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1、第第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法第第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法基本要求：基本要求：了了解解免免疫疫分分析析发发展展史史，掌掌握握抗抗原原、抗抗体体和和免免疫疫反反应应的的原原理理，了了解解免免疫疫分分析析法法的的分分类类，熟熟悉悉酶酶标标记记免免疫疫分分析析法法中中使使用用的的酶酶，熟熟悉悉ELISAELISA的的原原理理，掌掌握握ELISAELISA的的固固相相载载体体、包包被被与与封封闭闭、稀稀释释液液、洗洗涤涤液液、酶酶反反应应终终止止液液及及ELISAELISA法法常常用用酶酶的的底底物物系系统统，掌掌握握ELISAELISA的的酶酶联联方方法法和和试试验验方方法
2、法，熟熟悉悉ELISAELISA反反应应条条件件的的选选择择，掌掌握握ELISAELISA的的定定量量计计算算，了了解解ELISAELISA的的灵灵敏敏度度提提高高途途径径，熟熟悉悉ELISAELISA放放大大系系统统。了了解解化化学学发发光光分分析析的的原原理理，熟熟悉悉化化学学发发光光剂剂的的种种类类，熟熟悉悉化化学学发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析常常用用的的标标记记酶酶和和发发光光增增强强剂剂，熟熟悉悉生生物物发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析常常用的生物发光反应体系。用的生物发光反应体系。第第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二
3、节 光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述一、一、免疫分析免疫分析1 1、免疫分析发展史、免疫分析发展史免免疫疫分分析析（ImmunoassayImmunoassay，IAIA）是是利利用用待待测测物物质质（抗抗原原或或抗抗体体）与与其其相相对对应应物物质质（抗抗体体或或抗抗原原）之之间间专专一一特异性反应特异性反应而建立起来的一种而建立起来的一种高选择性高选择性分析方法。分析方法。免免疫疫分分析析主主要要基基于于用用抗抗体体（或或抗抗原原）作作为为选选择择性性化化学学试剂以分析试剂以分析测定抗原测定抗原（或
4、抗体）及（或抗体）及半抗原半抗原。宋代宋代 人工痘苗人工痘苗预防烈性传染病天花预防烈性传染病天花19711971年年 第第一一届届国国际际免免疫疫学学会会议议 将将免免疫疫学学与与微微生生物物学分开发展成一门独立的学科。学分开发展成一门独立的学科。“免免疫疫（immunityimmunity）”一一词词源源于于 “immunitasimmunitas”，原原意是免除税赋和差役。意是免除税赋和差役。研究早期免疫学多集中在研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力抗体抗感染能力研究。研究。2020世世纪纪中中期期以以后后，人人们们逐逐渐渐开开始始对对各各种种抗抗原原、微微生生物物的的作作用用进进行行研研
5、究究，发发展展出出基基础础免免疫疫学学、临临床床免免疫疫学学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。免疫学检测、医学免疫学等多个分支。现现代代免免疫疫学学将将“免免疫疫”定定义义为为：机机体体对对“自自己己”和和“异异己己”识识别别、应应答答过过程程中中所所产产生生的的生生物物学学效效应应的的总总和和，正常情况下是正常情况下是维持内环境稳定维持内环境稳定的一种生理性功能。的一种生理性功能。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2 2、抗原、抗体与免疫反应、抗原、抗体与免疫反应抗原抗原是能够引起免疫反应的分子。是能够引起免疫反应的分子。免免疫疫原原性性（immunogenicityimmun
6、ogenicity）指指诱诱导导刺刺激激免免疫疫系系统统产产生抗体或致敏淋巴细胞的能力生抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免疫原性的物质称为具有免疫原性的物质称为免疫原免疫原（immunogenimmunogen）。免免 疫疫 反反 应应 原原 性性 （ immunoreactivityimmunoreactivity） 或或 抗抗 原原 性性（antigenicityantigenicity），指指能能与与相相应应抗抗体体或或致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。发生特异性结合，引起免疫反应的性能。具具备备上上述述两两种种特特性性的的物物质质为为完完全全抗抗原原，仅仅具具有
7、有免免疫疫反反应性的物质被称为应性的物质被称为半抗原半抗原（haptenhapten）。）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述抗体抗体是能与抗原发生特异性结合的是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。所所有有的的抗抗体体都都是是免免疫疫球球蛋蛋白白，但但并并非非所所有有的的免免疫疫球球蛋蛋白都是抗体白都是抗体。例例如如无无免免疫疫活活性性的的免免疫疫球球蛋蛋白白（如如骨骨髓髓瘤瘤蛋蛋白白）就就不不是抗体，是抗体，尽管尽管其结构与抗体相似。其结构与抗体相似。抗抗体体主主要要存存在在于于血血清清内内，但但在在其其他他体体液液及及外外分分泌泌液液中中也有存在。也有存在。抗抗原原抗
8、抗体体分分子子之之间间存存在在着着结结构构互互补补性性和和亲亲和和性性，使使得得抗抗原原与与相相应应抗抗体体之之间间极极易易发发生生结结合合反反应应，这这种种反反应应具具有有高特异性高特异性（即专一性即专一性）和）和可逆性可逆性。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述抗原、抗体发生如下免疫反应：抗原、抗体发生如下免疫反应：Ag+Ab Ag-AbAg+Ab Ag-Ab该该免免疫疫反反应应遵遵循循可可逆逆生生物物大大分分子子相相互互作作用用的的热热动动力力学学基本原理，其反应式为基本原理，其反应式为式式中中：AbAb为为游游离离的的抗抗体体结结合合位位点点的的浓浓度度；AgAg为为游游离离
9、的的抗抗原原结结合合位位点点的的浓浓度度；Ab-AgAb-Ag为为抗抗原原- -抗抗体体复复合合物物的的浓浓度度；k k1 1为为正正反反应应速速率率常常数数；k k2 2为为负负反反应应速速率率常常数；数；K K为为反应平衡常数反应平衡常数（亲和常数亲和常数）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述这这种种抗抗原原- -抗抗体体反反应应既既可可发发生生于于体体内内（in in vivovivo），也也可发生于体外（可发生于体外（in vitroin vitro）。）。抗抗体体主主要要存存在在于于血血清清中中，在在抗抗原原、抗抗体体的的检检测测中中多多采采用用血血清清做做试试验验，所所
10、以以体体外外抗抗原原- -抗抗体体反反应应也也称称为为血血清清学反应学反应（serologic reactionserologic reaction）。）。基基于于抗抗原原- -抗抗体体反反应应的的检检测测技技术术主主要要应应用用于于以以下下几几个个方面：方面：用已知抗原用已知抗原检测未知抗体检测未知抗体；用已知抗体用已知抗体检测未知抗原检测未知抗原；定性或定量定性或定量检测检测体内体内各种大分子物质各种大分子物质；用已知抗体用已知抗体检测检测某些药物、激素等各种某些药物、激素等各种半抗原半抗原物质。物质。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述二、二、酶标记免疫分析法及常用标记酶酶标记
11、免疫分析法及常用标记酶1 1、免疫分析法分类、免疫分析法分类免疫分析标记免疫分析放射免疫分析法化学发光免疫分析法电化学免疫分析法荧光免疫分析法酶联免疫分析法竞争性酶联免疫分析非竞争性酶联免疫分析均相酶联免疫分析非均相酶联免疫分析非标记免疫分析沉淀反应、凝集反应、免疫电泳、免疫扩散第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2 2、酶标记免疫分析法中使用的酶、酶标记免疫分析法中使用的酶（1 1）酶联免疫分析中使用的酶应）酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件符合下列条件：纯度高纯度高、催化反应的转化速率高、催化反应的转化速率高、专一性强专一性强；具有具有足够的足够的偶联用偶联用标记基团标记基团，
12、与抗原、抗体蛋白分子，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；偶联后仍保持较高的催化活性；使用使用稳定性稳定性和保存稳定性和保存稳定性好好；测定测定酶活性的酶活性的方法简便方法简便、灵敏灵敏、快速快速；待测待测体液中不存在体液中不存在与标记酶相同的酶；与标记酶相同的酶；第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述待测溶液中待测溶液中应该应该无底物无底物、反应抑制剂反应抑制剂和其他与酶发生和其他与酶发生反应的反应的干扰物质干扰物质；酶的来源、纯化和供应酶的来源、纯化和供应较方便较方便，价格，价格较低廉较低廉；均相酶免疫测定均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗法中使用的酶，还要
13、求当抗体与半抗原原- -酶酶结合物结合结合物结合后，酶活性表现出后，酶活性表现出抑制或激活抑制或激活。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述（2 2）酶的评价指标酶的评价指标 通常通常用用RZRZ和和酶的比活酶的比活力评价力评价标记标记酶的质量。酶的质量。RZRZ表示酶蛋白中表示酶蛋白中活性部分活性部分与与非活性部分非活性部分最大吸光度的最大吸光度的比值。比值。酶的比活酶的比活力力指在特定条件下，每指在特定条件下，每1mg1mg酶酶或或每每1ml1ml酶液所酶液所具有的酶活性单位数具有的酶活性单位数。（3 3）酶联免疫分析中的常用酶酶联免疫分析中的常用酶 下表下表列出了酶联免疫列出了酶
14、联免疫分析中的常用酶。分析中的常用酶。其中其中ECEC编号编号是是根据国际酶学委员会根据国际酶学委员会的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述酶酶来源来源EC编号编号辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶动植物动植物3.1.3.2碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛肠牛肠3.1.3.1-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶大肠杆菌大肠杆菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6过氧化氢酶过氧化氢酶肝肝1.
