水水水水解解解解出出出出来来来来的的的的酶酶酶酶，外外外外切切切切酶酶酶酶是是是是有有有有方向性的。方向性的
24、。方向性的。方向性的。 目录目录A：DNA-pol的的外切酶活性外切酶活性切除错配碱基；并用其切除错配碱基；并用其聚合活聚合活性性掺入正确配对的底物（错配修复、掺入正确配对的底物（错配修复、即时校读即时校读）。）。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能目录目录（二）复制的保真性依赖（二）复制的保真性依赖DNA聚合酶聚合酶正确的正确的碱基选择碱基选择DNA聚合酶聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反
25、式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 目录目录遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：目录目录四、复制中的分子解链伴有四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。
26、解成单链，它才能起模板作用。 目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态目录目录E. Coli 基因图基因图目录目录n n解螺旋酶解螺旋酶( (helicasehelicase) ) ，又又称解链酶或称解链酶或reprep蛋白蛋白( (dnaAdnaA 、B B、C)C)，是用于解开，是用于解开DNADNA双链的酶蛋白。双链的酶蛋白。n n每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2 2分子分子ATPATP。1、解螺旋酶、解螺旋酶目录目录目录目录n n单链单链DNADNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding single st
27、rand binding protein, SSBprotein, SSB），是一些能够与单链），是一些能够与单链DNADNA结合的结合的蛋白质因子。蛋白质因子。2、单链、单链DNA结合蛋白结合蛋白目录目录nn SSBSSBSSB的生理作用：的生理作用：的生理作用：的生理作用：的生理作用：的生理作用：使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNADNA单链能够稳定存在，单链能够稳定存在，即稳定单链即稳定单链DNADNA，便于其作为模板复制子代，便于其作为模板复制子代DNADNA；保护单链保护单链DNADNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。 目录目录n n引物酶引物酶引物酶引物酶( (prime
28、raseprimerase) )本质上是一种依赖本质上是一种依赖本质上是一种依赖本质上是一种依赖DNADNA的的的的RNARNA聚合聚合聚合聚合酶（酶（酶（酶（DDRPDDRP），由），由），由），由dnaGdnaG基因编码，该酶以基因编码，该酶以基因编码，该酶以基因编码，该酶以DNADNA为模板，为模板，为模板，为模板，聚合一段聚合一段聚合一段聚合一段RNARNA短链短链短链短链引物引物引物引物(primer)(primer)，以提供自由的以提供自由的以提供自由的以提供自由的3-OH3-OH，使子代使子代使子代使子代DNADNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。链能够开始聚合。链能够开始聚合。
29、 （注：注：注：注：DNADNA聚合酶没有催化游离聚合酶没有催化游离聚合酶没有催化游离聚合酶没有催化游离dNTPdNTP之间相互聚合的能力之间相互聚合的能力之间相互聚合的能力之间相互聚合的能力）n n引物酶需组装成引物酶需组装成引物酶需组装成引物酶需组装成引发体引发体引发体引发体才能催化才能催化才能催化才能催化RNARNA引物的合成。引物的合成。引物的合成。引物的合成。3. 引物酶引物酶目录目录108局部解链后局部解链后n复制过程复制过程正正超螺旋的形成：超螺旋的形成：（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、超螺旋状态、理顺理顺DNA链链复制速度快，旋转达复制速度快，旋
30、转达100100次次/ /秒秒目录目录既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶拓扑异构酶（原原: :- -蛋白蛋白 真：转轴酶真：转轴酶 、 解缠酶、切口解缠酶、切口- -封闭酶、松弛酶封闭酶、松弛酶）拓扑异构酶拓扑异构酶（原原: :旋转酶 真：几种亚型真：几种亚型）n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：目录目录拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构
31、酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n作用机制：作用机制：目录目录连连接接DNA链链3 -OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5 -P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相邻的相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。n DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式：五、五、DNA连接酶连接连接酶连接DNA双链中的双链中的单链缺口单链缺口目录目录HO5335DNA连接
32、酶连接酶ATPADP5353nDNA连接酶的作用：连接酶的作用：目录目录目录目录DNA连连接接酶酶在在复复制制中中起起最最后后接接合合缺缺口口的的作用。作用。在在DNA修修复复、重重组组及及剪剪接接中中也也起起缝缝合合缺缺口作用。口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目录目录DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第第 三三 节节目录目录（一）复制起始：（一）复制起始：DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形
