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1、蛋白质分离技术蛋白质分离技术-层析层析上海交通大学医学院上海交通大学医学院倪培华倪培华 副教授副教授一、概述 1 1 1 1、定义、定义、定义、定义 层层层层析析析析( ( ( (又又又又名名名名色色色色谱谱谱谱) ) ) ) 一一一一 种种种种 利利利利用用用用混混混混合合合合物物物物中中中中各各各各组组组组分分分分的的的的物物物物理理理理化化化化学学学学性性性性质质质质间间间间的的的的差差差差异异异异，使使使使各各各各组组组组分分分分在在在在层层层层析析析析两两两两相相相相中中中中以以以以不不不不同同同同程程程程度度度度分分分分配配配配，借借借借此此此此将将将将各各各各组组组组分分分分分分
2、分分离。离。离。离。分子极性分子极性分子大小分子大小分子形状分子形状离子亲和力离子亲和力分子亲和力分子亲和力吸附能力吸附能力凝胶层析凝胶层析离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析2 2、物理化学性质间的差异、物理化学性质间的差异吸附层析吸附层析1903190319031903年年年年 俄国植物学家俄国植物学家俄国植物学家俄国植物学家 茨维特茨维特茨维特茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区物色素，以石油醚
3、冲洗，得到黄色、绿色区物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带带带带; ; ; ;1970s1970s1970s1970s早期早期早期早期 高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC)HPLC)HPLC)HPLC) 目前目前目前目前 气相层析仪和气相层析仪和气相层析仪和气相层析仪和HPLCHPLCHPLCHPLC与色谱、质谱以及计算与色谱、质谱以及计算与色谱、质谱以及计算与色谱、质谱以及计算机联用。机联用。机联用。机联用。3 3、层析的发展、层析的发展 层层析析法法进进行行时时有有两两个个相相，一一个个相相称称为为固固定定相相，另另一一相相称称为为流流动动相相。支持物支
4、持物含待分离物质含待分离物质气气相相层层析析液液相相层层析析气气- -固固 气气- -液液 液液- -固固 液液- -液液二二. .层析技术的分类层析技术的分类1. 1. 按两相所处的状态分类按两相所处的状态分类以气体作为流动相以气体作为流动相以液体作为流动相以液体作为流动相2.按层析的机制可分为n n吸附层析吸附层析n n分配层析分配层析n n凝胶层析凝胶层析n n亲和层析亲和层析n n离子交换层析离子交换层析n n定义定义定义定义 指指指指混混混混合合合合物物物物随随随随流流流流动动动动相相相相通通通通过过过过吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂时时时时，由由由由于于于于吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂对对对
5、对不不不不同同同同物物物物质质质质的的的的吸吸吸吸附附附附力力力力而使混合物分离的方法。而使混合物分离的方法。而使混合物分离的方法。而使混合物分离的方法。n n原理原理原理原理 在不同条件下，吸附在不同条件下，吸附在不同条件下，吸附在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用剂与被吸附物之间的作用剂与被吸附物之间的作用剂与被吸附物之间的作用物物物物理理理理作作作作用用用用的的的的范范范范德德德德华华华华吸吸吸吸附附附附：无无无无选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速速速速度度度度快快快快，吸吸吸吸附的过程是可逆的附的过程是可逆的附的过程是可逆的附的过程是可逆的化化化化学学学学吸吸吸吸附附附附
6、：由由由由原原原原子子子子价价价价力力力力的的的的作作作作用用用用引引引引起起起起。有有有有选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸速度较慢，不易解吸（1）吸附层析 在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。吸附层析n n常用的吸附剂常用的吸附剂 硅胶碱性碱性碱性碱性: : : :碳氢化合