15、11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛红细胞牛红细胞4.2.1.1乙酰胆碱酶乙酰胆碱酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶肠系膜明串细菌肠系膜明串细菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶鸡卵白鸡卵白3.2.1.17苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶猪心线粒体猪心线粒体1.1.1.49无机焦磷酸酶无机焦磷酸酶大肠杆菌大肠杆菌3.6.1.1荧光素酶荧光素酶发光生物发光生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳动物组织哺乳动物组织2.7.1.40酶联免疫分析常用酶酶联免疫分析常用酶第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（h
16、orseradish horseradish peroxidaseperoxidase，HRPHRP）是是一一种种提提取取自自辣辣根根中中，相相对对分分子子质质量量为为44kDa44kDa的的糖糖蛋蛋白白。其其酶酶学学活活性性部部分分包包括括脱脱辅辅基基蛋蛋白白和和血血红红素素基基团团，辅辅基基亚铁血红素在亚铁血红素在403nm403nm波长呈现最大光吸收值。波长呈现最大光吸收值。HRPHRP的的纯纯度度以以RZRZ值值即即A A403nm403nm/A/A275nm275nm的的值值来来衡衡量量，高高纯纯度度HRPHRP制剂的制剂的RZ3.0RZ3.0。通通常常以以能能在在2020、pHpH
17、为为6.06.0、20s20s的的时时间间内内催催化化底底物物邻邻苯苯三三酚酚产产生生1mg1mg红红桔桔酚酚（purpurogallinpurpurogallin）作作为为HRPHRP酶酶的的1 1个活性单位。个活性单位。用于标记的用于标记的HRPHRP比活性应比活性应大于大于250U/mg250U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述碱碱性性磷磷酸酸酶酶（alkaline alkaline phosphatasephosphatase，APAP）几几乎乎存存在在于于动动物物和和人人体体的的所所有有组组织织中中，尤尤其其在在肝肝脏脏、胎胎盘盘、白白细胞、肾小管中含量高。细胞、
18、肾小管中含量高。APAP是是一一种种磷磷酸酸酯酯的的水水解解酶酶，它它能能够够催催化化磷磷酸酸单单酯酯、磷磷酸酸核核苷苷及及6-6-磷磷酸酸糖糖类类等等的的水水解解，在在释释放放磷磷酸酸盐盐的的同同时时产生有色的或荧光的产物。产生有色的或荧光的产物。碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的分分子子质质量量为为8080100kDa100kDa，最最适适pHpH为为8.08.010.010.0，随酶源和底物的不同而变化。，随酶源和底物的不同而变化。APAP活性的测定以活性的测定以对硝基磷酸苯酯对硝基磷酸苯酯（PNPPNP）作为底物。）作为底物。用作标记的用作标记的APAP比活比活力力应应大于大于1000U/mg1
19、000U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶（glucose glucose oxidaseoxidase，GODGOD）即即-D-D-葡葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生。它它催催化化O O2 2和和-D-D-葡葡萄萄糖糖的的反反应应形形成成H H2 2O O2 2和和D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。其其反反应应最最适适pHpH范范围围为为4.04.07.07.0，pH5.5pH5.5时时，反反应应速速率率最最大大。葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶对对-D-D-
20、葡葡萄萄糖糖的的-异异头头碳碳有有高高度专一性度专一性。葡萄糖氧化酶的比活葡萄糖氧化酶的比活力力至少为至少为20U/mg20U/mg。葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化酶在44下可稳定存在下可稳定存在6 61212个月。个月。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述-D-D-半半乳乳糖糖苷苷酶酶（-D-galactosidase-D-galactosidase，GalGal）即即乳乳糖糖酶酶（-lactase-lactase），广广泛泛存存在在于于植植物物、动动物物器器官官、细菌、酵母和真菌中。细菌、酵母和真菌中。当当GalGal催催化化水水解解-D-D-半半乳乳糖糖苷苷时时，若若得得到到的的半半
21、乳乳糖糖残残基基转转移移到到水水分分子子受受体体，称称为为水水解解；若若受受体体是是糖糖或或醇醇时时，称为称为转半乳糖苷转半乳糖苷。GalGal催催化化-D-D-半半乳乳糖糖苷苷水水解解反反应应的的最最适适pHpH为为7.57.5，转转化化效效率率很很高高，且且比比HRPHRP易易于于标标记记，背背景景值值低低，稳稳定定性性好。好。GalGal比活比活力力应不少于应不少于30U/mg30U/mg，55能保存能保存1 12 2年。年。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法一、一、光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析1 1、酶酶联联免免疫疫吸吸
22、附附分分析析（enzyme-linked enzyme-linked immunosorbent immunosorbent assayassay，ELISAELISA）原理）原理使抗原或抗体使抗原或抗体结合结合到某种到某种固相载体表面固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原酶标抗原或或抗体抗体； 在在测测定定时时，使使受受检检标标本本和和酶酶标标抗抗原原或或抗抗体体按按不不同同的的步步骤骤与固相抗原与固相抗原或固相抗体起或固相抗体起反应反应； 用用洗洗涤涤的的方方法法使使固固相相载载体体上上形形成成的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物与与其其他他物物质质分分开开，结
23、结合合在在固固相相载载体体上上的的酶酶量量与与标标本本中中受受检物质的量成检物质的量成一定的一定的比例比例； 加加入入酶酶反反应应底底物物，底底物物被被酶酶催催化化为为有有色色产产物物，产产物物量量与与标本中标本中受检物受检物的的量相关量相关，用分光光度法进行定量。，用分光光度法进行定量。* *A Ag g是是酶酶标标志志抗抗原原，A Ag g是是未未标标志志抗抗原原，A Ab b是是特特异异性性抗抗体体，(F)(F)表示游离型的表示游离型的* *A Ag g，(B)(B)表示结合型的表示结合型的* *A Ag g- -A Ab b。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、E
24、LISAELISA的固相载体的固相载体良良好好的的ELISAELISA板板应应该该是是吸吸附附性性能能好好，空空白白值值低低，孔孔底底透明度高透明度高，各板之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间性能相近性能相近。最常用的是最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。聚聚氯氯乙乙烯烯对对蛋蛋白白质质的的吸吸附附性性能能比比聚聚苯苯乙乙烯烯高高，但但空空白白值也略高。值也略高。ELISAELISA载体的形式有载体的形式有小试管小试管、小珠小珠和和微量反应板微量反应板。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法3 3、固相载体的包被与封闭、固相载体的包被与封闭（1 1）包包被被（coatingcoa
25、ting）指指将将抗抗原原或或抗抗体体连连接接到到固固相相载载体体上的过程。上的过程。以以聚聚苯苯乙乙烯烯微微量量反反应应板板为为例例，通通常常先先将将抗抗原原或或抗抗体体溶溶于于pH pH 9.69.6的的碳碳酸酸盐盐缓缓冲冲液液（或或pH pH 7.27.2的的磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，pH pH 7 78 8的的Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液）中中，加加满满反反应应孔孔，置置44过夜过夜，洗涤即可。，洗涤即可。包包被被浓浓度度随随载载体体和和包包被被物物的的性性质质可可有有很很大大的的变变化化，每每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。批材料需通过实验与酶结合物的浓度协
