细胞生物学技术课件

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1、细胞生物学最常细胞生物学最常用的技术用的技术细胞生物学技术2011年年7月月15-18日北京九华山庄全国细胞生日北京九华山庄全国细胞生物学学术大会物学学术大会细胞生物学技术组织学技术组织学技术细胞生物学技术组织制片技术组织制片技术胚胎学制片技术胚胎学制片技术组织细胞化学技术组织细胞化学技术荧光组织化学及免疫化学技术荧光组织化学及免疫化学技术组织（细胞）培养技术组织（细胞）培养技术各种显微镜技术各种显微镜技术组织学技术包括：组织学技术包括：细胞生物学技术组织制片技术组织制片技术一、组织制片方法分类：大致分类为一、组织制片方法分类：大致分类为超活体染色制片：又称体外活体染色。超活体染色制片：又称体

2、外活体染色。活体染色制片：活体染色制片：分离制片法：分离制片法：涂片法涂片法、印片法、印片法、整装片、整装片、切片法切片法血管注射法；整体切片法；血管注射法；整体切片法；细胞生物学技术（一）、动物处死：（一）、动物处死：直接杀死法：直接杀死法： 用金属器械猛用金属器械猛击动物的后物的后脑 部（第四部（第四脑室区）。室区）。 颈椎断裂椎断裂杀死死动物。物。 空气栓塞空气栓塞组织石蜡标本的制作组织石蜡标本的制作细胞生物学技术麻醉致死麻醉致死：麻醉剂应以不影响细胞原有形态结构为宜，麻醉剂应以不影响细胞原有形态结构为宜，取材越快越好，否则组织和细胞成分构造均易取材越快越好，否则组织和细胞成分构造均易发

3、生变性。发生变性。l乙醚吸入麻醉法乙醚吸入麻醉法l戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法细胞生物学技术（二）、取材：二）、取材：1.动动物物的的选选择择：必必须须根根据据教教学学或或科科研研目目的的和和 要求来确定。要求来确定。 2.取材方法：取材方法：取材顺序：取材顺序：先腹腔：先腹腔：先肝脏、胆囊，其次肾脏、肾上腺，先肝脏、胆囊，其次肾脏、肾上腺，再取胰腺、脾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠。再取胰腺、脾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠。后胸腔及盆腔内器官、组织，后胸腔及盆腔内器官、组织，最后取神经最后取神经。细胞生物学技术例如例如：肝脏：肝脏：大大体体检检查查，又又无无

4、充充血血、脂脂肪肪肝肝变变性性，肝肝硬化、寄生虫、肿瘤。硬化、寄生虫、肿瘤。然然后后取取肝肝右右叶叶或或外外左左叶叶中中部部，作作纵纵切切或或冠状切面。冠状切面。细胞生物学技术胃胃：分贲门、胃底、胃体和幽门，胃取：分贲门、胃底、胃体和幽门，胃取材以空的为好。如有食物，应用生理盐水清材以空的为好。如有食物，应用生理盐水清洗干净，检查是否有充血、溃疡。洗干净，检查是否有充血、溃疡。正常胃粘膜呈灰白色，因正常胃粘膜呈灰白色，因胃腺主要分布在胃胃腺主要分布在胃体和胃底，故取材时一般取胃底和胃体部，体和胃底，故取材时一般取胃底和胃体部，作纵切。作纵切。组织洗干净后放在滤纸上铺开，防止卷缩，组织洗干净后放

5、在滤纸上铺开，防止卷缩，而后投入固定液中。而后投入固定液中。细胞生物学技术贲门、食道贲门、食道交界处交界处胃底部胃底部胃体部胃体部幽门部幽门部胃的取材胃的取材：一般作纵切面：一般作纵切面细胞生物学技术十二指肠十二指肠：一一般般取取降降部部和和水水平平部部，（分分球球部部、降降部部和和水水平平部部）为为了了防防止止肌肌层层收收缩缩时时粘粘膜膜外外翻翻、变变性性，取取材材中中可可将将固固定定液液注注射射进进十十二二指指肠肠中中，两两端端用用线线结结扎扎，投投入入固固定定液液中中4-64-6小小时时后后，除除去去二二端端的的结结扎扎部部位位，做做横横断断切切面面，再继续固定。再继续固定。细胞生物学技

6、术结结肠肠：一一般般取取横横结结肠肠，纵纵切切，洗洗净净，附附贴贴在在滤滤 纸上。纸上。细胞生物学技术肾肾脏脏：由由于于组组织织容容易易出出现现蛋蛋白白质质变变性性、混混浊浊肿肿胀胀和和脂脂变变，有有时时则则出出现现肾肾小小管管自自溶溶，因此取材和固定是关键。因此取材和固定是关键。 a. a.固定后再取材固定后再取材: b. b.沿肾外缘的中部纵剖成两半，然后再沿肾外缘的中部纵剖成两半，然后再做扇形切面做扇形切面.细胞生物学技术固定液从动脉注固定液从动脉注入，从静脉流出入，从静脉流出纵剖成两半，再做扇形切面纵剖成两半，再做扇形切面细胞生物学技术 肺：肺：因主要观察肺内各级支气管和肺泡的结因主要

7、观察肺内各级支气管和肺泡的结构，故不能取边缘，应取肺小叶的中部，一般构，故不能取边缘，应取肺小叶的中部，一般做横切面，能看到全貌（肺内小支做横切面，能看到全貌（肺内小支细支、细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡）。终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡）。可观察到肺内小支、细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡。可观察到肺内小支、细支、终末细支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡。细胞生物学技术脾脏：脾脏：应切断各处静脉放血，必要时可应切断各处静脉放血，必要时可切开脾脏两端，用盐水冲洗，致脾脏呈灰切开脾脏两端，用盐水冲洗，致脾脏呈灰白色。一般做横切面取材。白色。一般做横切面取材。切开两端，放血，用盐水冲洗切开

8、两端，放血，用盐水冲洗细胞生物学技术（三）、（三）、固定固定（Fixation）和）和固定液固定液（Fixative）1.固定的目的和意义固定的目的和意义在于保持组织内细胞的形态、构造及其组成，在于保持组织内细胞的形态、构造及其组成，使其与生活时原有使其与生活时原有形态和结构相似。形态和结构相似。2.固定的方法固定的方法：小块组织固定、小块组织固定、局部注射固定、局部注射固定、整体注射固定、整体注射固定、蒸气固定蒸气固定细胞生物学技术3固定液：分单纯固定液和混合固定液。固定液：分单纯固定液和混合固定液。组织固定剂很多：组织固定剂很多：最常用的有甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸钾、苦最常用的有甲醛、乙醇

9、、丙酮、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、醋酸。味酸、锇酸、醋酸。细胞生物学技术根根据据它它们们对对蛋蛋白白质质的的作作用用又又分分为为能使蛋白质沉淀凝固的：能使蛋白质沉淀凝固的：不能使蛋白质沉淀凝固的不能使蛋白质沉淀凝固的：乙醇、丙酮、苦味酸、铬酸乙醇、丙酮、苦味酸、铬酸甲醛、重铬酸钾、锇酸、醋酸甲醛、重铬酸钾、锇酸、醋酸细胞生物学技术中性甲醛中性甲醛：甲醛（甲醛（37%-40%37%-40%） 100ml 100ml 磷酸二氢钾磷酸二氢钾 4g 4g 磷酸二氢钠磷酸二氢钠 6.5g 6.5g 蒸馏水蒸馏水 900ml 900ml最常用的固定剂最常用的固定剂细胞生物学技术（四）、组织冲洗、脱水与透明（

10、四）、组织冲洗、脱水与透明组织冲洗：一般必须用水冲洗组织冲洗：一般必须用水冲洗其目的其目的a.停止固定液继续对组织的作用停止固定液继续对组织的作用；b.去除组织内固定液，以免影响染色；去除组织内固定液，以免影响染色；细胞生物学技术方方法法简单冲洗简单冲洗系列冲洗系列冲洗细胞生物学技术水槽冲洗水槽冲洗酒精洗涤酒精洗涤细胞生物学技术组织脱水：（组织脱水：（Dehydration）标标本本经经过过固固定定和和冲冲洗洗，组组织织中中含含有有大大量量的的水水分，必须除去组织中的水分，这一过程为脱水。分，必须除去组织中的水分，这一过程为脱水。 脱水剂：脱水剂： 即即能能与与水水在在任任何何条条件件下下混混