33、成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成目录目录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解
34、链解链目录目录目录目录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。目录目录目录目录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录（二）复制的延长过程：领头链连续复制，（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制随从链不连续复制复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dN
35、TP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目录目录n领头链的合成：领头链的合成：领头链的子链沿着领头链的子链沿着5 5 33 方向可以连续地延长。方向可以连续地延长。n随从链的合成随从链的合成n同一复制叉上领头链和随从链由相同的同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长催化延长 DNADNA聚合酶聚合酶催化领头链和随从链同时合成催化领头链和随从链同时合成复复
36、制制过过程程简简图图目录目录目录目录原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口空缺、连接切口目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 随从链上不连续性片段的连接：随从链上不连续性片段的连接：目录目录目录目录目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G
37、2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关。性有关。 蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而而实施调控作用。实施调控作用。 目录目录真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分分组组方方式式激活而不是同步起动。激活而不是同步起动。 复制起始点比大肠杆菌起始点复制起始点比大肠杆菌起始点OriC短（短
38、（11bp）复复制制的的起起始始需需要要DNA-pol （引引物物酶酶活活性性）和和pol （解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参与与。还还需需拓拓扑扑酶酶和和复复制因子制因子(replication factor, RF)。 （一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似目录目录增增 殖殖 细细 胞胞 核核 抗抗 原原 （ proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在在复复制制起起始始和和延延长长中中起起关关键键作作用用。PCNA为为同同源源三三聚聚体体，具具有有与与E.coli DNA 聚聚合合酶酶的的亚亚基基相相同同的的功功能
39、能和和相相似似的的构构象象，即即形形成成闭闭合合环环形形的的可可滑滑动动DNA夹夹子子，在在RFC的的作作用用下下PCNA结结合合于于引引物物模模板板链链；并并且且PCNA使使pol获获得得持持续续合合成成能能力力。PCNA水水平平也也是是检检验验细细胞胞增增殖殖的重要指标。的重要指标。目录目录DNA-pol 和和pol 分分别别兼兼有有解解螺螺旋旋酶酶和和引引物物酶酶活活性性。在在复复制制叉叉及及引引物物生生成成后后，DNA-pol 通通过过PCNA的的协协同同作作用用，逐逐步步取取代代pol ，在在RNA引引物物的的3 -OH基基础础上上连连续续合合成成领领头头链链。随随从从链链引引物物也
40、也由由pol 催催化化合合成成。然然后后由由PCNA协协同同，pol 置置换换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 （二）真核生物复制的延长发生（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体n真核生物复制叉的延长：真核生物复制叉的延长： 真核生物的真核生物的DNA复制与核小体装配同步进行复制与核小体装配同步进行 目录目录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色
41、体两端DNA子链上子链上最后复制的最后复制的RNA引物引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题目录目录端粒端粒(telomere) 指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。n端粒的功能：端粒的功能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性n端粒的结构特点：端粒的结构特点：由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短序列。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG
42、目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) n组成：组成：端粒酶的端粒酶的RNA端粒端粒DNA末端末端1 1、端粒酶靠、端粒酶靠hTRhTR（AnCnAnCn）x x与母链与母链DNADNA端粒结合端粒结合内在模板RNA2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA为模版，逆转录，延长为模版，