26、调选定。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被浓度为0.10.120g/ml20g/ml。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）封封闭闭（blockingblocking）指指继继包包被被之之后后用用高高浓浓度度的的无无关关蛋白质蛋白质溶液溶液再包被再包被的过程。的过程。封封闭闭就就是是让让大大量量不不相相关关的的蛋蛋白白质质充充填填这这些些空空隙隙，从从而而排斥排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的所有的ELISAELISA固相载体均需封闭固相载体均需封闭。常常用用封封闭闭剂剂有有0.05%0.05%0.5% 0.5% B
27、SABSA；10%10%小小牛牛血血清清或或1%1%明明胶胶；脱脂奶粉脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（，比较价廉，可高浓度使用（5%5%）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法4 4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1 1）稀释液稀释液用于稀释酶标抗体及标本。用于稀释酶标抗体及标本。常常用用中中性性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液，其其中中含含有有无无关关高高浓浓度度蛋蛋白白（如如1010动动物物血血清清、1 1BSABSA（牛牛血血清清白白蛋蛋白白）、1 1明明胶胶等等）和和非非离离子子型型表表面面活活性性剂剂（如如
28、0.050.05Tween Tween 2020或或TritonX-100TritonX-100等）。等）。（2 2）洗洗涤涤液液一一般般与与稀稀释释液液相相同同，常常用用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲液。冲液。四四种种常常用用的的抗抗体体稀稀释释液液和和三三种种常常用用的的洗洗涤涤液液列列于于表表7-7-2 2。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法编编号号吐温吐温20/%组成组成稀稀释释液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/
29、L4PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗涤涤液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl缓冲液缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液常用的抗体稀释液和洗涤液第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）酶反应终止液）酶反应终止液 辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（HRPHRP）反反应应终终止止液液为为2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L H H2 2SOSO4 4（HRPHRP在酸性条件下丧失酶活
30、性）。在酸性条件下丧失酶活性）。很很多多ELISAELISA试试剂剂采采用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶（APAP）作作为为标标记记酶酶，用用3mol/L NaOH3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一终止酶反应后，黄色可稳定一段段时间。时间。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法5 5、ELISAELISA法常用酶的底物系统法常用酶的底物系统ELISAELISA法法对底物的要求对底物的要求：价廉易得价廉易得、安全安全；显色性显色性和和稳定性稳定性好好；底物底物本身最好本身最好为为无色无色物质物质；终止终止酶催化反应后酶催化反应后，底物底物不应再不应再继续地继续地自发性变性自发性
31、变性；其最终其最终产物可溶产物可溶、易于测定易于测定及及光吸收值高光吸收值高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（1 1）辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶的的底底物物系系统统 常常见见底底物物有有邻邻苯苯二二胺胺（OPDOPD，产产物物橙橙红红色色，测测定定波波长长492nm492nm）、5-5-氨氨基基水水杨杨酸酸 （ 5-AS5-AS， 产产 物物 橙橙 色色 ， 测测 定定 波波 长长 550nm550nm） 、3,3,5,5-3,3,5,5-四四甲甲基基联联苯苯胺胺（TMBTMB，产产物物红红色色，测测定定波波长长450nm450nm）、2,2-2,2-连连氮氮- -二二（
32、3-3-乙乙基基苯苯并并噻噻唑唑啉啉- -6-6-磺酸盐磺酸盐）（）（ABTSABTS）等。）等。ABTSABTS的的反应曲线不好反应曲线不好。OPDOPD溶溶液液具具有有光光敏敏性性，相相对对来来说说不不稳稳定定，且且具具有有诱诱变变特性特性。TMBTMB的的背景值低背景值低，溶液，溶液稳定稳定，没有诱变没有诱变特性。特性。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的底底物物系系统统 常常用用的的底底物物为为对对硝硝基基磷磷酸酸苯苯酯酯（PNPPNP），水水解解的的产产物物为为黄黄色色的的对对硝硝基基苯苯酚酚，可可在在405nm405nm处处检检测测其
33、其吸吸光光度度的的变变化化，该该底底物物的的转转化化效效率高，线性关系好率高，线性关系好。用用酚酚酞酞磷磷酸酸酯酯为为底底物物，水水解解生生成成的的酚酚酞酞在在碱碱性性条条件件下下呈红色，可在呈红色，可在530nm530nm处光度法测定处光度法测定。此外还可以此外还可以百里酚酞单磷酸酯百里酚酞单磷酸酯等等为为底物。底物。 第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）-D-D-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的底底物物系系统统 常常见见底底物物有有邻邻硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（ONPGONPG），其其水水解解的的产产物物邻邻硝硝基基苯苯酚在酚在405nm405nm处具有最大吸
34、光度值处具有最大吸光度值。其其他他的的底底物物有有对对硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（PNPGPNPG）、苯苯基基-D-D-半半乳乳糖糖苷苷、氯氯酚酚红红-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（CPRGCPRG）、9-9-羟基羟基-3-3-异吩噁唑酮异吩噁唑酮-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（RGRG）等。）等。（4 4）青青霉霉素素酶酶（PNCPNC）的的底底物物系系统统 常常用用底底物物有有溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝（BTBBTB）、青青霉霉酮酮酸酸还还原原淀淀粉粉- -碘碘复复合合物物（SICSIC）、溴溴甲甲酚酚紫紫（BCPBCP）和和溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝（2 21 1）等。等。第二节第二节
35、酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法二、二、ELISAELISA酶联方法和试验方法酶联方法和试验方法1 1、ELISAELISA酶联方法酶联方法ELISAELISA酶联方法主要有两种，即酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法戊二醛交联法和和过碘过碘酸盐氧化法酸盐氧化法。（1 1）戊二醛交联法戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，戊二醛是一种双功能团试剂，它可以它可以联结具有氨基的酶和蛋白质联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有戊二醛交联法有一步法一步法、两步法两步法两种。两种。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-2 戊二醛一步法反应原理戊二醛一步法反应原理一一步步法法 将
36、将戊戊二二醛醛直直接接加加入入酶酶与与抗抗体体的的混混合合物物中中，反反应应后后即即得得酶酶标标记记抗体。抗体。该该法法操操作作简简便便、有有效效，重复性好重复性好。缺缺点点是是交交联联反反应应是是随随机机的的，酶酶与与酶酶、抗抗体体与与抗抗体之间有可能交联。体之间有可能交联。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-3 戊二醛二步法反应原理戊二醛二步法反应原理两两步步法法 先先将将酶酶与与戊戊二二醛醛作作用用，透透析析除除去去多多余余的的戊戊二二醛醛后后，再再与与抗抗体体作作用用而而形形成成酶酶标标抗抗体体；或或先先将将抗抗体体与与戊戊二二醛醛作作用用，再与酶联结。再与酶联结