11、合合，并并使使组组织织中中的的水水逐逐渐渐出出去去，由由脱脱水水剂剂取取代代组组织织中中的的水水分分，同时又能与透明剂混合。同时又能与透明剂混合。 种类：种类：乙醇、乙醚、正丁醇、异丁醇、二氧氯环等。乙醇、乙醚、正丁醇、异丁醇、二氧氯环等。细胞生物学技术乙醇乙醇丙酮丙酮正丁醇正丁醇细胞生物学技术乙醇：乙醇：即可作固定剂，又可作脱水剂，但乙即可作固定剂，又可作脱水剂，但乙醇与水混合时有较强的物理反应，高浓度醇与水混合时有较强的物理反应，高浓度的酒精对组织有较强的收缩和脆化作用，的酒精对组织有较强的收缩和脆化作用，因此组织不能直接进入纯酒精中脱水，应因此组织不能直接进入纯酒精中脱水，应由由低低高高

12、浓度，逐渐取代组织中的水分，浓度，逐渐取代组织中的水分，以保证组织脱水彻底，避免组织过渡收缩以保证组织脱水彻底，避免组织过渡收缩和硬化。和硬化。细胞生物学技术脱水方法：脱水方法：为减少组织的收缩，浓度应由低向高过渡。为减少组织的收缩，浓度应由低向高过渡。50%70%80%90%95%100%细胞生物学技术 应应根根据据组组织织的的体体积积与与厚厚度度而而定定。时时间间随随组组织织块的体积、厚度的增大而延长。块的体积、厚度的增大而延长。一般：一般：11cm11cm体积体积 50 50、7070、80%80%各各 浸泡浸泡6-86-8小时；小时； 2-3mm 2-3mm厚厚 95% 95%中中 浸

13、泡浸泡2-42-4小时；小时； 纯酒精浸泡纯酒精浸泡1-21-2小时小时；脱水的时间（脱水的时间（ClearingClearing）细胞生物学技术组织透明组织透明 组组织织块块经经脱脱水水后后，需需进进行行石石蜡蜡包包埋埋，然然后后切切片片，但但酒酒精精不不能能与与石石蜡蜡混混合合，需需经经一一种种乙乙醇醇与与石石蜡蜡之之间间的的媒媒介物进行透明，即透明剂。介物进行透明，即透明剂。 透透明明剂剂 可可取取代代组组织织中中的的乙乙醇醇 使使组组织织透透明明，组组织织透透明明后后浸浸入入石石蜡蜡中中，石石蜡蜡可可取取代代组组织织中中的的透透明明剂剂，浸浸入入组织中。组织中。透明剂是石蜡的溶剂。透明

14、剂是石蜡的溶剂。透明剂的种类：最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏透明剂的种类：最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏油等。油等。细胞生物学技术二甲苯：二甲苯： 最最常常用用，易易挥挥发发，透透明明力力强强，能能溶溶于于醇醇及及醚醚，但但不不能能与与水水混混合合，是是石石蜡蜡的的溶溶剂剂。组组织织在在二二甲甲苯苯中中透透明明的的时时间间不不宜宜过过长长，否否则则易易于于收收缩缩、变变硬硬、变变脆脆。故故一一般般在在浸浸入入二二甲甲苯苯前前，应应先先经经二二甲甲苯苯与与酒酒精精混混合合液液，以以减减少少组织的收缩。组织的收缩。细胞生物学技术（五）、组织浸蜡与包埋（五）、组织浸蜡与包埋1.1.浸浸蜡蜡：组组

15、织织经经脱脱水水、透透明明后后，即即进进入入已已溶溶化化了了的的石石蜡蜡中中，熔熔化化的的石石蜡蜡透透过过组组织织间间隙隙，渗渗透透到组织中，然后包埋成组织蜡块。到组织中，然后包埋成组织蜡块。 石蜡分石蜡分：软蜡软蜡，熔点，熔点45-5445-54，用于浸蜡；，用于浸蜡； 硬蜡硬蜡，熔点，熔点56-5856-58或或60-6260-62， 用于包埋。用于包埋。细胞生物学技术软蜡软蜡软蜡软蜡硬蜡硬蜡包埋包埋123软蜡软蜡48-50软蜡软蜡54-56硬蜡硬蜡56-60细胞生物学技术2.包埋包埋：即组织经固定、脱水透明及：即组织经固定、脱水透明及浸蜡后，使蜡浸入组织达饱和状态，浸蜡后，使蜡浸入组织达

16、饱和状态，并连同熔化的蜡一块倾入一个特别的并连同熔化的蜡一块倾入一个特别的包埋框内，冷却后，便凝固成定形的包埋框内，冷却后，便凝固成定形的蜡块。蜡块。细胞生物学技术特制的包埋框特制的包埋框细胞生物学技术纸盒的制作纸盒的制作细胞生物学技术选蜡原则选蜡原则夏天用溶点高的蜡（夏天用溶点高的蜡（60-60-6262）冬天用稍软的蜡即可（冬天用稍软的蜡即可（56-5856-58）包埋：以硬蜡为好。包埋：以硬蜡为好。细胞生物学技术石蜡包埋的操作过程：石蜡包埋的操作过程：3 组织浸蜡至第三号组织浸蜡至第三号蜡中蜡中 装好金属包埋框装好金属包埋框 包埋蜡置电炉上包埋蜡置电炉上溶化，到温度应控溶化，到温度应控制

17、在制在6565左右。左右。 点点燃燃酒酒精精灯灯，准准备备无无齿齿尖尖镊镊子子，写写好好标标签；签； 将熔化的包埋蜡倾入金属包埋框，或纸盒中。倒满将熔化的包埋蜡倾入金属包埋框，或纸盒中。倒满即可。即可。 将将组组织织块块切切面面朝朝下下，放放至至纸纸盒盒中中央央，并并用用镊镊子子轻轻微微压压一一下，然后将标签分别放在蜡块上。下，然后将标签分别放在蜡块上。标标签签细胞生物学技术切切片片铺铺片片烤烤片片细胞生物学技术H-E染色染色1脱蜡脱蜡：二甲苯：二甲苯I液液5-10，II液液5-10。2脱苯脱苯：100%乙醇乙醇8-10。3水化水化：95%乙醇乙醇5，80%乙醇乙醇5。4苏木精苏木精染染5。5

18、分化分化：用：用1%盐酸作用盐酸作用1。6反兰反兰：10-15（流水）。（流水）。7伊红伊红：30-60（30秒为好）秒为好）8脱脱水水：80%乙乙醇醇一一涮涮，95%乙乙醇醇I液液一一涮涮，95%II液液一一涮涮。100%乙醇乙醇I液液7-10，II液液7-10。9二甲苯透明二甲苯透明：I液中液中7-10，II液中液中7-10。封片封片细胞生物学技术免疫组织（细胞）化学免疫组织（细胞）化学免免疫疫组组织织化化学学（immunohistochemistry）又又称称免免疫疫细细胞胞化化学学（immunocytochemistry）是是利利用用特特异异性性抗抗原原抗抗体体反反应应原原理理，在在原

19、原位位观观察察和和研研究究组组织织细细胞胞内内，有有关关特特定定的的抗抗原原或或抗抗体体的的存存在在和和分分布布，并并进进行行定定量量的的技技术术。由由于于抗抗原原抗抗体体的的结结合合是是高高度度特特异异的的，因因此此免免疫疫组组织织化化学学方方法法具具有有高高度度的的特特异异性性、灵灵敏敏性性和和精精确确性。性。细胞生物学技术免疫组织化学包括的内容免疫组织化学包括的内容抗抗原原抗抗体体的的制制备备抗抗体体标标记记免免疫疫染染色色观观察察分分析析细胞生物学技术免疫细胞化学的优点免疫细胞化学的优点灵敏度灵敏度高高特异性强特异性强定位准确定位准确应用广泛应用广泛细胞生物学技术 组织材料的制备组织材

20、料的制备免免疫疫组组织织化化学学不不仅仅要要求求保保存存细细胞胞、组组织织内内形形态态结结构构的的完完整整性性还还需需要要保保存存细细胞胞和和组组织织内内抗抗原原的的免免疫疫性性活活性性，因因此此在在组组织织材材料料的的制制备备中中有一定的特殊要求。有一定的特殊要求。细胞生物学技术取材取材固定固定脱水脱水浸透浸透包埋包埋切片切片细胞生物学技术 免疫组化的染色原理与方法免疫组化的染色原理与方法免免 疫疫 组组 织织 化化 学学 染染 色色 又又 称称 免免 疫疫 染染 色色（immunostainig）根根据据标标记记的的抗抗体体的的不不同同，可分为几种如：可分为几种如：1.1.直直接接法法（一