43、逆转录，延长DNADNA母链母链3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延长母链，同时模板，再次延长母链，同时DNADNA母链反摺利于下游复制延伸。母链反摺利于下游复制延伸。端粒酶的端粒酶的RNA4 4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol DNA-Pol 。此时。此时母链母链3 3-OH-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。端粒酶的端粒酶的RNADNA-Pol目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription & Othe
44、r DNA Replication Ways第四节第四节目录目录双双链链DNA是是大大多多数数生生物物的的遗遗传传物物质质。某某些些病病毒毒的的遗遗传传物物质质是是RNA。少少数数低低等等生生物物如如M13噬噬菌菌体体，它它的的感感染染型型只只含含单单链链DNA。原原核核生生物物的的质质粒粒，真真核核生生物物的的线线粒粒体体DNA，都都是是染染色色体体外外存存在在的的DNA。这这些些非非染染色色体体基基因组，采用特殊的方式进行复制。因组，采用特殊的方式进行复制。目录目录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) 逆
45、转录逆转录酶酶一、逆转录病毒的基因组是一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录其复制方式是逆转录RNARNADNADNA目录目录n逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA目录目录RNA病病毒毒在在细细胞胞内内复复制制成成双双链链DNA的的前前病病毒毒(provirus)。前前病病毒毒保保留留了了RNA病病毒毒全全部部遗遗传传信信息息，并并可可在在细细胞胞内内独独立立繁繁殖殖。在在某某些些情情况况下下，前前病病毒毒基基因因组组通通过过基基因因重重组组(r
46、ecombination)，参参加加到到细细胞胞基基因因组组内内，并并随随宿宿主主基基因因一一起起复复制制和和表表达达。这这种种重重组组方方式式称称为为整整合合(integration)。前前病病毒毒独独立立繁繁殖殖或整合，都可成为致病的原因。或整合，都可成为致病的原因。 逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期RNARNA病毒粒子病毒粒子病毒粒子病毒粒子病毒病毒病毒病毒RNARNARNARNA DNA DNA 逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶DNADNA（前病毒）前病毒）前病毒）前病毒）和宿主细胞和宿主细胞和宿主细胞和宿主细胞DNADNA整合整合整合整合c-srcc-src整合后的整合后的整
47、合后的整合后的DNADNA进行复制进行复制进行复制进行复制v-srcv-src静止或激活而表达静止或激活而表达静止或激活而表达静止或激活而表达宿主细胞宿主细胞宿主细胞宿主细胞DNADNA目录目录分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 n试管内合成试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T
48、 TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录二、逆转录的发现发展了中心法则二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能。样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) & Re
49、pair第五节第五节目录目录DNA突突变变具具体体指指个个别别dNMP残残基基以以至至片片段段DNA在在构构成成、复复制制或或表表型型功功能能的的异异常常变变化化，也称为也称为DNA损伤损伤(DNA damage)。从从分分子子水水平平来来看看，突突变变就就是是DNA分分子子上上碱碱基基的改变。的改变。 目录目录一、突变在生物界普遍存在一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础从从长长远远的的生生物物史史看看，进进化化过过程程是是突突变变的的不不断断发生所造成的。发生所造成的。大大量量的的突突变变都都是是属属于于这这种种类类型型，只只是是目目前前还
50、还未未能能认认识识其其发发生生的的真真正正原原因因，因因而而名名为为自自发发突变或自然突变突变或自然突变(spontaneous mutation)。目录目录（二）只有基因型改变的突变形成（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性的多态性这这种种突突变变没没有有可可察察觉觉的的表表型型改改变变，例例如如在在简简并并密密码码子子上上第第三三位位碱碱基基的的改改变变，蛋蛋白白质质非非功功能能区区段段上上编编码码序序列列的的改改变变等等。这这些些现现象象也也相相当普遍。当普遍。多多态态性性(polymorphism)一一词词用用来来描描述述个个体体之之间间的基因型差别现象。的基因型差别现象。 目录
51、目录（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础目录目录二、多种化学或物理因素可诱发突变二、多种化学或物理因素可诱发突变大大量量的的突突变变属属于于自自发发突突变变，发发生生频频率率只只不不过过在在10-9左左右右。但但由由于于生生物物基基因因组组庞庞大大，细细胞胞繁繁殖殖速速度度快快，因此它的作用是不可低估的。因此它的作用是不可低估的。实实验验室室用用来来诱诱发发突突变变，也也是是生生活活环环境境中中导导致致突突变变的因素，主要有物理和化学因素。的因素，主要有物理和化学因素。 目录目录n物理因素