37、。两两步步法法的的产产物物中中绝绝大大部部分分的的酶酶与与蛋蛋白白质质是是以以1:1的的比比例例结结合合的的，有有助助于于本底的改善本底的改善。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）过碘酸盐氧化法）过碘酸盐氧化法 本法只适用于本法只适用于含糖量较高含糖量较高的酶。的酶。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）的标记常用此法。）的标记常用此法。反反应应时时，过过碘碘酸酸钠钠将将HRPHRP分分子子表表面面的的多多糖糖氧氧化化为为活活泼泼的的醛基醛基，可与蛋白质上的氨基形成，可与蛋白质上的氨基形成SchiffSchiff氏碱氏碱而结合。而结合。图图7-4 7-4 过碘酸盐
38、氧化法过碘酸盐氧化法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA试验方法试验方法ELISAELISA法中有三个必要试剂：法中有三个必要试剂：固相抗原固相抗原或抗体；或抗体；酶标记抗原酶标记抗原或抗体；或抗体；酶反应底物酶反应底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。如如双抗体夹心法双抗体夹心法、间接法间接法、竞争法竞争法、异种动物抗体双异种动物抗体双夹心法夹心法、抗酶抗体法抗酶抗体法、竞争性抑制法竞争性抑制法、双夹心法双夹心法和和抗抗原直接包
39、被法原直接包被法等方法。等方法。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（1 1）双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwichdouble antibody sandwich，DAS-DAS-ELISAELISA）由）由ClarkClark和和AdamsAdams于于19771977年建立，是最经典的年建立，是最经典的ELISAELISA检测法检测法。该法的该法的灵敏度高灵敏度高，特异性强特异性强，但提纯免疫球蛋白和制，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求备酶标记物要求技术性强技术性强，成本较高成本较高。该法该法只适用于二价或二价以
40、上较大分子抗原的检出和只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。，而不能用于半抗原等小分子的测定。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-5 双抗体夹心法双抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）间接法间接法间间接接法法（indirect indirect ELISAELISA）是是最最常常用用的的ELISAELISA检检测测方方法法，其其原原理理是是利利用用酶酶标标记记的的抗抗体体和和已已与与固固相相抗抗原原结结合合的受检的受检抗体抗体相结合。相结合。该该法法只只要要更更换换不不同同的的固固相相
41、抗抗原原，就就可可以以用用一一种种酶酶标标抗抗抗体检测抗体检测各种与抗原相应的抗体。各种与抗原相应的抗体。该该方方法法不不必必为为每每个个待待测测抗抗体体（或或抗抗原原）制制备备特特异异性性的的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化简化了实验。了实验。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-6 间接法间接法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）竞争法竞争法竞竞争争法法（competing competing ELISAELISA）是是利利用用待待测测抗抗原原和和酶酶标标抗抗原原与与特特异异性性抗抗体体竞竞争争结结合合，或或待
42、待测测抗抗体体和和酶酶标标抗抗体体与与特特异异性性抗抗原原竞竞争争结结合合而而进进行行测测定定的的一一种种方方法法（图图7-7-7 7）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-7 竞争法竞争法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（4 4）异种动物抗体双夹心法异种动物抗体双夹心法异异种种动动物物抗抗体体双双夹夹心心法法（图图7-87-8），又又称称间间接接双双抗抗体体夹夹心心法法（indirect indirect DAS-ELISADAS-ELISA）或或三三抗抗体体夹夹心心法法（triple antibodies sandwichtriple antib
43、odies sandwich，TAS-ELISATAS-ELISA）。）。此此法法可可用用通通用用的的酶酶标标记记抗抗体体检检验验多多种种病病毒毒，它它不不仅仅免免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-8 异种动物抗体夹心法异种动物抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（5 5）抗酶抗体法抗酶抗体法抗抗酶酶抗抗体体法法（图图7-97-9）是是利利用用免免疫疫学学反反应应而而不不是是用用化化学学交交联联反反应应来来制制备备酶酶结结合合物物，常常用用HRPHRP为为标标记记酶酶作作
44、为为抗原抗原免疫动物制备抗免疫动物制备抗HRPHRP抗体抗体。可可用用一一种种动动物物（如如兔兔）制制备备特特异异性性抗抗体体（第第一一抗抗体体）和和抗抗酶酶抗抗体体（第第三三抗抗体体），再再用用另另一一种种动动物物（如如羊羊）制备制备抗第一种动物抗第一种动物（兔）（兔）IgGIgG的抗体的抗体（第二抗体）。（第二抗体）。让让这这种种抗抗IgGIgG的的第第二二抗抗体体把把第第一一抗抗体体（兔兔IgGIgG）和和抗抗酶酶抗体抗体（也为兔（也为兔IgGIgG）通过免疫学反应连接起来。）通过免疫学反应连接起来。最最后后让让酶酶与与抗抗酶酶抗抗体体结结合合，通通过过对对底底物物的的作作用用而而揭揭示
45、示在固相载体上待测抗原的存在。在固相载体上待测抗原的存在。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法优优点点:HRP:HRP通通过过免免疫疫学学反反应应与与抗抗体体结结合合，避避免免了了用用化化学学方方法法交交联联时时抗抗体体活活性性的的改改变变，也也避避免免了了HRPHRP与与其其他他蛋蛋白白质质分分子子结结合合，防防止止标标记记抗抗体体和和游游离离的的未未标标记记抗抗体体之之间的间的竞争竞争，提高了标记抗体的质量提高了标记抗体的质量。在在纯纯化化化化学学交交联联反反应应制制备备的的酶酶结结合合物物的的过过程程中中，除除去去未未标标记记抗抗体体比比较较困困难难，而而且且该该法法仅仅在
46、在制制备备抗抗酶酶抗抗体体时时用用少少量量纯纯HRPHRP作作抗抗原原，所所以以用用较较粗粗制制的的HRPHRP与与抗抗酶酶抗抗体体形形成成免免疫疫复复合合物物，并并不不影影响响其其质质量量，这这大大大大节节约约了了价价格较昂贵的精制格较昂贵的精制HRPHRP。因因为为制制备备抗抗酶酶抗抗体体必必须须在在动动物物中中进进行行，故故抗抗酶酶抗抗体体法法多多适用于检测动物中的抗体适用于检测动物中的抗体。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-9 抗酶抗体法抗酶抗体法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法三三、ELISA反反应应条条件件的的选择选择1 1、酶标抗体浓度的
47、选择、酶标抗体浓度的选择先先用用200200L L IgGIgG（100 100 mg/mlmg/ml）包包被被小小孔孔，再再将将酶酶标标记记抗抗体体球球蛋蛋白白系系列列稀稀释释并并加加入入小小孔孔中中，洗洗涤涤后后，加加底底物物反反应应，终止终止后后测定测定吸光度。吸光度。选选择择吸吸光光度度为为1 1的的稀稀释释度度作作为为酶酶标标抗抗体体最最适适浓浓度。度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗体浓度的选择第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、包被浓度的选择、包被浓度的选择当包被抗原的当包被抗原的浓度较浓度较低时低时，包被量，包被量随随抗原抗原浓度的增加浓度的增加而而
48、增大增大；当包被抗原当包被抗原达到一定达到一定浓度后浓度后，包被量为定包被量为定值值，不再随抗原浓度，不再随抗原浓度的增加而增大的增加而增大。此浓度称为此浓度称为抗原的饱抗原的饱和包被浓度和包被浓度。图图7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反应的关系反应的关系 第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法表表7-3 SM-EDA-GA7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对包被法中链霉素包被质量浓度对ELISAELISA实验误差的影响实验误差的影响包被质量浓度（包被质量浓度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA测定结果测定结果（A A492492SDSD）（）