7、物碳氢化合物碳氢化合物碳氢化合物 中性中性中性中性: : : :醛醛醛醛, , , ,酮酮酮酮, , , ,醌醌醌醌, , , ,酯酯酯酯, , , ,内内内内酯酸性酯酸性酯酸性酯酸性: : : :酸性色素酸性色素酸性色素酸性色素, , , ,醛醛醛醛, , , ,酸酸酸酸聚酰胺氧化铝 活性炭磷酸钙粉末粉末粉末粉末: :吸附力大吸附力大吸附力大吸附力大,流速慢流速慢流速慢流速慢 颗粒颗粒颗粒颗粒: :吸附力中吸附力中吸附力中吸附力中, ,流速易流速易流速易流速易控控控控 锦纶锦纶锦纶锦纶- -活性炭活性炭活性炭活性炭: :吸吸吸吸附力弱附力弱附力弱附力弱锦纶锦纶锦纶锦纶66666666或锦纶或
8、锦纶或锦纶或锦纶6 6 6 6 酰胺基团酰胺基团酰胺基团酰胺基团 对酚对酚对酚对酚,DNP-,DNP-,DNP-,DNP-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸, , , , 醌醌醌醌, , , ,羧羧羧羧酸酸酸酸 氢键：羟基与氢键：羟基与氢键：羟基与氢键：羟基与羰基羰基羰基羰基唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石（2）分配层析利利利利用用用用不不不不同同同同组组组组分分分分在在在在流流流流动动动动相相相相和和和和固固固固定定定定相相相相中中中中的的的的分分分分配配配配系数不同系数不同系数不同系数不同而进行分离的方法。而进
9、行分离的方法。而进行分离的方法。而进行分离的方法。n n柱层析柱层析 进样量大且容易回收进样量大且容易回收n n薄层层析薄层层析 小量样品，快速，小量样品，快速， 操作简便操作简便3.3.按制备量分类按制备量分类 层层析法的析法的演变过程演变过程：圆形滤纸长条滤纸薄层层析(TLC)柱层析容量变大容量更大加展开液纸纸纸纸层析层析层析层析薄层层析薄层层析三.层析的一般原理 1.1.1.1.分配系数分配系数分配系数分配系数 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定表示一种物质在两种特定相（流动相和固定表示一种物质在两种特定相（流动相和固定表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度。相）中分配
10、程度。相）中分配程度。相）中分配程度。 溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度 CsCsK= = K= = 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 CmCm特定的温度：常数特定的温度：常数K K大：被固定相吸附的牢固，随流动相大：被固定相吸附的牢固，随流动相 的移动速度较慢。的移动速度较慢。纯化生物物质的纯度纯化生物物质的纯度 取取决决于于混混合合物物中中各各组组分分K K 值值的的差异程度。差异程度。 混混合合物物中中各各组组分分若若 K K值值相相差差较较大大, , 则则能能较较易易地地把把混混合合物物中中的的生生物物物物质质分分离离。反反之之,K,K值值相相差差较较小小, ,不不易易
11、把把混合物中的生物物质分离。混合物中的生物物质分离。凝胶层析Gel Chromatography凝胶过滤凝胶过滤 （gel filtrationgel filtration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层析（分子筛层析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography） (Hjertn,Mosbach,1962)排阻层析排阻层析 （exclusion chromatographyexclusion chromatography）(Pedersen,1962) 指混合物随流动相经固定相的层析柱时，指混合物随
12、流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。的技术。 一、基本原理 固定相（凝胶）n n三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water 凝胶层凝胶层析法：析法：样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分子筛效应分子筛效应： 分子大小不分子大小不同同, ,在凝胶受在凝胶受到的阻滞作用到的阻滞作用有差异有差异, ,从而从而造成各组分在造成各组分在凝胶柱中的迁凝胶柱中的迁移速度不同得移速度不同得到分到分离。凝胶层析