21、一步步法法）：将将标标记记物物标标记记在在特特异异性性抗抗体体上上（一一抗抗），便便可可直直接接与与细细胞胞或或组组织织内的相应抗原特异性结合而被显示；内的相应抗原特异性结合而被显示；细胞生物学技术2间间接接法法（二二步步法法）：将将标标记记物物标标记记到到抗抗特特异性抗体的抗体（二抗）上；异性抗体的抗体（二抗）上；3桥桥连连法法（多多步步法法）：用用与与一一抗抗同同种种动动物物产产生生的的抗抗标标记记物物抗抗体体与与标标记记物物形形成成免免疫疫复复合合物物（PAP,APAAP），再），再通过桥抗体与一抗相连通过桥抗体与一抗相连。4ABC法法：利利用用生生物物素素、抗抗生生物物素素间间亲亲和和

22、特特性性建立的方法。建立的方法。细胞生物学技术固定剂的种类：固定剂的种类：醛类固定剂：醛类固定剂： 10%10%的中性福的中性福尔尔马林、林、 4% 4%多聚甲多聚甲醛磷酸磷酸缓冲液冲液 非醛类固定剂：非醛类固定剂： 丙酮丙酮 CarnoyCarnoy氏液，氏液， 细胞生物学技术一、一、免疫酶组织化学染色法免疫酶组织化学染色法（一）、酶标抗体法（一）、酶标抗体法1原原理理：酶酶标标抗抗体体染染色色分分为为直直接接法法和和间间接接法法直直接接法法：将将酶酶标标记记在在第第一一抗抗体体上上，直直接接检检测测细细胞胞和和组组织织内内特特异异性性抗抗原原。该该法法简简便便、特特异异性性强强、需需时时短

23、短、但但敏敏感感性性低低，其其缺缺点点是是每每一一种种抗抗原原都都需需要要用用酶酶标标记记的的特特异异性性抗抗体体，且且抗抗体体需需要要量大，现已不常用。（图）量大，现已不常用。（图）细胞生物学技术组织抗原组织抗原抗体抗体标记物标记物直接标记法直接标记法细胞生物学技术间接法：间接法：所所用用的的第第一一抗抗体体是是细细胞胞组组织织内内抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体，第第二二抗抗体体是是第第一一抗抗体体的的抗抗体体，并并且且已已用用酶酶标标记记。（图图）优优点点是是一一种种酶酶标标记记抗抗体体可可以以与与多多种种一一抗抗配配合合检检测测，敏敏感感性性高高于于直直接接法法。第第二二抗抗体体与与第

24、第一一抗抗体体必必须须是是不不同同种种属属动动物物制制备备的的，因因第第二二抗抗体体往往往往是是用用第第一一种种动动物物的的IgG所所制制备备，否否则则就就不不能能检检测测出出不不同同特特异异性抗原的存在。性抗原的存在。细胞生物学技术第一抗体：是细胞第一抗体：是细胞内抗原的特异性抗内抗原的特异性抗体体标记酶的二抗：标记酶的二抗：是一抗的抗体是一抗的抗体抗原抗原间接法间接法细胞生物学技术2显色反应显色反应免免疫疫组组织织化化学学方方法法最最终终的的生生成成物物是是带带有有酶酶标标记记的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物，再再依依据据酶酶与与底底物物作作用用生生成成不不溶溶性性的的有有色色沉沉淀淀产产

25、物物沉沉积积在在抗抗原原反反应应的的位位置置，并并借借此此确确定定该该抗抗原原的性质、存在部位的含量。反应原理如下：的性质、存在部位的含量。反应原理如下：HRP:HRP与与 底底 物物 过过 氧氧 化化 氢氢 和和 DAB(3,3-diaminobenzidine,二二氨氨基基联联苯苯胺胺)作作用用反反应应产产物物呈呈棕棕褐褐色。色。HRP+H2O2HRP H2O2+DH2(还原型供氢体还原型供氢体)HRP+2H2O+D(氧化型供氢体氧化型供氢体)细胞生物学技术组织抗原组织抗原抗体抗体标记物标记物直接标记法直接标记法DAB显色原理显色原理细胞生物学技术抗抗 生生 物物 素素 -过过 氧氧 化化

26、 物物 酶酶 复复 合合 物物 技技 术术（avidin-biodin-peroxidasecomplextechnique,ABC技术技术）1原理原理抗抗生生素素（avidin又又称称卵卵白白素素或或亲亲和和素素）是是一一种种糖糖蛋蛋白白，分分子子量量为为68KD，与与生生物物素素有有特特殊殊的的亲亲和和力力（亲亲和和常常数数为为1015M-1）,这这种种特特殊殊的的结结合合是是不不可可逆逆的的，同同时时又又不不影影响彼此的生物活性。响彼此的生物活性。细胞生物学技术由由于于抗抗生生素素分分子子有有4个个相相同同的的亚亚基基，是是生生物物素素的的结结合合位位点点，这这样样它它就就可可以以同同时

27、时与与带带有有生生物物素素分分子子的的大大多多数数蛋蛋白白质质相相结结合合（包包括括抗抗体体和和酶酶），使使抗抗生生素素和和生生物物素素标标记记的的酶酶之之间间形形成成大大分分子子复复合合物物，如如ABC，而而在在这这个个巨巨大大复合物中的过氧化酶活性并不受影响。复合物中的过氧化酶活性并不受影响。细胞生物学技术1方法与步骤方法与步骤ABC法法 是是先先将将生生物物素素与与过过氧氧化化物物酶酶偶偶联联起起来来，再再将将抗抗生生物物素素与与生生物物素素结结合合的的过过氧氧化化酶酶按按比比例例亲亲和和组组成成抗抗生生物物素素-生生物物素素-过过氧氧化化酶酶复复合合物物（ABC）从从而而保保证证抗抗生

28、生物物素素保保留留一一定定的的游游离离结结合合位位点点，再再与与事事先先制制备备的的生生物物素素偶偶联联的的抗抗体体结结合合（此此抗抗体体为为二二抗抗）由由于于抗抗生生物物素素有有4个个生生物物素素的的结结合合位位点点，所所以以抗抗生生物物素素可可作作为为桥桥梁梁，将将生生物物素素偶偶联联的的抗抗体体和和生生物物素素偶偶联联的酶联在一起。的酶联在一起。细胞生物学技术亲和素亲和素生物素生物素辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶生物素标记生物素标记的二抗的二抗ABC复合物复合物组织上的一抗组织上的一抗ABC过氧化物酶法过氧化物酶法细胞生物学技术生生物物素素-抗抗生生物物素素系系统统用用于于免免疫疫组组织织

29、化化学学检检测测的的主主要要 有有 两两 种种 ： a.标标 记记 抗抗 生生 物物 素素 生生 物物 素素 技技 术术(labeledavidin-biotintechnique,LAB)，即即以以生生物物素素标标记记第第一一抗抗体体，酶酶标标抗抗生生物物素素作作为为第第二二抗抗体体，利利用用生生物物素素抗抗生生物物素素的的亲亲和和结结合合，以以显显示示被被检检测测的的抗抗原原； b. 桥桥式式抗抗生生物物素素-生生物物素素技技术术（bridgedavidin-biotintechnique,BRAB）,使使用用生生物物素素分分别别标标记记抗抗体体和和酶酶，然然后后以以抗抗生生物物素素为为桥

30、桥，把两者连接起来，以显示被检测的抗原。把两者连接起来，以显示被检测的抗原。细胞生物学技术生物素生物素酶酶抗生物素抗生物素生物素标记一抗生物素标记一抗酶标记抗生物素酶标记抗生物素标记抗生物素标记抗生物素生物素技术生物素技术细胞生物学技术生物素生物素酶酶抗生物素抗生物素生生物物素素抗抗体体复合物复合物生生物物素素酶酶复复合物合物以抗生素为桥连接两个复合物以抗生素为桥连接两个复合物桥式抗生物素桥式抗生物素-生物素技术（生物素技术（BRAB）细胞生物学技术重症妊娠中毒症子宫蜕膜重症妊娠中毒症子宫蜕膜IGF-1的表达的表达细胞生物学技术重症妊娠中毒症绒毛膜重症妊娠中毒症绒毛膜IGF-1的表达的表达细胞

31、生物学技术细胞生物学技术3高分化鳞癌高分化鳞癌survivin表达表达4低分化鳞癌低分化鳞癌survivin表达表达1正常组织阴性对照正常组织阴性对照2高分化鳞癌高分化鳞癌HE细胞生物学技术二、二、免疫金免疫金-银染色法银染色法免免疫疫金金-银银染染色色法法（immunogold-silverstaining,IGSS）是是一一种种较较新新的的免免疫疫组组织织化化学学技术。技术。原理：原理：IGS法法是是在在特特异异性性抗抗体体与与抗抗原原结结合合后后，再再用用金金标标记记的的间间接接抗抗体体或或金金标标记记的的葡葡萄萄球球菌菌A蛋蛋白白与与特特异异性性抗抗体体Fc段段结结合合。所所用用的的标