49、（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281*1*1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法3 3、酶、酶- -底物反应时间的选择底物反应时间的选择抗抗原原与与抗抗体体、抗抗体体与与酶酶标标抗抗体体反反应应一一般般在在3737反反应应2 23h3h达到高峰。达到高峰。时时间间太太短短，敏敏感感性性下下降降，时时间间太太长长，吸吸附附的的抗抗原原或或复复合物（在这个温度下）可能脱落。合物（在这个温度下）可
50、能脱落。酶酶- -底底物物反反应应时时间间一一般般采采用用15min15min、30min30min或或45min45min，也也可可以以标标准准阳阳性性血血清清为为准准，随随时时测测定定其其ODOD值值，当当达达到到规规定的定的ODOD值时，即终止反应值时，即终止反应。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法四、四、ELISAELISA的定量计算与灵敏度的定量计算与灵敏度1 1、ELISAELISA的定量计算的定量计算一一般般采采用用分分光光光光度度计计测测定定结结合合物物中中的的酶酶量量和和抗抗体体蛋蛋白白（IgGIgG）量，酶量和）量，酶量和IgGIgG计算方法如下。计算方法如
51、下。其其中中，0.40.4表表示示酶酶的的A A403nm403nm值值为为1 1时时，酶酶量量为为0.4mg/ml0.4mg/ml；0.420.42表表示示酶酶的的A A403nm403nm值值为为1 1时时，其其相相应应A A280nm280nm值值为为0.420.42；0.620.62表表示示在在A A280nm280nm值值为为1 1时时，IgGIgG量量为为0.62mg/ml0.62mg/ml；0.940.94表示酶、戊二醛结合后，表示酶、戊二醛结合后，A A280nm280nm增加约增加约6 6。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方
52、法酶结合物中结合的酶量、酶结合率计算方法：以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算以采用过碘酸钠氧化法进行酶联为例，摩尔比值计算方法方法：酶量酶量为为1mg/ml1mg/ml，摩尔比值摩尔比值为为1.51.52.02.0，酶结合率酶结合率在在30%30%以上以上时，可获得较好的时，可获得较好的ELISAELISA分析结果。分析结果。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA的灵敏度与的灵敏度与ELISAELISA放大系统放大系统（1 1）ELISAELISA的的灵灵敏敏度度 ELISAELISA的的检检出出限限已已经经达达到到1010-8-81010-
53、12-12g g，但对某些测定仍需更高的灵敏度。，但对某些测定仍需更高的灵敏度。传传统统ELISAELISA中中显显色色剂剂发发色色团团的的吸吸光光度度是是限限制制ELISAELISA灵灵敏敏度的主要因素度的主要因素。改改用用荧荧光光标标记记或或其其他他化化学学发发光光物物标标记记抗抗体体替替代代酶酶标标记记抗体可以提高灵敏度。抗体可以提高灵敏度。改改变变传传统统ELISAELISA的的操操作作程程序序也也可可以以提提高高灵灵敏敏度度，如如SIMITSIMIT技术。技术。采用放大系统采用放大系统是提高是提高ELISAELISA灵敏度的灵敏度的主要途径主要途径。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶
54、联免疫吸附分析法（2 2）ELISAELISA放放大大系系统统 生生物物素素- -亲亲和和素素放放大大系系统统可可增增加抗体（或抗原）的标记率。加抗体（或抗原）的标记率。生生物物素素与与亲亲和和素素结结合合速速率率较较快快且且结结合合物物的的稳稳定定性性高高（K K=10=101515），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。），不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。生生物物素素对对抗抗体体和和酶酶的的标标记记率率高高（1010个个生生物物素素分分子子/ /抗抗体体分分子子），且且生生物物素素分分子子易易于于活活化化，标标记记后后不不影影响响抗抗体和酶的活性。体和酶的活性。每每个个亲亲和和素素分分子子能能
55、结结合合4 4个个生生物物素素，因因而而可可偶偶联联更更多多的联结生物素的酶分子，从而提高的联结生物素的酶分子，从而提高ELISAELISA的敏感性。的敏感性。生生物物素素- -亲亲和和素素标标记记体体系系有有灵灵活活多多变变的的运运用用方方式式，可可以适应不同的分析设计。以适应不同的分析设计。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法微微粒粒放放大大。用用适适当当的的微微粒粒代代替替酶酶- -抗抗体体结结合合物物也也可可以以获得放大效果。获得放大效果。每每个个微微粒粒表表面面可可以以同同时时结结合合大大量量记记酶酶和和抗抗体体分分子子。在在包包含含微微粒粒放放大大的的夹夹心心ELIS
56、AELISA法法中中，微微粒粒通通过过结结合合于于其其上上的的第第二二抗抗体体结结合合于于抗抗原原。微微粒粒上上又又结结合合着着标标记记酶酶，其其数数量量远远比比第第二二抗抗体体能能结结合合的的标标记记酶酶多多，因因此此得得以以放放大。大。例例如如，微微颗颗粒粒放放大大系系统统用用微微颗颗粒粒硅硅胶胶（直直径径约约40nm40nm）作作为为中中间间体体连连接接酶酶和和抗抗体体，避避免免酶酶和和抗抗体体直直接接连连接接。酶酶微微颗颗粒粒硅硅胶胶可可连连接接上上千千个个酶酶分分子子，可可使使体体系系增增敏敏，已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。已用于测定甲胎蛋白，灵敏度放大两个数量级。第二节
57、第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法五、五、ELISA法的应用法的应用酶酶免免疫疫测测定定具具有有高高度度的的特特异异性性和和敏敏感感性性，几几乎乎所所有有的的可可溶溶性性抗抗原原- -抗抗体体系系统统均均可可用用以以检检测测，它它的的最最小小可可测测值达值达ngng甚至甚至pgpg水平。水平。酶酶免免疫疫测测定定在在各各应应用用领领域域中中的的普普及及，应应归归功功于于商商品品试试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。目前应用较广的酶免疫检测项目一般有试剂盒出售。完完整整的的ELISAELISA试试剂剂盒盒应
58、应包包含含包包被被好好的的固固相相载载体体、酶酶结结合物合物、底物底物和和各种浓缩的稀释液各种浓缩的稀释液、缓冲液缓冲液等。等。这这些些试试剂剂在在冰冰箱箱中中可可保保存存半半年年以以上上，因因此此实实验验室室中中只只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法六、六、微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定微量致敏性杂质青霉噻唑蛋白的测定基基因因工工程程药药品品在在生生产产过过程程中中为为防防止止污污染染，在在细细胞胞培培养养或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。或发酵过程中常需加入一定量的青霉素。青青霉霉素素在在水水溶溶液液中中很很容
59、容易易和和蛋蛋白白质质结结合合形形成成过过敏敏性性杂杂质质青青霉霉噻噻唑唑（benzyl benzyl penicilloylpenicilloyl，BPOBPO）蛋蛋白白，为为确确保保基基因因工工程程药药品品的的产产品品质质量量，可可以以用用ELISAELISA对对基基因因工工程程药药品品中中是是否否残残存存有有青青霉霉噻噻唑唑蛋蛋白白进进行行检检测测，其其对对样品中结合青霉素的样品中结合青霉素的绝对检出量小于绝对检出量小于0.3100.310-6-6。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法其实验步骤如下：其实验步骤如下：（1 1）包包被被：用用碳碳酸酸缓缓冲冲液液（0.1mol
60、/L0.1mol/L，pH pH 9.69.6）直直接接包被包被待测抗原待测抗原，200L/200L/孔；孔；包包被被BPOBPO4 4-CY-CY作作为为阳阳性性对对照照，并并设设有有包包被被抗抗原原不不加加抗抗BPOBPO血清血清和和不包被抗原但加抗不包被抗原但加抗BPOBPO血清血清两组两组阴性对照阴性对照；此此外外，实实验验中中还还设设有有待待测测抗抗原原-BSA-BSA抗抗血血清清相相互互作作用用组组作为作为阴性血清阴性血清对照；对照；44冰箱过夜。冰箱过夜。（2 2）用用洗洗涤涤液液（BPS BPS 0.01mol/L0.01mol/L，pH pH 7.27.2）洗洗涤涤三三次次，