13、过程的数理关系 1 1、柱床体积、柱床体积、柱床体积、柱床体积(V(VT T) ) 2 2、洗脱体积（洗脱体积（洗脱体积（洗脱体积（VeVe）n n即即即即欲欲欲欲分分分分离离离离物物物物质质质质通通通通过过过过层层层层析析析析柱柱柱柱洗洗洗洗脱脱脱脱下下下下来来来来所所所所需需需需洗洗洗洗脱脱脱脱液的总体积。液的总体积。液的总体积。液的总体积。3 3、外水体积（外水体积（外水体积（外水体积（V V0 0） 4 4、内水体积（内水体积（内水体积（内水体积（ViVi）5 5、凝胶干体积（凝胶干体积（凝胶干体积（凝胶干体积（VgVg） 柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积V
14、i存在于柱床内凝胶存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水外面空隙之间的水相体积，相应于一相体积，相应于一般层析法中流动相般层析法中流动相的体积。的体积。颗粒内部所含水相颗粒内部所含水相的体积它可从干凝的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水胶颗粒重量和吸水重量相减求得。重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。外间隙体积的总和。 VT = 1/4 D2h 外水体积外水体积V0V VT T = Vg + V= Vg + V0 0 + Vi+ Vi数理关系数理关系 VeVe -Vo -Vo KdKd = = ViVi6、分配系数（、分配系数（ Kd ）：）：特点：特点：（1）与被分离物
15、质分）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细）与柱的长短粗细无关无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（有一个特定的分配系数（有一个特定的分配系数（有一个特定的分配系数（KdKdKdKd）VeVeVeVe= = = =Vo+KdViVo+KdViVo+KdViVo+KdVi(2)Ve = Vo + Vi(2)Ve = Vo + Vi KdKd = 1 = 1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内完全向凝胶
16、颗粒内部扩散部扩散n在两相分配的比值在两相分配的比值为为1,1,最后流出最后流出. .(1)Ve = Vo(1)Ve = Vo KdKd = 0 = 0n分分子子完完全全被被排排阻阻于于凝凝胶胶颗颗粒粒之外之外n全全部部分分布布于于流流动相里动相里, ,n最先流出。最先流出。(3) 0 (3) 0 KdKd 1 1 VeVe = Vo + = Vo +ViKdViKd为为溶质以某种程溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩度向凝胶颗粒内扩散散KdKdKdKd=0=0=0=0 0 0 0 0KdKdKdKd1111 KdKdKdKd=1=1=1=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积三三三三. . . .凝凝凝
17、凝胶胶胶胶层层层层析析析析的的的的优优优优点点点点 1.1.1.1.凝凝凝凝胶胶胶胶是是是是一一一一种种种种不不不不带带带带电电电电荷荷荷荷的的的的惰惰惰惰性性性性载载载载体体体体，结结结结构稳定构稳定构稳定构稳定。 2. 2. 2. 2. 操作条件较温和操作条件较温和操作条件较温和操作条件较温和。 3.3.3.3.样样样样品品品品得得得得率率率率高高高高, , , ,重重重重复复复复性性性性好好好好, , , ,可可可可进进进进行行行行大大大大量量量量样品的分离纯化。样品的分离纯化。样品的分离纯化。样品的分离纯化。四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点1.1
18、.1.1.要要要要求求求求样样样样品品品品和和和和洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液的的的的粘度很低粘度很低粘度很低粘度很低。2.2.2.2.凝凝凝凝胶胶胶胶颗颗颗颗粒粒粒粒网网网网络络络络孔孔孔孔径径径径大大大大小小小小非非非非常常常常有有有有限限限限, , , ,所所所所以以以以可可可可被被被被纯纯纯纯化化化化的的的的物物物物质质质质的的的的分分分分子子子子量范围受到限制量范围受到限制量范围受到限制量范围受到限制。3.3.3.3.凝凝凝凝胶胶胶胶结结结结构构构构对对对对某某某某些些些些溶溶溶溶质质质质分子具有吸附作用分子具有吸附作用分子具有吸附作用分子具有吸附作用。五、凝胶的结构与性能 1.1.1.