32、标记记胶胶体体金金颗颗粒粒直直径径在在20nm以以上上时时，可可在在光光镜镜下下见见到红色的反应物，这就为免疫金法。到红色的反应物，这就为免疫金法。细胞生物学技术IGSS原理原理通通过过抗抗原原抗抗体体反反应应沉沉淀淀在在抗抗原原位位置置的的胶胶体体金金颗颗粒粒，可可吸吸附附大大量量的的还还原原银银原原子子，并并在在金金颗颗粒粒周周围围形形成成一一个个“银银壳壳”，在抗原存在的部位成黑褐色。，在抗原存在的部位成黑褐色。细胞生物学技术组织切片组织切片AgAbGAbGPSP免免疫疫金金银银染染色色法法细胞生物学技术三、三、铁标记法铁标记法四、四、免疫荧光染色法免疫荧光染色法原原理理：在在已已知知的

33、的抗抗体体或或抗抗原原分分子子标标记记上上荧荧光光素素，再再与与其其相相应应的的抗抗原原或或抗抗体体起起反反应应，所所形形成成的的免免疫疫复复合合物物上上带带有有一一定定的的荧荧光光素素，在在荧荧光光显显微微镜镜下下即即可观察到待测的抗原或抗体。可观察到待测的抗原或抗体。五、五、双重或多重免疫染色法双重或多重免疫染色法是是在在同同一一张张组组织织切切片片上上同同时时进进行行或或先先后后显显示示两两种种或或两两种种以以上上的的抗抗原原成成分分。可可以以在在同同一一个个标标本本上上同同时了解不同细胞或组织与相关抗原的相互关系。时了解不同细胞或组织与相关抗原的相互关系。细胞生物学技术胶体铁显示淋巴细

34、胞的粘多糖胶体铁显示淋巴细胞的粘多糖细胞生物学技术免疫荧光染色免疫荧光染色细胞生物学技术染色对照与非特异性染色染色对照与非特异性染色一、一、染色对照染色对照免免疫疫组组织织化化学学必必须须设设对对照照组组，包包括括阳阳性性对对照照和阴性对照。和阴性对照。细胞生物学技术（一）（一）阳性对照阳性对照用用已已知知含含有有靶靶抗抗原原的的组组织织切切片片与与待待测测切切片片同同步步进进行行免免疫疫染染色色，前前者者结结果果为为阳阳性性，称称为为阳阳性性对对照照。每每一一批批试试验验，每每一一个个浓浓度度都都必必须须作作阳阳性性对对照照。阳阳性性对对照照的必要性：的必要性：1可证实靶抗原的存在与否；可证

35、实靶抗原的存在与否；2可检测所用抗体、试剂、染色步骤是否可靠；可检测所用抗体、试剂、染色步骤是否可靠；3可排除待检测片的假阴性的结果；可排除待检测片的假阴性的结果；4阳阳性性对对照照如如果果出出现现了了阴阴性性，说说明明可可能能在在抗抗原原保保存存、抗抗体体效效价价、或或染染色色等等某某一一方方面面存存在在问问题题，需需要要改正后再重新做试验。改正后再重新做试验。细胞生物学技术阴性对照阴性对照阴性对照亦是不可缺少的环节。包括几种：阴性对照亦是不可缺少的环节。包括几种：无靶抗原对照无靶抗原对照 空白对照空白对照 替代对照替代对照细胞生物学技术吸收试验吸收试验用用过过量量的的纯纯化化抗抗原原与与相

36、相应应的的第第一一抗抗体体充充分分反反应应，使使抗抗原原上上的的结结合合位位点点全全部部与与抗抗体体结结合合，这这种种对对抗抗原原吸吸收收饱饱和和了了的的抗抗体体不不再再能能与与组组织织内内的的抗抗原原起起反反应应，用用这这种种抗抗体体再再进进行行免免疫疫染染色色，其其结结果果为为阴阴性性。如如果果再再出出现现阳阳性性说说明抗体不纯。明抗体不纯。细胞生物学技术 抑制试验抑制试验用用于于检检测测抗抗原原、抗抗体体的的特特异异性性。既既先先将将未未标标记记的的第第一一抗抗体体滴滴加加在在组组织织切切片片上上进进行行充充分分反反应应，再再用用标标记记的的第第一一抗抗体体滴滴加加同同一一组组织织切切片

37、片上上进进行行第第二二次次免免疫疫染染色色，结结果果为为阴阴性性或或明明显显减减弱弱。说说明明第第一一次次的的免免疫疫染染色色，因因为为标标记记的的特特异异性性抗抗血血清清已已经经先先与与切切片片上上的的靶靶抗抗原原结结合合，所所以以第第二二次次免免疫疫染染色色时时，后后加加的的标标记记抗体不能再与靶抗原结合，故呈抗体不能再与靶抗原结合，故呈阴性阴性结果。结果。细胞生物学技术未标记抗体未标记抗体标记抗体标记抗体抑制试验抑制试验抗原抗原细胞生物学技术二、二、非特异染色及其清除非特异染色及其清除免免疫疫组组织织化化学学是是利利用用抗抗原原抗抗体体的的特特异异性性反反应应来来显显示示抗抗原原或或抗抗

38、体体的的定定位位。因因此此，凡凡是是不不属属于于特特异异染染色色的的一一切切染染色色都都属属于于非非特特异异性性染染色色，它它们们可造成可造成“假阳性假阳性”结果必须进行清除。结果必须进行清除。细胞生物学技术非特异性染色的原因很多：非特异性染色的原因很多： 可以是靶细胞、组织的内在干扰；可以是靶细胞、组织的内在干扰； 可以是标记物本身的干扰；可以是标记物本身的干扰； 抗体自身的干扰；抗体自身的干扰； 抗体与靶细胞组织相互的干扰；抗体与靶细胞组织相互的干扰； 因因此此，清清除除非非特特异异性性染染色色对对于于提提高高免免疫疫染色效果和正确评价免疫结果十分重要。染色效果和正确评价免疫结果十分重要。

39、细胞生物学技术例如：例如：内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶体体内内的的某某些些细细胞胞组组织织内内都都含含有有过过氧氧化化物物酶酶，如如中中性性粒粒细细胞胞中中的的髓髓过过氧氧化化物物酶酶、单单核核细细胞胞、嗜嗜酸酸粒粒细细胞胞和和组组织织含含有有的的过过氧氧化化物物酶酶，都都可可与与过过氧氧化化氢氢反反应应，使使DAB还还原原为为棕棕色色产产物物，与与真真正正的的免免疫疫酶酶法法的的棕棕色色产产物物相相混混淆淆，造造成成假假阳阳性性结结果果。所所以以在在染染色色前前应应进进行行封封闭闭，去去除除内内源源性性过过氧氧化化物物酶酶的活性。的活性。细胞生物学技术细胞凋亡的研究方法细胞凋亡的研究方法

40、细胞生物学技术第一章第一章细胞凋亡研究方法的选择细胞凋亡研究方法的选择研究方法的分类：研究方法的分类：一、根据方法的定性和定量特性分类一、根据方法的定性和定量特性分类只能定性的方法只能定性的方法定量或半定量的方法定量或半定量的方法细胞生物学技术二、根据是否能将凋亡和坏死区分开分类二、根据是否能将凋亡和坏死区分开分类1不不能能将将凋凋亡亡和和坏坏死死区区分分开开原原位位末末端端标记法，标记法，PI单染色法流式细胞仪检测等。单染色法流式细胞仪检测等。2能将凋亡和坏死区分开能将凋亡和坏死区分开琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳，形态学观察电泳，形态学观察(特别是透射电镜是区特别是透射电镜是区别凋亡和坏死最可靠

41、的方法别凋亡和坏死最可靠的方法)，Hoechst33342PI双染色法流式细胞仪检双染色法流式细胞仪检测，测，AnnexinVPI双染色法流式细胞仪双染色法流式细胞仪检测等。检测等。细胞生物学技术三、根据样本来源不同选用不同的方法分类三、根据样本来源不同选用不同的方法分类 组组 织织培培 养养 细细 胞胞细胞生物学技术第二章第二章富集或分离凋亡细胞富集或分离凋亡细胞一一、利利用用死死、活活细细胞胞对对胰胰蛋蛋白白酶酶和和DNA酶的敏感性差异酶的敏感性差异(一一)原理原理1.活活细细胞胞对对胰胰蛋蛋白白酶酶和和DNA酶酶不不敏敏感感，活活细细胞胞具具有有完完整整细细胞胞膜膜结结构构，对对细细胞胞