52、：物理因素：紫外线紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射、各种辐射 UVn化学因素：化学因素：目录目录三、引起突变的分子改变类型有多种三、引起突变的分子改变类型有多种错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement) 框移框移(frame-shift) 目录目录DNA分子上的碱基错配称点突变分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基上某一碱基的置换。的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。点突变发
53、生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。 （一）错配可导致编码氨基酸的改变（一）错配可导致编码氨基酸的改变目录目录镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因n镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人目录目录图10-29膀胱癌细胞c-ras H基因点突变，基因表达产物仅12号氨基酸的变异目录目录（二）缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸（二）缺失、插入和框移突
54、变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变排列顺序发生改变缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子大分子上消失。上消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到入到DNA大分子中间。大分子中间。缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变 。框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 目录目录谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A
55、C A U G U C 缺失缺失Cn缺失引起框移突变：缺失引起框移突变：目录目录（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病DNA分子内较大片段的交换，称为重组或分子内较大片段的交换，称为重组或重排。重排。移位的移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。重组。 目录目录n由基因重排引起的两种地中海贫血基因型：由基因重排引起的两种地中海贫血基因型：目录目录DNA损伤（突变）可能造成两种结果：其一是损伤（突变）可能造成两种结果：其一是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶
56、二聚体，导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶二聚体，DNA骨骨架中产生切口或断裂）；其二是导致复制后基因突架中产生切口或断裂）；其二是导致复制后基因突变（如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶），使变（如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶），使DNA 序列发生永久性改变。所以，必须通过进化使细胞序列发生永久性改变。所以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否则细拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否则细胞无法维持正常代谢。胞无法维持正常代谢。目录目录四、四、DNA损伤的修复有多种类型损伤的修复有多种类型修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿是对已发生分子改变的补偿措施，使其回
57、复为原有的天然状态。措施，使其回复为原有的天然状态。错配修复错配修复(mismatch repair)直接修复直接修复(direct repair)光修复光修复(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)SOS修复修复 n修复的主要类型：修复的主要类型：目录目录（一）直接修复系统利用酶简单地逆转（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤损伤光修复酶光修复酶(photolyase) UV目录目录（二）核苷酸切除修复系统识别（二）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形双螺旋变形这是细胞
58、内最重要和有效的修复方式。这是细胞内最重要和有效的修复方式。其过程包括去除损伤的其过程包括去除损伤的DNA，填补空隙和连接。，填补空隙和连接。主要由主要由DNA-pol和连接酶完成。和连接酶完成。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATPnE.coli的切的切除修复机制除修复机制目录目录目录目录核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的停转录的RNA聚合酶，即参与聚合酶，即参与转录偶联修复转录偶联修复(transcription-couple
59、d repair)。转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于正在转录的正在转录的DNA，使该区域的损伤尽快得以，使该区域的损伤尽快得以修复。修复。 目录目录（三）重组修复（三）重组修复目录目录（四）四）SOS修复修复当当DNA损损伤伤广广泛泛难难以以继继续续复复制制时时，由由此此而而诱诱发出一系列复杂的反应。发出一系列复杂的反应。在在E. coli，各各种种与与修修复复有有关关的的基基因因，组组成成一一个个称为称为调节子调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。这这种种修修复复特特异异性性低低，对对碱碱基基的的识识别别、选选择择能能力力差差。通通过过SOS修修复复，复复制制如如能能继继续续，细细胞胞是是可可存存活活的的。然然而而DNA保保留留的的错错误误较较多多，导导致致较较广泛、长期的突变。广泛、长期的突变。