19、1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶1959195919591959年年年年PorathPorathPorathPorath和和和和FlodinFlodinFlodinFlodin合成合成合成合成（商品名为（商品名为（商品名为（商品名为SephadexSephadexSephadexSephadex） （1 1 1 1）结构：结构：结构：结构：基本骨架：基本骨架：基本骨架：基本骨架：葡聚糖（葡聚糖（葡聚糖（葡聚糖（dextrandextrandextrandextran）交联剂：交联剂：交联剂：交联剂：3-3-3-3-氯代氯代氯代氯代-1 ,2-1 ,2-1 ,2-1 ,2-环氧氯丙环
20、氧氯丙环氧氯丙环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的聚合而成的聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构。（2）特点：交联度：交联度：n n交联剂越多交联剂越多 交联度越大交联度越大 网孔结构越紧密网孔结构越紧密n n交联剂越少交联剂越少 交联度越小交联度越小 网孔结构越疏松网孔结构越疏松化学性质：化学性质： 稳稳定定,不不溶溶于于水水、盐盐、弱弱酸酸、碱碱和和一一般般有有机机溶溶剂剂, 耐耐热热耐耐碱碱不不耐耐强强酸酸（2）特点：SephadexSephadex的分级
21、范围的分级范围 G10 700G10 700G10 700G10 700G15 1,500G15 1,500G15 1,500G15 1,500G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-50 1,50030,000G-50 1,50030,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G-75 3,00070,000G-75 3,00070,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G100 4,000 150,000G100
22、 4,000 150,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000吸水性吸水性n nG类的型号类的型号表示每克干凝胶吸表示每克干凝胶吸水量（水量（ml）x10如如G-50 每克干凝胶吸每克干凝胶吸水量为水量为5ml。n n大孔凝胶大孔凝胶大孔凝胶大孔凝胶n n工作范围的下限几乎是工作范围的下限几乎是工作范围的下限
23、几乎是工作范围的下限几乎是 SephadexSephadex的上限的上限的上限的上限n n可分离可分离可分离可分离MW40MW40万以上万以上万以上万以上的物质的物质的物质的物质n n可用来分离核酸及病毒。可用来分离核酸及病毒。可用来分离核酸及病毒。可用来分离核酸及病毒。2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose)3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose + acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel A
24、acrylamideagarose六六. .其它条件选择其它条件选择 1.1.1.1.柱的选择柱的选择柱的选择柱的选择 柱柱柱柱短短短短而而而而粗粗粗粗, , , ,则则则则易易易易使使使使样样样样品品品品稀稀稀稀释释释释, , , ,柱柱柱柱长长长长而而而而窄窄窄窄, , , ,则则则则柱柱柱柱的的的的管管管管壁壁壁壁效效效效应应应应较较较较大大大大, , , ,会会会会造成拖尾现象。造成拖尾现象。造成拖尾现象。造成拖尾现象。 2.2.2.2.样品的选择：样品的选择：样品的选择：样品的选择： 量适当量适当量适当量适当, , , , 粘度小粘度小粘度小粘度小。 3.3.3.3.洗脱液的选择：洗
25、脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择： 每每每每种种种种样样样样品品品品分分分分离离离离所所所所用用用用的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液应应应应根根根根据据据据使使使使样品稳定样品稳定样品稳定样品稳定的原则使用。的原则使用。的原则使用。的原则使用。七、应用七、应用1.1.1.1.分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化 2.2.2.2.脱盐脱盐脱盐脱盐 3.3.3.3.测分子量测分子量测分子量测分子量Elution volume (ml)AlbuminNaClnDesalting in a simple column 测分子量测分子量 VelogMr实验：实验： 凝胶层析法分离蛋白质
26、凝胶层析法分离蛋白质血红蛋白血红蛋白 64,480二硝基苯二硝基苯-鱼精蛋白鱼精蛋白 2,000-12,000Sephadex G-50 孔径孔径 1,500-30,000一、原理：一、原理：KdKd=0=0KdKd=1=11、装柱、装柱 先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；凝胶不能有气泡和分层现象；凝胶不能有气泡和分层现象；装柱结束后要保持凝胶表面平整。装柱结束后要保持凝胶表面平整。二、操作注意点：二、操作注意点：2 2、加样、加样、加样、加样使液面和凝胶表面相切，关闭出口；使液面和凝胶表面相切，关闭出口；使液面和凝胶表面相切，关闭出口；使液面和凝胶表面相切，关闭