42、具有保护作用。具有保护作用。2.2.死死细细胞胞细细胞胞膜膜受受损损，细细胞胞极极易易被被二二酶消化。酶消化。 细胞生物学技术(二二)材料材料1胰胰蛋蛋白白酶酶(Trypsin)浓浓度度为为05，以以Hanks液液配配制制，30存放。存放。2脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸酶酶(DNase)浓浓度度为为20ul/ml，以以Hanks液液(内内含含Ca2+，Mg2+)配制，配制，30存放。存放。(三三)方法方法1离离心心收收集集细细胞胞(1000-2000rmin，510min，实实体体瘤瘤或或组组织织必必须先机械分散须先机械分散)，以，以Hanks液配制成液配制成02ml悬液悬液(106细胞细胞)

43、。2加加100ulDNaseI(终终浓浓度度67ug/ml)，37温温育育15min，再再加加入入100ul胰蛋白酶胰蛋白酶(终浓度终浓度125mgm1)，37继续温育继续温育30min。3.加加5ml含含10小小牛牛血血清清的的Hanks液液终终止止Trypsin及及DNaseI酶酶反反应，离心收集细胞。应，离心收集细胞。4以以Hanks液洗涤液洗涤2-3次后，细胞重悬于次后，细胞重悬于Hanks液备用。液备用。细胞生物学技术本本法法富富集集细细胞胞80-90以以上上排排斥斥台台盼盼蓝蓝及及PropidiumIodide(P1)染染色色的的细细胞胞为为活活细细胞胞，或或早早期期凋凋亡亡细细胞

44、胞，适适用用于于凋凋亡亡细细胞胞的的进进一一步步分分析析，如如固固定定后后涂涂片片或或制制作作成成电电镜镜切切片片观观察察形形态态，荧荧光光染染色色进进行行流流式细胞光度学分析等。式细胞光度学分析等。细胞生物学技术凋亡细胞具有完凋亡细胞具有完整细胞膜结构整细胞膜结构排斥胎盘兰染色排斥胎盘兰染色坏死细胞被胎盘兰染色坏死细胞被胎盘兰染色坏死细胞细坏死细胞细胞膜受损，胞膜受损，易受酶的消易受酶的消化化细胞生物学技术二、二、percoll密度梯度离心法密度梯度离心法(一一)原原理理：Percoll是是一一种种密密度度梯梯度度介介质质，由由聚聚乙乙烯烯吡吡咯咯烷烷酮酮包包裹裹的的硅硅胶胶颗颗粒粒组组成成

45、，不不粘粘附附细细胞胞膜膜，对对细细胞胞无无毒毒性性，可可形形成成等等渗渗、均均一一的的密密度度梯梯度度。由由于于凋凋亡亡细细胞胞全全面面固固缩缩、浓浓聚聚而而密密度度增增高高，因因此此利利用用坏坏死死、活活细细胞胞和和凋凋亡亡细细胞胞的的密密度度差差异异经经PercollPercoll密密度度梯梯度度离离心心分分离离富富集集凋凋亡亡细细胞。胞。细胞生物学技术percoll密度梯度离心法密度梯度离心法80%-90%的凋亡的凋亡细胞沉积在底部细胞沉积在底部细胞生物学技术凋亡细胞的形态学检测凋亡细胞的形态学检测细胞生物学技术比比较较核变化发生在早期核变化发生在早期以固缩核变化为主以固缩核变化为主细

46、胞生物学技术根根据据细细胞胞凋凋亡亡与与坏坏死死的的形形态态学学特特征征，目目前前已已经经设计出许多不同的细胞凋亡形态学研究方法。设计出许多不同的细胞凋亡形态学研究方法。第一节第一节普通光学显微镜观察方法普通光学显微镜观察方法一、倒置显微镜的观察一、倒置显微镜的观察结结果果分分析析：凋凋亡亡细细胞胞的的胞胞膜膜结结构构和和功功能能仍仍保保持持完完整整无无损损，皱皱缩缩外外突突(blebbins)可可有有突突起起，细细胞胞体体积积变变小小，全全面面皱皱缩缩(shrinkage)；凋凋亡亡小小体体为为数数个个圆圆形形小小体体围围绕绕在在细细胞胞周周围围，其其折折光光性性与与正常细胞一致。正常细胞一

47、致。细胞生物学技术二、苏木素二、苏木素伊红染色伊红染色(HE染色法染色法)1.石蜡组织切片的石蜡组织切片的HE染色染色（略）（略）结结果果判判断断：光光学学显显微微镜镜下下细细胞胞核核呈呈蓝蓝黑黑色色，胞胞浆浆呈呈淡淡红红色色。凋凋亡亡细细胞胞在在组组织织中中单单个个散散在在分分布布，表表现现为为核核染染色色质质致致密密浓浓缩缩，核核碎碎裂裂等等。坏坏死死组组织织则则呈呈匀质红染的无结构物质，核染色消失。匀质红染的无结构物质，核染色消失。细胞生物学技术HE-染染色色细细胞胞凋凋亡亡细胞生物学技术2细胞爬片或细胞涂片的细胞爬片或细胞涂片的HE染色染色(1)细胞爬片或细胞涂片的制备：细胞爬片或细胞

48、涂片的制备：(2)结果判断：细胞爬片上，凋亡的结果判断：细胞爬片上，凋亡的细胞变圆、变小，细胞核固缩、碎裂，细胞变圆、变小，细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见染色体被染成深蓝色或蓝黑色；可见细胞膜皱褶、卷曲和出泡，以及芽生细胞膜皱褶、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体形成膜包裹的凋亡小体(apoptoticbodies)。细胞生物学技术HE染色的凋亡细胞染色的凋亡细胞细胞生物学技术HE-染色细胞调亡染色细胞调亡细胞生物学技术HL-60细胞细胞50mol/L表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（etoposide)处理处理6小时后，出现小时后，出现大量的凋亡细胞（大量

49、的凋亡细胞（A),少量的活细胞少量的活细胞(L)，一些坏死细胞（，一些坏死细胞（N)。细胞生物学技术1.TdT介导的介导的dUTP缺口缺口末端标记技术显示凋亡末端标记技术显示凋亡2.BrdU标记法显示标记法显示细胞凋亡细胞凋亡细胞生物学技术三、甲基绿三、甲基绿派诺宁染色法派诺宁染色法原理：原理：细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。表达的增强。而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程，而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有细胞质内常有RNA的损失。的损失。细胞生物学

50、技术原理：原理：根据甲基绿对根据甲基绿对DNA染色的特异性和派染色的特异性和派诺宁对诺宁对RNA的亲和性这一特点，可使的亲和性这一特点，可使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。染色者为坏死细胞。细胞生物学技术光学显微镜下凋亡细胞固缩，细胞核光学显微镜下凋亡细胞固缩，细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞核呈绿着染，坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染。色着染。四、四、C

51、iemsa染色染色一般用于血液和造血组织来源的细一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。胞或白血病细胞的染色。 五、瑞氏五、瑞氏(Wright)(Wright)染色染色 细胞生物学技术电子显微镜观察细胞凋亡电子显微镜观察细胞凋亡透射显微镜观察方法透射显微镜观察方法透透射射电电镜镜是是观观察察细细胞胞凋凋亡亡最最可可靠靠的的方方法法，凋凋亡亡细细胞胞在在透透射射电电镜镜下下其其形形态态学学改改变变具具有有特特征征性性。在在细细胞胞凋凋亡亡的的早早期期，细细胞胞核核染染色色体体发发生生边边集集，在在细细胞胞核核膜膜周周边边聚聚集集形形成成新新月月体体形形；随随之之染染色色体体发发生生固

52、固缩缩，显示电子密度增强，核形不规整显示电子密度增强，核形不规整等。等。细胞生物学技术细胞生物学技术细胞生物学技术细胞生物学技术细胞生物学技术细胞生物学技术荧光显微镜观察凋亡细胞荧光显微镜观察凋亡细胞原理一：原理一：荧光素荧光素(fluorochrome)是一种染料，它可是一种染料，它可以吸收激发光的光能和发射荧光。一定的以吸收激发光的光能和发射荧光。一定的荧光素可以与组织或细胞的某些成分荧光素可以与组织或细胞的某些成分(如染如染色体色体)中的分子或功能基团进行特异性结合，中的分子或功能基团进行特异性结合，可呈现一定颜色的荧光。可呈现一定颜色的荧光。细胞生物学技术原理二：原理二：许许多多荧荧光