61、每次每次3min3min。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）与与特特异异性性抗抗体体反反应应：在在经经洗洗涤涤好好的的酶酶标标板板中中加加入入稀稀释释至至一一定定滴滴度度的的抗抗BPOBPO血血清清或或抗抗BPOBPO单单克克隆隆抗抗体体，200L/200L/孔，孔，3737保温保温2h2h。（4 4）洗涤洗涤三次。三次。（5 5）与与酶酶联联抗抗抗抗体体反反应应：再再加加入入1 15050稀稀释释的的GAR-IgG-GAR-IgG-HRPHRP 200L/ 200L/孔，孔，3737保温保温1h1h。（6 6）洗涤洗涤三次。三次。（7 7）显色显色：加入：加入OPD
62、OPD底物液，底物液，200L/200L/孔，孔，3737显色。显色。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（8 8）用用1mol/L1mol/L的的硫硫酸酸终终止止反反应应，50L/50L/孔孔，用用酶酶标标仪仪测定其在测定其在492nm492nm波长处的光吸收值。波长处的光吸收值。（9 9）结结果果判判断断：当当阳阳性性孔孔呈呈阳阳性性，阴阴性性血血清清呈呈阴阴性性时时实验成立实验成立。若若当当待待测测抗抗原原的的测测定定结结果果大大于于阴阴性性对对照照均均值值（X X）与与其其2 2倍标准差（倍标准差（SDSD）之和（）之和（X+2SDX+2SD），判为），判为阳性阳性；若小
63、于若小于X+SDX+SD，判为，判为阴性阴性；若在若在X+2SDX+2SD与与X+SDX+SD之间需要调整试验条件之间需要调整试验条件重新测试重新测试。ELISAELISA测测定定125125SerIL-2SerIL-2中中青青霉霉噻噻唑唑蛋蛋白白的的结结果果如如下下（见见表表7-47-4）：）：第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法表表7-4 ELISA实验测定实验测定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白中青霉噻唑蛋白第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法包包被被样样品品稀稀释释至至约约210210-6-6mgmg（110110-16-16molmol）/ /孔孔时时
64、，ELISAELISA反反应应仍仍为为阳阳性性，提提示示样样品品中中BPOBPO的的量量大大于于110110- -5 5molmol，即即待待测测样样品品中中含含有有结结合合青青霉霉素素的的绝绝对对含含量量为为千千分之一左右。分之一左右。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法一、一、化学发光分析化学发光分析1 1、化学发光（、化学发光（chemiluminescencechemiluminescence，CLCL）一些物质在进行化学反应时，一些物质在进行化学反应时，吸收吸收了化学反应过程中了化学反应过程中产生的产生的化学能化学能，使得分子，使得分子外层电子外层电子激发到激发到激发态
65、激发态，生，生成激发态产物。当电子从激发态的最低振动能级成激发态产物。当电子从激发态的最低振动能级回到回到基态基态的各个振动能级时，以的各个振动能级时，以光辐射光辐射的形式释放能量，的形式释放能量，这个发光过程称为这个发光过程称为化学发光化学发光，其反应过程如下：，其反应过程如下： 发光效率发光效率表示一个化学发光分子的量子产率表示一个化学发光分子的量子产率，指，指每摩每摩尔反应物尔反应物辐射出光子的量。辐射出光子的量。第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 2 2、化学发光分析、化学发光分析化学发光分析化学发光分析是根据化学反应是根据化学反应产生的光辐射产生的光辐射确定确定物质物质含
66、量含量的一种痕量分析方法。的一种痕量分析方法。化学发光免疫分析化学发光免疫分析（CLIACLIA）是将）是将化学发光反应化学发光反应与与免疫免疫反应反应相结合而对相结合而对抗体抗体、抗原抗原或或半抗原半抗原进行测定的一种进行测定的一种免疫分析方法。免疫分析方法。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析3 3、化学发光剂、化学发光剂用作标记的化学发光剂应用作标记的化学发光剂应符合以下条件符合以下条件：能能参与化学发光参与化学发光反应；反应；与抗原或抗体偶联后能与抗原或抗体偶联后能形成稳定结合物形成稳定结合物；偶联后仍偶联后仍保留高的量子产率保留高的量子产率和和反应动力反应动力；不不改改变
67、变或或极极少少改改变变被被标标记记物物的的物物理理化化学学特特性性，特特别别是是免疫活性。免疫活性。常常用用的的化化学学发发光光剂剂有有吖吖啶啶酯酯类类化化合合物物、氨氨基基苯苯二二酰酰肼肼类类化化合合物物、咪咪唑唑类类化化合合物物、苯苯酚酚类类化化合合物物、芳芳基基草草酸酸酯类酯类化合物化合物等等。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（1 1）吖吖啶啶酯酯类类化化合合物物 吖吖啶啶酯酯是是三三环环有有机机化化合合物物，很很容易氧化。容易氧化。当当其其在在碱碱性性介介质质中中氧氧化化时时，经经历历共共价价键键的的断断裂裂，产产生生二二氧氧酮酮的的中中间间体体，然然后后形形成成电电激
68、激发发的的N-N-甲甲基基吖吖啶啶酮酮。当它回复到基态时在当它回复到基态时在430nm430nm处释放出光子。处释放出光子。在在加加入入H H2 2O O2 2及及随随后后加加入入NaOHNaOH调调节节至至所所需需pHpH之之前前维维持持一一低低pHpH以实现以实现最佳氧化最佳氧化过程，可加速其氧化反应。过程，可加速其氧化反应。吖啶酯氧化反应如图吖啶酯氧化反应如图7-127-12所示。所示。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-12 吖啶酯氧化反应过程吖啶酯氧化反应过程第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析吖吖啶啶酯酯类类化化学学发发光光剂剂的的典典型型代代表表是
69、是光光泽泽精精（N N, ,N N-二二甲基吖啶硝酸酯甲基吖啶硝酸酯）。）。它它在在碱碱性性条条件件下下，与与H H2 2O O2 2等等过过氧氧化化物物作作用用形形成成发发光光体体激发态激发态N N- -甲基吖啶酮。甲基吖啶酮。能能促促使使光光泽泽精精激激发发的的物物质质还还有有丙丙酮酮、次次黄黄嘌嘌呤呤、黄黄嘌嘌呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸呤氧化酶、羟胺及抗坏血酸等。等。光泽精的氧化反应如图光泽精的氧化反应如图7-137-13所示。所示。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-13 光泽精的氧化反应光泽精的氧化反应第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析吖啶酯类化合物作
70、为化学发光标记物有显著的吖啶酯类化合物作为化学发光标记物有显著的优点优点：氧化反应不需催化剂氧化反应不需催化剂，只需要在，只需要在碱性环境碱性环境中就可以进中就可以进行，发光行，发光反应快速反应快速，在，在1s1s内光子散射达到高峰内光子散射达到高峰，整个，整个过程在过程在2s2s内完成，可充分计数，内完成，可充分计数，背景噪声低背景噪声低。这类化合物与被标记物的这类化合物与被标记物的结合发生在分子一定部位结合发生在分子一定部位，在氧化反应过程中，结合物被分解，在氧化反应过程中，结合物被分解，吖啶酯分子从发吖啶酯分子从发光的部分断裂并分离下来光的部分断裂并分离下来，所以吖啶酯的发光，所以吖啶酯
71、的发光不受抑不受抑制制，敏感度不受标记反应的影响，敏感度不受标记反应的影响，试剂稳定性好试剂稳定性好。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（2 2）氨氨基基苯苯二二酰酰肼肼类类化化合合物物 鲁鲁米米诺诺（5-5-氨氨基基-2,3-2,3-二二氢氢-1,4-1,4-酞酞嗪嗪二二酮酮）、异异鲁鲁米米诺诺（6-6-氨氨基基-2,3-2,3-二二氢氢- -1,4-1,4-酞酞嗪嗪二二酮酮）及及其其衍衍生生物物如如氨氨丁丁基基乙乙基基异异鲁鲁米米诺诺（ABEIABEI）、氨氨己己基基乙乙基基异异鲁鲁米米诺诺（AHEIAHEI）、氨氨丁丁基基乙乙基鲁米诺（基鲁米诺（ABENHABENH）等）等
72、均均属于这一类化学发光剂。属于这一类化学发光剂。鲁鲁米米诺诺类类化化合合物物的的发发光光反反应应必必须须有有催催化化剂剂（如如过过氧氧化化物物酶酶）催催化化，且且与与蛋蛋白白或或肽肽结结合合后后其其发发光光作作用用减减弱弱，因因此此鲁鲁米米诺诺类类化化合合物物在在CLIACLIA中中是是很很好好的的底底物物，但但已已较较少用于少用于CLIACLIA的标记。的标记。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-14 鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-15 鲁米诺化学发光反应过程鲁米诺化学