27、出口；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。血红蛋白和二硝基苯血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的鱼精蛋白的洗脱体积？洗脱体积？柱的外水体积和内水体积柱的外水体积和内水体积三、结果要求：三、结果要求：亲 和 层 析Affinity ChromatographyNi Peihua 一、原理n n亲亲和和层层析析是是利利用用生生物物大大分分子子所所具具有有的的专专一亲和力而设计的纯化技术。
28、一亲和力而设计的纯化技术。n n寻找配基寻找配基n n使配基固定化使配基固定化n n制成亲和层析柱制成亲和层析柱基本过程基本过程+固相化固相化+洗洗洗洗脱脱脱脱吸附吸附解吸+样品样品样品样品固相化 再生酶：酶：酶：酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗体：抗体：抗体： 抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞细胞：细胞：细胞：细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：核酸：核酸：核酸： 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚互
29、补碱基序列，组蛋白，核酸聚互补碱基序列，组蛋白，核酸聚互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，合酶，合酶，合酶， 结合结合结合结合 蛋白蛋白蛋白蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞常见具有专一性亲和力的生物分子对：常见具有专一性亲和力的生物分子对：（一） 载体的选择1 1、载体要求：、载体要求：（1 1）不溶性）不溶性（2 2）渗透性：疏松网状结构，有良好
30、的液）渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性体流动性（3 3）化学和机械性能稳定）化学和机械性能稳定（4 4）具备大量能被活化的基因）具备大量能被活化的基因（5 5）抗微生物和酶的侵蚀）抗微生物和酶的侵蚀2 2、常用载体、常用载体（1 1 1 1）纤维素）纤维素）纤维素）纤维素 特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足 纤纤纤纤维维维维性性性性、非非非非均均均均一一一一性性性性限限限限制制制制大大大大分分分分子子子子的的的的掺掺掺掺入入入入 非专一性吸附严重非专一性吸附严重非专一性吸附严重非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化用于抗体和酶的纯化用于抗体
31、和酶的纯化用于抗体和酶的纯化（2 2）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶特点：特点： 化学及物理性质稳定化学及物理性质稳定 多孔性比琼脂糖低多孔性比琼脂糖低（3 3）琼脂糖凝胶）琼脂糖凝胶浓度浓度浓度浓度 商品商品商品商品2 2 2 2 SepharoseSepharoseSepharoseSepharose 2B 2B 2B 2B 4% 4% 4% 4% SepharoseSepharoseSepharoseSepharose 4B 4B 4B 4B 6% 6% 6% 6% SepharoseSepharoseSepharoseSepharose 6B 6B 6B 6B 凝胶浓度越低凝胶浓度越低结构越疏
32、松即多孔性越高结构越疏松即多孔性越高机械强度越低机械强度越低（4 4 4 4）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（5 5 5 5）多孔玻璃）多孔玻璃）多孔玻璃）多孔玻璃特点：不受微生物的侵蚀特点：不受微生物的侵蚀特点：不受微生物的侵蚀特点：不受微生物的侵蚀 耐耐耐耐酸酸酸酸、碱碱碱碱、有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂 表面非专一性吸附表面非专一性吸附表面非专一性吸附表面非专一性吸附特点：物理化学性质稳定特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强糖强 可供化学反应的可供化学反应的酰胺基较酰胺基较酰胺基较酰胺基较多多多多（二）配基的选择1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力、对
33、于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必须具备能被修饰的功能基团、必须具备能被修饰的功能基团以酶和底物为例：E+L ELE+L ELE+L ELE+L ELK K K KL L L L =EL/EL=E =EL/EL=E =EL/EL=E =EL/EL=E0 0 0 0-ELL-ELL-ELL-ELL0 0 0 0-EL/EL-EL/EL-EL/EL-EL/ELE E E E0 0 0 0、L L L L0 0 0 0：起始浓度起始浓度起始浓度起始浓度当当当当L L L L0 0 0 0E E E E0 0 0 0时时时时K K K KL L L L =E =E =E =E0 0 0 0-E-E-E
34、-EL L L LLLLL0 0 0 0/E/E/E/EL L L L EL=EEL=EEL=EEL=E0 0 0 0-E-E-E-EL L L LLLLL0 0 0 0/ K/ K/ K/ KL L L LKdKdKdKd= = = =结合酶结合酶结合酶结合酶/ / / /游离酶游离酶游离酶游离酶=EL/E=EL/E=EL/E=EL/E0 0 0 0-EL=L-EL=L-EL=L-EL=L0 0 0 0/ K/ K/ K/ KL L L LKLK K K KL L L L：解离常数解离常数解离常数解离常数 E E E E：酶酶酶酶 L L L L：底物底物底物底物ELELELEL：复合物复合