53、光化化合合物物可可嵌嵌入入DNA分分子子或或以以静静电电相相互互作作用用与与DNA分分子子结结合合，可可用用作作细细胞胞DNA的的荧荧光光探探针针。用用DNA荧荧光光探探针针染染凋凋亡亡细细胞胞DNA，即即可可在在荧荧光光显显微微镜镜下下直直接接观观察察核核形形态态变化变化。细胞生物学技术5-溴脱氧尿嘧啶核苷诱导溴脱氧尿嘧啶核苷诱导MKN45细胞凋亡核细胞凋亡核DAPI荧光染色荧光染色细胞生物学技术BrdU标记法显示细胞凋亡标记法显示细胞凋亡细胞生物学技术常用的荧光染色方法常用的荧光染色方法吖吖啶啶橙橙的的荧荧光光随随pH而而变变，其其正正色色为为绿绿色色，随随pH下下降降可可变变到到橙橙红红

54、色色。吖吖啶啶橙橙与与DNA和和RNA通通过过两两个个部部位位结结合合，连连接接碱碱基基对对和和磷磷酸酸盐盐基基团团，吖吖啶啶橙橙与与碱碱基基对对结结合合，形形成成第第一一复复合合物物。第第二二复复合合物物在在多多核核苷苷酸酸表表面面，由由吖吖啶啶橙橙与与磷磷酸酸盐盐基基团团连连接接而而成成。pH6.0时时，DNA结结合合染染料料的的聚聚合合加加速速，pH低低于于3.8时时，聚聚合合受受抑抑制制，但但RNA在在pH6.0和和3.8都能聚合，而使颜色变红。都能聚合，而使颜色变红。细胞生物学技术1吖啶橙染色法吖啶橙染色法（1）试试剂剂及及配配制制吖吖啶啶橙橙贮贮存存液液：10mg吖吖啶啶橙橙溶溶解

55、解于于100mlPBS中中，pH4860滤滤过过，4避光保存。避光保存。（2）操作方法）操作方法制备活细胞悬液，浓度约为制备活细胞悬液，浓度约为107ml。取取95 l的的细细胞胞悬悬液液，加加5 l的的吖吖啶啶橙橙贮贮存存液液混混匀。匀。吸吸一一滴滴混混合合液液点点在在洁洁净净玻玻片片上上，直直接接用用盖盖玻玻片封片。片封片。细胞生物学技术结果判断结果判断:在荧光显微镜下，细胞核在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色为黄色或黄绿色均匀荧光或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。为桔黄或桔红色荧光。出现细胞出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密凋亡时，细胞核或细

56、胞质内可见致密浓染的浓染的黄绿色染色黄绿色染色，甚或见黄绿色碎，甚或见黄绿色碎片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色或片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失。桔黄色荧光均可减弱或消失。细胞生物学技术凋亡细胞的丫啶橙凋亡细胞的丫啶橙/溴化乙锭染色。活细胞呈现均匀的绿色；溴化乙锭染色。活细胞呈现均匀的绿色；凋亡细胞凝集的染色质呈现黄色的斑点；凋亡细胞由于失去凋亡细胞凝集的染色质呈现黄色的斑点；凋亡细胞由于失去膜的整合性，与溴化乙锭共染时呈现橙色。膜的整合性，与溴化乙锭共染时呈现橙色。细胞生物学技术2Hoechst33258染色法染色法Hoechst33258及及33342两两者者均均为为

57、特特异异性性DNA染染料料，与与AT键键结结合合，但但在在pH20环环境境下下则则优优先先与与RNA结结合合。因因此此，染染色色DNADNA时时，应应调调整整染染液液的的pHpH直至直至7.07.0。细胞生物学技术（1）试剂及配制）试剂及配制Hoechst33258贮贮存存液液：称称取取Hoechst33258试试剂剂1mg，用用20ml蒸蒸馏馏水水溶溶解解后后，滤滤过过，4避避光光保存。用时蒸馏水保存。用时蒸馏水10倍稀释成染色液。倍稀释成染色液。 PBS(无无Ca2+，Mg2+)，p1H72。 封封 片片 液液 (pH5 5)： 20mmol L柠柠 檬檬 酸酸 ，50mmolL磷酸氢二钠

58、，磷酸氢二钠，50甘油。甘油。 细胞固定液：甲醇冰乙酸细胞固定液：甲醇冰乙酸(3：1)，现配。，现配。细胞生物学技术 结果判断结果判断在在荧荧光光显显微微镜镜下下，活活细细胞胞核核呈呈弥弥散散、微微弱弱、均均匀匀荧荧光光，出出现现细细胞胞凋凋亡亡时时，胞胞核核或或胞胞质质内内可可见见浓浓染染致致密密的的颗颗粒粒块块状状荧荧光光(蓝蓝色色)及及明明显显核核形形态态变变化化，如如果果见见到到3个个或或3个个以以上上的的DNA荧荧光光碎碎片片被被认认为为是是凋亡细胞。凋亡细胞。细胞生物学技术凋亡细胞凋亡细胞Hoechst染色。正常细胞核均匀着色，凋染色。正常细胞核均匀着色，凋亡细胞由于染色质凝聚及核

59、裂解其核着色不规则。亡细胞由于染色质凝聚及核裂解其核着色不规则。对照对照凋亡凋亡细胞生物学技术凋亡细胞生化特征检测方法凋亡细胞生化特征检测方法超速离心法超速离心法原原理理以以氯氯化化铯铯(CsCl)连连续续梯梯度度超超速速离离心心，结结合合溴溴化化乙乙啶啶(ethidiumbromide，EB)染染色色，可可清清楚楚看看到到DNA片片段段的的分分带带。超超速速离离心心不不仅仅能能分分离离纯纯化化DNA、区区分分开开环环和和闭闭环环DNA，而而且且也也可可以以用用于于凋凋亡亡细细胞胞染色质染色质DNA的片段化检测。的片段化检测。细胞生物学技术琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法一、基本原理一、基本原

60、理琼脂糖琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺凝胶电或聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(PAGE)是是分离、鉴定分离、鉴定和和纯化纯化DNA片段片段的标准方法。直接用低浓度的荧光嵌入的标准方法。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶进行染色，可以确定染料溴化乙啶进行染色，可以确定DNA在凝胶中的位置。在凝胶中的位置。 细胞生物学技术DNA提取提取(1)收集细胞收集细胞(2)PBS洗一次洗一次(3)加细胞核裂解液加细胞核裂解液500l重悬细胞，重悬细胞，(4)加加05ml平衡酚抽提，平衡酚抽提，(5)加加05ml氯仿：异戊醇抽提，氯仿：异戊醇抽提，(6)加加50l的的3molL乙酸乙酸钠和钠和2ml预冷无预冷无水

61、乙醇水乙醇, ,可见絮状白色沉淀物。可见絮状白色沉淀物。细胞生物学技术(7)置置液液氮氮5-10min，12000rmin离离心心10min沉沉淀淀DNA，去去上上清清，真真空空抽抽干干或或风风扇扇下下吹吹干干残存液体。残存液体。(8)加加50-100 lTE缓缓冲冲液液，另另加加5 lRNase，37水浴水浴30min。(9)取取20 l加加上上样样缓缓冲冲液液2-5 l上上样样，1琼琼脂脂糖凝胶电泳糖凝胶电泳(电压电压50V，15-2h)，UV下观察。下观察。凋凋亡亡细细胞胞的的DNA因因为为DNA降降解解成成规规则则的的大大片片段段以以及及180-200bp或或其其多多聚聚体体组组成成的

62、的寡寡核核苷苷酸酸片段而呈片段而呈“梯状梯状”条带。条带。细胞生物学技术细胞生物学技术结果判定：结果判定： 正常活细胞正常活细胞DNA基因组条带由于分子基因组条带由于分子量大，迁移距离短，所以停留在加样孔量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近。附近。 坏死细胞由于其坏死细胞由于其DNA的不规则降解显的不规则降解显现一条连续的膜状条带，现一条连续的膜状条带， 凋凋亡亡细细胞胞的的DNA因因为为DNA降降解解成成规规则则的的大大片片段段以以及及180-200bp或或其其多多聚聚体体组组成成的寡核苷酸片段而呈的寡核苷酸片段而呈“梯状梯状”条带。条带。细胞生物学技术细胞生物学技术原位末端标记技术原理原

63、位末端标记技术原理原位末端标记原位末端标记(insituendlabeling，ISEL)是将是将掺入到凋亡细胞中的外源性掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸核苷酸在酶如末端脱氧核苷酸转移酶在酶如末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase，TDT)、DNA聚合酶聚合酶I或或Klenow大片段等的催化下大片段等的催化下与凋亡细胞与凋亡细胞( (因内源性核酸酶的激活而产生因内源性核酸酶的激活而产生) )的单的单股或双股断链相结合，股或双股断链相结合，再通过一定的再通过一定的显示系统使之显示出来。显示系统使之显示出来。细胞生物学技术外源性核苷酸外源性核苷酸