73、发光反应过程第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（3 3）咪唑类化合物）咪唑类化合物 咪唑类发光剂主要咪唑类发光剂主要是是咯吩碱咯吩碱。其其反反应应过过程程首首先先是是咯咯吩吩碱碱在在碱碱性性二二甲甲亚亚砜砜水水溶溶液液中中形形成成过过氧氧化化物物中中间间体体，再再进进行行重重排排，降降解解，伴伴随随产产生生化化学发光学发光，如图，如图7-167-16所示。所示。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-16 咯吩碱的化学发光反应咯吩碱的化学发光反应第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（4 4）苯苯酚酚类类化化合合物物 用用于于化化学学发发光光免免疫疫测测定
74、定的的酚酚类类物物质质主主要要是是邻邻苯苯三三酚酚（焦焦性性没没食食子子酸酸），它它是是一一种种强强还还原原剂剂，在在催催化化剂剂（如如HRPHRP、血血红红素素）催催化化下下，与与H H2 2O O2 2反反应产生化学发光。应产生化学发光。（5 5）芳芳基基草草酸酸酯酯类类化化合合物物 这这类类化化合合物物主主要要有有双双- -（2,4,6-2,4,6-三三氯氯苯苯基基）草草酸酸酯酯（TCPOTCPO）和和双双- -（2,4-2,4-二二硝基苯基硝基苯基）草酸酯草酸酯（DNPODNPO）。）。此此类类物物质质的的发发光光反反应应是是在在反反应应体体系系中中加加入入一一种种荧荧光光染染料料如如
75、8-8-苯苯胺胺基基-1-1-萘萘磺磺酸酸（ANSANS）作作为为荧荧光光载载体体，通通过过过过氧氧化化草草酸酸酯酯中中间间产产物物捕捕获获化化学学能能，使使荧荧光光体体处处于于激激发态发态，退激至基态时，放出光子。，退激至基态时，放出光子。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析二、二、化学发光酶联免疫分析化学发光酶联免疫分析1 1、化学发光酶联免疫分析、化学发光酶联免疫分析以以在在酶酶催催化化反反应应中中可可以以产产生生化化学学发发光光的的发发光光物物质质作作为为底底物物，以以化化学学发发光光法法检检测测酶酶的的活活性性，则则为为化化学学发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析（chemi
76、luminescent chemiluminescent enzyme enzyme immunoimmuno- - assayassay，CLEIACLEIA）。）。CLEIACLEIA方方法法的的检检测测限限低低至至1010-17-17mol/Lmol/L，达达到到或或超超过过放放射射免疫分析的灵敏度。免疫分析的灵敏度。化化学学发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析实实际际上上是是一一种种酶酶联联免免疫疫测测定定过过程。程。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析2 2、CLEIACLEIA常用的标记酶常用的标记酶CLEIACLEIA方方法法中中最最常常用用的的是是辣辣根根过过氧氧化化物
77、物酶酶和和葡葡萄萄糖糖氧氧化酶化酶（GODGOD）。）。此此外外还还有有丙丙酮酮酸酸激激酶酶、葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶、萤萤火火虫素酶虫素酶、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）和）和-D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶等。等。HRPHRP标记标记的的CLEIACLEIA，常用，常用的底物为鲁米诺或其衍生物的底物为鲁米诺或其衍生物。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析鲁鲁米米诺诺的的氧氧化化反反应应在在碱碱性性缓缓冲冲液液中中进进行行，通通常常以以0.1mol/L0.1mol/L、pH8.6pH8.6的的TrisTris缓缓冲冲液液作作底底物物液液，鲁鲁米米诺诺和和H H2
78、 2O O2 2在在无无HRPHRP催催化化时时也也能能缓缓慢慢自自发发发发光光，而而在在最最后后光光强强度度测测定定中中造造成成空空白白干干扰扰，因因而而宜宜分分别别配配制制成成两两瓶瓶试试剂剂溶液，只在用前即刻混合。溶液，只在用前即刻混合。HRPHRP催催化化鲁鲁米米诺诺的的氧氧化化反反应应可可被被某某些些酚酚类类物物质质（如如对对碘苯酚）或碘苯酚）或萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶等等增强增强。增增强强剂剂的的作作用用是是增增强强发发光光和和延延长长发发光光时时间间，由由此此可可提提高敏感度。高敏感度。另外一些另外一些金属配合物金属配合物能催化鲁米诺的化学发光反应。能催化鲁米诺的化学发光反应
79、。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析利利用用GODGOD对对葡葡萄萄糖糖的的催催化化氧氧化化产产生生H H2 2O O2 2，用用化化学学发发光光反反应底物检测应底物检测产生的产生的H H2 2O O2 2，可间接测定，可间接测定GODGOD的活性。的活性。常见发光反应底物有常见发光反应底物有鲁米诺鲁米诺、TCPOTCPO等等。如如MasakoMasako和和AkioAkio以以GODGOD为为标标记记酶酶，鲁鲁米米诺诺-H-H2 2O O2 2作作为为发发光光底底物物，以以流流动动注注射射化化学学发发光光分分析析测测定定17-17-羟羟基基孕孕甾甾酮酮、甲甲胎胎蛋蛋白白和和胰胰
80、岛岛素素，检检测测限限分分别别为为0.5pg/ml0.5pg/ml、0.1ng/ml0.1ng/ml和和0.1ng/ml0.1ng/ml，而而且且分分析析速速度度快快，测测定定结结果果精精密度好。密度好。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析3 3、CLEIACLEIA常用的发光增强剂常用的发光增强剂在在反反应应体体系系中中引引入入增增强强剂剂，可可增增强强化化学学发发光光强强度度，提提高高化化学学发发光光测测定定的的信信噪噪比比，提提高高化化学学发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析灵敏度灵敏度。最最常常用用的的增增强强剂剂有有萤萤火火虫虫荧荧光光素素、苯苯并并噻噻唑唑、苯苯酚酚取取代物
81、代物、取代联苯胺取代联苯胺、酸类衍生物酸类衍生物、萘酚萘酚等。等。例例如如，萤萤火火虫虫素素、6-6-羟羟基基苯苯噻噻唑唑衍衍生生物物等等能能加加强强HRPHRP催化鲁米诺等的化学发光反应，使其强度提高催化鲁米诺等的化学发光反应，使其强度提高8080倍；倍；某某些些酸酸类类衍衍生生物物尤尤其其是是对对碘碘酸酸、苯苯甲甲酸酸等等的的增增强强效效果果更更佳佳，可可使使其其发发光光强强度度提提高高10001000倍倍，且且延延长长发发光光持持续续时间。时间。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析三、三、生物发光酶联免疫分析生物发光酶联免疫分析在在1885188518871887年年，Dub
82、oisDubois从从发发光光昆昆虫虫和和有有双双壳壳的的软软体体动动物物体体内内提提炼炼出出各各种种材材料料，发发现现这这些些材材料料混混合合在在一一起起能能产产生生发发光光；他他将将其其中中可可被被稳稳定定加加热热的的物物质质称称为为荧荧光光素素，而将，而将加热不稳定加热不稳定的物质称为的物质称为荧光素酶荧光素酶。生生物物发发光光现现象象的的化化学学本本质质就就是是荧荧光光素素与与荧荧光光素素酶酶发发生生化学反应化学反应，可看成是特殊形式的化学发光可看成是特殊形式的化学发光。一一般般而而言言，生生物物发发光光量量子子产产率率和和特特异异性性均均比比化化学学发发光光高高，量量子子产产率率接接
83、近近100100，发发光光强强度度大大，持持续续时时间间长长，发光稳定发光稳定，故故生物发光分析灵敏度高，容易测定。生物发光分析灵敏度高，容易测定。第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 将将高高灵灵敏敏度度的的生生物物发发光光与与特特异异性性的的酶酶联联免免疫疫分分析析技技术术相结合便形成生物发光酶联免疫分析法（相结合便形成生物发光酶联免疫分析法（BLEIABLEIA）。）。常采用常采用戊二醛法戊二醛法将将荧光素酶荧光素酶与与抗原抗原或或抗体抗体结合结合。现现在在已已经经可可以以提提取取纯纯度度很很高高的的荧荧光光素素和和荧荧光光素素酶酶，建建立立起起了了各各种种各各样样的的生生物物