35、物复合物复合物（三）固相化三）固相化将配体以共价键连接于固相基将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂质上制成固相化吸附剂n n载体的排斥效应载体的排斥效应载体的排斥效应载体的排斥效应n n载体的空间障碍载体的空间障碍载体的空间障碍载体的空间障碍二、亲和层析分离二、亲和层析分离1 1 1 1、装柱和平衡、装柱和平衡、装柱和平衡、装柱和平衡2 2 2 2、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附3 3 3 3、洗脱、洗脱、洗脱、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附洗脱方法洗脱方法（1 1 1 1）非特异性洗脱：改变）非特异性洗脱：改变）非特异性洗脱：改变）非特异性洗脱：改
36、变洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液pHpHpHpH值值值值离子强度离子强度离子强度离子强度梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱（2 2 2 2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。体的连接键，再用
37、透析或凝胶层析法去除配基。 断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键（3 3 3 3）专一性洗脱）专一性洗脱）专一性洗脱）专一性洗脱 已已已已使使使使用用用用过过过过和和和和柱柱柱柱，经经经经过过过过再再再再生生生生处处处处理理理理，去去去去除除除除非非非非特异吸附的杂质后，可重复使用。特异吸附的杂质后，可重复使用。特异吸附的杂质后，可重复使用。特异吸附的杂质后，可重复使用。 再生步骤：再生步骤：再生步骤：再生步骤：n n起始缓冲液重复平衡一次起始缓冲液重复平衡一次起始缓冲液重复平衡一次起始缓冲液重复平衡一
38、次n n用高离子强度和低离子强度溶液处用高离子强度和低离子强度溶液处用高离子强度和低离子强度溶液处用高离子强度和低离子强度溶液处n n用弱酸或弱碱溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理4 4、亲和柱的再生：、亲和柱的再生：三、特点1、只需一步纯化步骤、只需一步纯化步骤2、产物非常纯、产物非常纯3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质、还可去除已变性或部分降解物质四、应用1、分离和纯化、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结、纯化亲和标记的
39、活化中心肽段和蛋白质结构研究构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理、解释酶作用机理实验分离豌豆凝集素n n载体载体 SephdaxSephdax G50 G50n n配基配基 葡聚糖葡聚糖n n洗脱液洗脱液 1mol/L 1mol/L NaClNaCln n特异性洗脱液特异性洗脱液 1mol/L 1mol/L NaClNaCl 0.2mol/L0.2mol/L葡萄糖葡萄糖1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L NaClNaClNaClNaCl杂蛋白1mol/L 1mol/L 1mol/L 1mol/L NaClNaClNaClNaCl
40、0.2mol/L 0.2mol/L 0.2mol/L 0.2mol/L 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖豌豆凝集素活性检测活性检测活性检测活性检测与兔红细与兔红细与兔红细与兔红细胞发生凝胞发生凝胞发生凝胞发生凝集反应集反应集反应集反应离子交换层析ion exchange chromatography一、原理 离离子子交交换换层层析析是是用用离离子子交交换换剂剂（具具有有离离子子交交换换性性能能的的物物质质）作作固固定定相相，利利用用它它与与流流动动相相中中的的某某种种离离子子进进行行可可逆逆的的交换交换性质来分离子型混合物的层析方法。性质来分离子型混合物的层析方法。 低盐高盐分离结束带电荷不同蛋白在特
41、定不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质值下有不同带电性质离子交换树脂如何分离蛋白质离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力二、离子交换剂的类型在在惰性载体惰性载体上引入带有电荷的上引入带有电荷的活性基团活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳离子交换树脂稳定。阳离子交换树脂稳定。胶体胶体1.1.1.1.离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂离子交换
42、树脂：(1)(1)(1)(1)类型类型类型类型聚苯乙烯树脂：聚苯乙烯树脂：聚苯乙烯树脂：聚苯乙烯树脂：（二）按载体种类不同二）按载体种类不同苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯母体母体母体母体交联剂交联剂交联剂交联剂聚丙烯酸聚丙烯酸聚丙烯酸聚丙烯酸阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲基丙烯酸 二乙烯苯二乙烯苯二乙烯苯二乙烯苯特点：高交换量特点：高交换量特点：高交换量特点：高交换量 pH8 pH8 pH8 pH电电荷高者荷高者离子离子大者大者浓度浓度大者大者（4）离子交换树脂对离子的亲和力阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂n n电