64、(双链双链DNA)内源性核苷酸（单内源性核苷酸（单链、或双链链、或双链DNA)末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TDT)这类方法统称原位末端标记。这类方法统称原位末端标记。用辣根过氧化酶用辣根过氧化酶+底物底物DAB来显示；来显示；生物标记生物标记细胞生物学技术通常有两种方法通常有两种方法：末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸转转移移酶酶介介导导的的dUTP缺缺口口 末末 端端 标标 记记 (terminal deoxynucleotidyltransferasemediated dUTP nick endlabeling)，简称简称TUNEL； DNA聚合酶聚合酶I或或Klenow大片段介

65、导的大片段介导的原位缺口平移原位缺口平移(insitunicktranslatin)简称简称INST。细胞生物学技术根据标记在根据标记在dUTP上的标记物和显上的标记物和显示系统的不同，可分别作组织切片示系统的不同，可分别作组织切片凋亡细胞的原位检测、培养细胞涂凋亡细胞的原位检测、培养细胞涂片和培养细胞的流式细胞仪检测。片和培养细胞的流式细胞仪检测。细胞生物学技术常用的标记物和显示系统有：常用的标记物和显示系统有：生物素标记的生物素标记的dUTP(biotindUTP)，其相应，其相应的显示系统为的显示系统为卵白素卵白素(avidin)或链卵白素或链卵白素(streptavidin)标记的标记

66、的辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)和显色底物和显色底物DAB；地高辛地高辛(digoxigenin)标记的标记的dUTP(digoxigenindUTP)，显示系统为，显示系统为辣根辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(正常羊正常羊IgC的的Fab片段片段)和和DAB；荧光素标记的荧光素标记的dUTPdUTP( (常用常用F1TCdUTP)F1TCdUTP)，用流式用流式细胞仪细胞仪分析或在荧光显微镜下观察。分析或在荧光显微镜下观察。 细胞生物学技术值得注意的是：值得注意的是：就就ISEL技技术术本本身身而而言言，是是不不能能区区别别凋凋亡亡、坏坏死死和和自自溶溶

67、性性死死亡亡，必必须须结结合合凋凋亡亡细细胞的形态学特征加以判断。胞的形态学特征加以判断。TUNEL和和ISNT鉴鉴定定标标记记的的阳阳性性细细胞胞可可结结合下列标准加以判断：合下列标准加以判断：单单个个或或少少数数几几个个孤孤立立地地分分布布在在组组织织中中；具具有有凋凋亡亡细细胞胞的的核核特特征征，即即核核固固缩缩显显示示一一个个或或多多个个染染色色体体团团块块，凋凋亡亡小小体体核核片片段段；周周围或局部无炎症反应的征象。围或局部无炎症反应的征象。细胞生物学技术TUNEL标记组织切片，标记组织切片，TUNEL阳性细胞核呈阳性细胞核呈深棕色。深棕色。细胞生物学技术流式细胞术在细胞凋亡研究中的

68、应用流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用流式细胞仪检测细胞凋亡的原理流式细胞仪检测细胞凋亡的原理一一、原原理理：激激光光照照射射单单细细胞胞，其其瞬瞬时时产产生生的的散散射射光光和和荧荧光光被被接接受受转转换换成成电电信信号号。散散射射光光分分为为前前散散射射光光(FLS)和和侧侧散散射射光光(90CLS)。FLS可可分分析析细细胞胞直直径径大大小小，90CLS可可分分析析细细胞胞表表面面形形态态、胞胞内内颗颗粒大小、多少及分布状态。粒大小、多少及分布状态。细胞生物学技术当当细细胞胞染染上上荧荧光光染染料料后后激激发发出出可可测测荧荧光光，将将此此转转换换成成电电信信号号送送至至计计算算机机处处理

69、理就就可可获获得得有有关关细细胞胞的的大大量量信信息息。在在目目前前细细胞胞凋凋亡亡的的研研究究中中，常常使使用用一一些些与与核核DNADNA结结合合的的荧荧光光染染料料。来来显显示示细细胞胞凋凋亡亡时时细细胞胞、亚亚细细胞胞和和分分子子水水平平上上所所发发生生的的特特征性改变征性改变细胞生物学技术二、细胞膜的改变二、细胞膜的改变* * 流流式式细细胞胞仪仪通通常常根根据据细细胞胞膜膜完完整整性性将将细细胞胞分分为为“活活(viable)”细细胞胞和和“死死(dead)”细细胞胞，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。* * 活活细细胞胞染染料料如如Hoechst

70、33342能能少少许许进进入入正正常细胞膜而对细胞没有太大的细胞毒作用。常细胞膜而对细胞没有太大的细胞毒作用。* * 凋凋亡亡细细胞胞早早期期细细胞胞膜膜的的完完整整性性没没有有明明显显地地改改变变，但但细细胞胞膜膜的的通通透透性性已已有有增增加加，因因此此进进入入凋亡细胞中的凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多。比正常细胞的多。细胞生物学技术*凋凋亡亡细细胞胞的的染染色色体体DNA的的结结构构发发生生了了改改变变从从而而使使该该染染料能更有效地与料能更有效地与DNA结合结合*凋凋亡亡细细胞胞膜膜上上的的p糖糖蛋蛋白白泵泵功功能能受受到到损损伤伤，不不能能有有效效地地将将Heoe

71、hst33342排排出出细细胞胞外外，使使之之在在细细胞内积累胞内积累。*正正常常细细胞胞和和凋凋亡亡细细胞胞在在不不经经固固定定的的情情况况下下对对EB、PI或或7AAD等等染染料料拒拒染染，故故这这些些染染料料是是不不能能进进入入细细胞胞膜膜完完整整的的活活细细胞胞中中。坏坏死死细细胞胞由由于于膜膜完完整整性性在早期即已破损，可被这些染料染色。在早期即已破损，可被这些染料染色。 细胞生物学技术细胞生物学技术 根据这些特性，根据这些特性，用用Hoechst33342结合结合PI或或EB等染料对凋亡细胞进行双等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将染色，就可在流式细胞仪上将正常细正常细

72、胞、凋亡细胞和坏死细胞胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。区别开来。细胞生物学技术通过流式细胞术观察细胞凋亡具有以下特征：通过流式细胞术观察细胞凋亡具有以下特征： 由由于于细细胞胞内内核核酸酸内内切切酶酶的的激激活活，使使DNA降降解解，DNA特异性荧光染色减少。特异性荧光染色减少。 细胞质膜完整。细胞质膜完整。 线粒体仍有膜电位。线粒体仍有膜电位。 保留了保留了ATP依赖的溶酶体质子泵。依赖的溶酶体质子泵。 蛋蛋白白含含量量明明显显减减少少，主主要要是是因因为为细细胞胞的的内内源源性蛋白酶被激活。性蛋白酶被激活。细胞生物学技术 蛋蛋白白含含量量明明显显减减少少，主主要要是是因因为为细细胞胞的内源

73、性蛋白酶被激活。的内源性蛋白酶被激活。 凋亡发生时，前散射光减少，侧散射凋亡发生时，前散射光减少，侧散射光不变如光不变如HL60细胞；或侧散光增加如细胞；或侧散光增加如胸腺细胞。胸腺细胞。细胞生物学技术细胞凋亡发生时，由于细胞的细胞凋亡发生时，由于细胞的DNA裂解，裂解，在流式细胞术的在流式细胞术的DNA图上呈现亚二倍体图上呈现亚二倍体核型峰的特征。但有时坏死细胞中也会核型峰的特征。但有时坏死细胞中也会出现此特征。出现此特征。细胞生物学技术 因此，为更准确地区分坏死和凋亡，因此，为更准确地区分坏死和凋亡，可同时采用两种不同的可同时采用两种不同的DNA染色剂，染色剂，根据其穿透正常和凋亡细胞胞膜

74、的能根据其穿透正常和凋亡细胞胞膜的能力及其与凋亡细胞力及其与凋亡细胞DNA结合能力的不结合能力的不同来达到区分正常细胞、凋亡细胞和同来达到区分正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞。坏死细胞。细胞生物学技术Hoechst33342EB、PI染料不能进入染料不能进入细胞膜完整的活细胞中细胞膜完整的活细胞中，正常细胞正常细胞凋亡细胞凋亡细胞死细胞死细胞Hoechst33342和和PI双染色双染色细胞生物学技术流式细胞术检测细胞凋亡的细胞周期特异性流式细胞术检测细胞凋亡的细胞周期特异性 应用流式细胞术不仅可以从细胞的形态应用流式细胞术不仅可以从细胞的形态和特征上鉴别出凋亡细胞，还可用来确认处和特征上鉴别出凋亡