84、发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析方方法法，这这些些方方法法应应用用于于生生物物体体液液中中各各种种激激素素、药药物物、微微生生物物、抗抗原、抗体等成分的测定。原、抗体等成分的测定。生生物物发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析在在临临床床分分析析上上也也越越来来越越广广泛泛地地引起人们的重视。引起人们的重视。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析最最常常用用于于生生物物发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析的的生生物物发发光光反反应应有有以以下两种：下两种：（1 1）荧光素荧光素- -荧光素酶生物发光体系荧光素酶生物发光体系。荧荧光光素素（LHLH2 2）和和荧荧光光素素酶酶（E E）在在三三磷
85、磷酸酸腺腺苷苷（ATPATP）、MgMg2+2+、O O2 2存存在在下下，可可产产生生焦焦磷磷酸酸（PPiPPi）和和一一磷磷酸酸腺腺苷苷（AMPAMP），接接着着O O2 2和和E E，LHLH2 2，AMPAMP引引导导荧荧光光素素脱脱羧羧，形形成成激激发发态态产产物物氧氧化化荧荧光光素素（L L* *），它它在在返返回回基基态态时发光，发射光的波长时发光，发射光的波长maxmax=562nm=562nm。利利用用上上述述生生物物发发光光反反应应与与一一个个酶酶催催化化的的反反应应相相耦耦合合，即可进行生物发光酶联免疫分析。即可进行生物发光酶联免疫分析。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发
86、光酶联免疫分析例例如如用用葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶标标记记三三硝硝基基甲甲苯苯（TNTTNT），利利用用葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶能能催催化化葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸和和烟烟酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸（NADNAD+ +）的的反反应应与与生生物物发发光光反反应应相相耦耦合合。葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶的的活活性性较较好好，1.0101.010-18-18mol/Lmol/L的的葡葡萄萄糖糖-6-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶每每分分钟钟能能产产生生4.0104.010-14-14mol/Lmol/L的的NADHNADH，这这样样可可以
87、以大大大大提提高高灵灵敏敏度度，对对TNTTNT的的检检测测限限达达1.0101.010-18-18mol/Lmol/L。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（2 2）荧荧光光素素酶酶- -黄黄素素单单核核苷苷酸酸（FMNFMN）细细菌菌生生物物发发光光体体系。系。此体系中有此体系中有荧光素酶荧光素酶和和FMNFMN氧化还原酶氧化还原酶两种酶参与。两种酶参与。FMNFMN氧氧化化还还原原酶酶在在还还原原型型辅辅酶酶烟烟酰酰胺胺腺腺嘌嘌呤呤二二核核苷苷酸酸（辅辅酶酶-NADPH-NADPH）和和H H+ +存存在在下下，能能使使FMNFMN还还原原成成还还原原型型的黄素单核苷酸（的黄
88、素单核苷酸（FMNHFMNH2 2）。）。接接着着荧荧光光素素酶酶在在有有O O2 2的的情情况况下下，催催化化还还原原型型黄黄素素单单核核苷苷酸酸和和长长链链脂脂肪肪醛醛氧氧化化产产生生FMNFMN和和长长链链脂脂肪肪酸酸并并产产生生发发光光，发发射射波波长长为为maxmax=490nm=490nm，从从而而可可以以进进行行生生物物发发光酶联免疫检测。光酶联免疫检测。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析四、四、发光酶联免疫分析的应用发光酶联免疫分析的应用发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析是是现现代代痕痕量量分分析析中中一一项项重重要要技技术术，其其应应用用非非常常广广泛泛，已已有有
89、大大量量综综述述文文献献，这这里里不不做做详详细细介介绍绍，仅仅以以标标记记HRPHRP、GODGOD的的化化学学发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析和和生物发光酶联免疫分析为例做简单说明。生物发光酶联免疫分析为例做简单说明。（1 1）以以HRPHRP为为标标记记酶酶标标记记抗抗原原或或抗抗体体，以以鲁鲁米米诺诺-H-H2 2O O2 2为为底底物物测测定定了了单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒、人人绒绒毛毛膜膜促促性性腺腺激激素素、白白色念珠菌等物质；色念珠菌等物质；以以异异鲁鲁米米诺诺-H-H2 2O O2 2为为底底物物测测定定了了巨巨细细胞胞病病毒毒抗抗原原、甲甲胎胎蛋白、抗鲁白宁蛋白、抗鲁白宁Ig
90、GIgG、皮质醇等；、皮质醇等；以以邻邻苯苯三三酚酚-H-H2 2O O2 2为为底底物物测测定定登登革革热热型型病病毒毒b b、伤伤寒寒杆菌、细菌内毒素等物质。杆菌、细菌内毒素等物质。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（2 2）以以GODGOD为为标标记记酶酶标标记记抗抗原原或或抗抗体体，以以鲁鲁米米诺诺-H-H2 2O O2 2为为底底物物测测定定了了17-17-羟羟基基孕孕甾甾酮酮、甲甲胎胎蛋蛋白白、胰胰岛岛素素、甲状腺素等；甲状腺素等；以以双双- -（2,4,6-2,4,6-三三氯氯苯苯基基）草草酸酸酯酯（TCPOTCPO）-H-H2 2O O2 2为为底底物物测测定定了
91、了脱脱氢氢表表雄雄甾甾酮酮、甲甲胎胎蛋蛋白白、促促甲甲状状腺腺素素、催催乳素、乳素、17-17-羟基孕甾酮等物质。羟基孕甾酮等物质。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析（3 3）以以荧荧光光素素酶酶为为标标记记酶酶，以以荧荧光光素素酶酶- -荧荧光光素素发发光光体体系系的的生生物物发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析测测定定了了转转铁铁蛋蛋白白、胰胰岛岛素素、艮艮他他霉霉素素、氨氨甲甲蝶蝶呤呤、马马来来酰酰亚亚胺胺苯苯甲甲酰酰基基- -N N- -琥琥珀珀酰酰亚亚胺胺、孕孕酮酮、人人绒绒毛毛膜膜促促性性腺腺激激素素、甲甲胎胎蛋蛋白白、促促黄体生成激素等；黄体生成激素等；以以荧荧光光素素
92、酶酶-FMN-FMN生生物物发发光光体体系系的的生生物物发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析测测定定了了二二硝硝基基苯苯酚酚、三三硝硝基基甲甲苯苯、甲甲胎胎蛋蛋白白等等各各种种物质。物质。它们的检测限可达到它们的检测限可达到pmol/Lpmol/L甚至甚至fmol/Lfmol/L级。级。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析1 1、什么是免疫分析？、什么是免疫分析？2 2、免疫分析方法可分为哪些种类？、免疫分析方法可分为哪些种类？3 3、酶标记免疫分析法中使用的酶应符合哪些条件？如何、酶标记免疫分析法中使用的酶应符合哪些条件？如何对所用酶的质量进行评价？酶联免疫分析中常用的酶有对所用酶的
93、质量进行评价？酶联免疫分析中常用的酶有哪些？哪些？4 4、简述、简述ELISAELISA的原理及特点。的原理及特点。5 5、ELISAELISA固相载体的一般采用什么材料，有哪些形式？固相载体的一般采用什么材料，有哪些形式？6 6、什么是包被？什么是封闭？、什么是包被？什么是封闭？7 7、ELISAELISA中常使用哪些稀释液、洗涤液和酶反应终止液？中常使用哪些稀释液、洗涤液和酶反应终止液？8 8、辣根过氧化物酶的、辣根过氧化物酶的RZRZ值是指什么？对其有什么要求？值是指什么？对其有什么要求？HRPHRP的常用底物有哪些？的常用底物有哪些？APAP的常用底物有哪些？的常用底物有哪些？-D-D
94、-半半乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪些？些？ 思考题思考题9 9、ELISAELISA的酶联有哪些方法？的酶联有哪些方法？1010、ELISAELISA试验方法有哪些，如何进行？试验方法有哪些，如何进行？1111、ELISAELISA反应中，如何选择适宜的包被浓度？如何选择反应中，如何选择适宜的包被浓度？如何选择适宜的酶结合物浓度？如何选择适宜的酶适宜的酶结合物浓度？如何选择适宜的酶- -底物反应时底物反应时间？间？1212、ELISAELISA放大系统有哪些？放大系统有哪些？1313、如何计算酶标记免疫复合物中的酶量、酶结合率和摩、如何计算酶标记免疫复合物中的酶量、酶结合率和摩尔比值？尔比值？1414、化学发光是如何产生的？化学发光剂有哪些种类？、化学发光是如何产生的？化学发光剂有哪些种类？1515、化学发光免疫分析可分为哪些种类？、化学发光免疫分析可分为哪些种类？1616、化学发光酶联免疫分析常用的标记酶有哪些？化学发、化学发光酶联免疫分析常用的标记酶有哪些？化学发光酶联免疫分析常用的发光增强剂有哪些？光酶联免疫分析常用的发光增强剂有哪些？1717、最常用于生物发光酶联免疫分析的生物发光反应有哪、最常用于生物发光酶联免疫分析的生物发光反应有哪些？些？ 思考题思考题