43、价数：电价数：电价数：电价数：NaNaNaNa+ + + +CaCaCaCa+AlAlAlAl+TiTiTiTi+n n原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数 LiLiLiLi+ + + +NaNaNaNa+ + + +KKKK+ + + + PbPbPbPb+ + + +阴离子阴离子阴离子阴离子n n强碱性交换树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂CHCHCHCH3 3 3 3COOCOOCOOCOO- - - -FFFF- - - -OHOHOHOH- - - -HCOOHCOOHCOOHCOO- - - -CLCLCLCL- -
44、- -SCNSCNSCNSCN- - - -BrBrBrBr- - - -CrOCrOCrOCrO4 4 4 4= = = =NONONONO3 3 3 3- - - -IIII- - - -CCCC2 2 2 2O O O O4 4 4 4= = = =SOSOSOSO4 4 4 4= = = =n n弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂F F F F- - - - CL CL CL CL- - - - Br Br Br Br- - - -= I= I= I= I- - - - =CH =CH =CH =CH3 3 3 3COOMoCOOMoCOOMoCOOMo4 4 4
45、 4= = = =POPOPOPO4 4 4 4= = = =NONONONO3 3 3 3- - - - 酒石酸根酒石酸根酒石酸根酒石酸根 柠柠柠柠檬酸根檬酸根檬酸根檬酸根CCCC2 2 2 2O O O O4 4 4 4= = = =SOSOSOSO4 4 4 4= = = =OHOHOH4pH4条件下使用条件下使用条件下使用条件下使用, ,具有羧甲基具有羧甲基具有羧甲基具有羧甲基 2.2.离子交换纤维素离子交换纤维素3.3.3.3.离子交换凝胶离子交换凝胶离子交换凝胶离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质分离大分子物质分离大分子物质如：葡聚糖（如：葡聚糖（如：葡聚糖（如：葡聚糖（Se
46、phadexSephadexSephadexSephadex） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGPAGPAGPAG） 琼脂糖（琼脂糖（琼脂糖（琼脂糖（SepharoseSepharoseSepharoseSepharose）操作过程：操作过程： 1.1.装柱；装柱； 2.2.离子交换；离子交换； 3.3.洗脱洗脱 带带电电荷荷量量少少，亲亲和和力力小小的的先先被被洗洗脱脱下下来来，带带电电荷荷量量多多，亲亲和和力力大大的的后被洗脱下来。后被洗脱下来。三、操作注意点（一）离子交换剂的选择一）离子交换剂的选择原则：原则： 根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一
47、一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分分之之间间结结合合力力差差异异大大的的型型号号交交换换剂剂1.1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小 大大分分子子物物质质选选用用凝凝胶胶，其其次次选选用用纤纤维素维素考虑因素：考虑因素：根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件 强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛 弱酸型弱酸型只能在碱性范围内使用只能在碱性范围内使用 弱碱型弱碱型只能在酸性范围内使用只能在酸性范围内使用3.3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理
48、化学性质5.5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量原则原则：不能发生化学反应，避免使样品变性不能发生化学反应，避免使样品变性（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择 原则原则： 所所用用洗洗脱脱液液比比吸吸着着物物质质具具有有更更活活泼泼的离子或基团的离子或基团 改变改变pHpH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱( (三三) )洗脱剂洗脱剂四、应用 分分离离多多肽肽蛋蛋白白、氨氨基基酸酸、核酸及其他带电的生物分子。核酸及其他带电的生物分子。实验：实验： 离子交换层析分离氨基酸离子交换层析分离氨基酸一、原理：一、原理：Dowex50阳离子交换树脂阳离子交换树脂 pH 4.2pH 4.2pIpI 9.7 9.7MrMr 147 147pIpI 2. 97 2. 97MrMr 133 133+-一、操作注意点：一、操作注意点：1、装柱和加样同凝胶层析、装柱和加样同凝胶层析 2、洗脱液、洗脱液(NaOH和柠檬酸和柠檬酸)别混淆别混淆 3、控制流速：、控制流速：20滴滴/min 指出指出2个洗脱峰分别出现在几号管个洗脱峰分别出现在几号管？分别是哪个氨基酸？分别是哪个氨基酸？三、结果要求：三、结果要求：