75、细胞，还可用来确认处于什么细胞周期的细胞易于发生凋亡，于什么细胞周期的细胞易于发生凋亡，细胞生物学技术A:G2/S期细胞凋亡；期细胞凋亡；B:前前G1期细胞凋亡；期细胞凋亡；C:G2/S期细期细胞凋亡胞凋亡(TUNEL染色）；染色）；D:前前G1期细胞凋亡期细胞凋亡(TUNEL；细胞生物学技术流式细胞术定量测定细胞凋亡时流式细胞术定量测定细胞凋亡时蛋白质的表达情况蛋白质的表达情况测定蛋白质表达的机理与测测定蛋白质表达的机理与测DNA变化的机理变化的机理相似。可先使各待测蛋白质通过免疫荧光或生相似。可先使各待测蛋白质通过免疫荧光或生物素亲和反应带上特异的荧光，这样流式细胞物素亲和反应带上特异的荧

76、光，这样流式细胞仪就可检测到。所测的蛋白质可以是细胞标志仪就可检测到。所测的蛋白质可以是细胞标志物、受体、抗原或抗体等，它可以在细胞表面、物、受体、抗原或抗体等，它可以在细胞表面、胞浆内，也可在细胞核内。胞浆内，也可在细胞核内。细胞生物学技术细胞培养细胞培养(cellculture)细胞生物学技术基本概念：基本概念：是是指指从从体体内内取取出出组组织织、细细胞胞在在体体外外模模拟拟体体内内生生理理环环境境，在在无无菌菌、适适当当温温度度和和一一定定的的营营养养条条件件下下，使使之之生生存存和和生生长长，并并维维持持其其结结构构和和功功能能特特性性。从从广广义义上上讲讲组组织织培培养养与与体体外

77、培养同义。外培养同义。细胞生物学技术体外培养（体外培养（Invitro）包括：）包括：*细胞培养细胞培养(cellculture)*组织培养组织培养(Tissueculture)*器官培养器官培养(Organculture)细胞生物学技术二、二、体外培养细胞的分型体外培养细胞的分型可分为贴附型和悬浮型两大类可分为贴附型和悬浮型两大类：贴附型：贴附型：在在培培养养时时能能贴贴附附在在支支持持物物表表面面上上生生长长，大大多多数数培培养养细细胞胞呈呈贴贴附附型型生生长长，这这种种细胞又称：细胞又称：贴附型细胞或贴附型细胞或锚着依存型细胞锚着依存型细胞细胞生物学技术体外培养贴附型细胞根据形态大致分为

78、几类：体外培养贴附型细胞根据形态大致分为几类：a.成成纤纤维维细细胞胞型型：胞胞体体呈呈梭梭型型，或或三三角角形形，有有2-3个个突突起起，生生长长时时称称放放射射状状。由由中中胚胚层层间间充质起源的组织。充质起源的组织。b.上上皮皮细细胞胞型型：扁扁平平，不不规规则则多多角角型型、园园核核，细细胞胞彼彼此此紧紧密密连连接接成成单单层层膜膜。起起源源于于内内外外胚胚层层细细胞胞，如如：皮皮肤肤表表皮皮，肺肺泡泡上上皮皮，消消化化管管上上皮皮，肝、胰等。肝、胰等。细胞生物学技术成纤维细胞：梭形、三角形、成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核上皮细胞：扁平、多角形

79、、园核可连成单层可连成单层细胞生物学技术c游游走走细细胞胞型型：在在支支持持物物上上散散在在生生长长，一一般般不不连连成成片片，细细胞胞常常有有伪足，呈活跃的游走，或变形运动。伪足，呈活跃的游走，或变形运动。d多多形形细细胞胞型型：还还有有一一些些组组织织和和细细胞胞如如：神神经经组组织织的的细细胞胞难难以以确确定它们的规律。定它们的规律。细胞生物学技术血管内皮细胞（梭性、三角形、有血管内皮细胞（梭性、三角形、有2-3个突起）个突起）细胞生物学技术内皮细胞内皮细胞细胞生物学技术上皮细胞、肿瘤细胞及游走细胞上皮细胞、肿瘤细胞及游走细胞细胞生物学技术癌细胞癌细胞细胞生物学技术2.悬浮型：悬浮型：悬

80、悬浮浮状状生生长长，胞胞体体为为圆圆形形，如如某某些些癌癌细细胞胞和和血血液液白白细细胞胞，此此型型细细胞胞观观察察时时不不如如贴贴附附型型方方便便，但但允允许许长时间生长，能繁殖多量的细胞。长时间生长，能繁殖多量的细胞。细胞生物学技术悬浮型細胞悬浮型細胞细胞生物学技术三、培养细胞形态结构培养细胞形态结构培培养养细细胞胞的的形形态态结结构构与与体体内内细细胞胞基基本本相相同同，但但大大体体及及某某些些细细微微结结构方面仍存在着一定的差异。构方面仍存在着一定的差异。1.大大体体形形态态：根根据据是是否否贴贴附附生生长长，形态有所不同又分：形态有所不同又分：悬浮生长：悬浮生长：附着生長：附着生長：

81、细胞生物学技术附着生长：附着生长：开开始始为为圆圆形形形形态态，过过渡渡演演变为其原属形态。变为其原属形态。细胞生物学技术随支持物的构型而改变：随支持物的构型而改变：a附附于于球球体体表表面面时时，细细胞胞与与球球体同心圆状。体同心圆状。细胞生物学技术b支支持持物物平平坦坦时时，细细胞胞由由圆圆延延展展成成圆圆饼形，称为放射延展细胞。饼形，称为放射延展细胞。c过过渡渡为为极极性性细细胞胞，极极性性细细胞胞形形态态常常随着细胞运动发生变化；随着细胞运动发生变化；它它们们的的外外质质的的周周边边可可分分为为活活跃跃与与不不活活跃两部分跃两部分*活跃部分常伸出伪足，使细胞运动。活跃部分常伸出伪足，使

82、细胞运动。*不活跃部分较稳定。不活跃部分较稳定。细胞生物学技术活跃部分活跃部分不活跃部分不活跃部分极性细胞极性细胞放射延展细胞放射延展细胞刚贴壁细胞刚贴壁细胞细胞生物学技术四四.组织培养细胞的生长和增殖过程组织培养细胞的生长和增殖过程.体体内内细细胞胞生生长长在在动动态态平平衡衡环环境境中中，组组织织培培养养细细胞胞的的生生存存是是在在瓶瓶皿皿或或其其他他容容器器中中，生生存存环环境境和和营营养养是是有有限限的的。当当细细胞胞增增殖殖达达到到一一定定密密度度后后，需需分分离离出出部部分分细细胞胞和和更更新新营营养养液液，这这一一过过程程称称“传传代代”。而而每每次次传传代代都都影影响响细细胞胞

83、的的生生长长进进程程，也也就就是是说说细细胞胞的的生生长长和和增增殖殖过过程程都都会会受受一一定定的的影影响响。于于是是就就出出现现了了与与体体内内不不同同的生存特点。的生存特点。细胞生物学技术培养细胞生命期：培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。间。大多数二倍体细胞在培养中只能维持有大多数二倍体细胞在培养中只能维持有限生存期，在整个生存过程中大致经历三个限生存期，在整个生存过程中大致经历三个阶段。阶段。细胞生物学技术第第I期期原原代代培培养养(primaryculture)期期，也称初代培养期也称初代培养期.1.从从体体内内取取组组织织接接种

84、种培培养养到到第第一一次次传传代代阶阶段段，一一般般持持续续14周周，此此期期细细胞胞呈呈活跃的移动，但分裂不旺盛。活跃的移动，但分裂不旺盛。细胞生物学技术2.与与体体内内原原组组织织相相似似性性大大，细细胞胞群群是是异异质质的的(Heterogeneous)，即即各各细细胞胞的的遗遗传传性性状互不相同，细胞相互依存性强。状互不相同，细胞相互依存性强。3.克克隆隆形形成成率率低低（cloningEfficiency）:克克隆隆形形成成率率为为单单细细胞胞状状态态培培养养时时形形成成克克隆隆的百分数，即细胞独立生存性差。的百分数，即细胞独立生存性差。4.初初代代培培养养细细胞胞呈呈二二倍倍体体核

85、核型型，因因与与体体内内细细胞胞性性状状相相似似，所所以以是是药药物物测测试试很很好好的的对象。对象。细胞生物学技术第第II期期传代期：传代期：初初代代培培养养细细胞胞一一经经传传代代后后便便称称做做细细胞胞系系(cellline),又又称称二二倍倍体体细细胞胞系系（Diploidcellline）,此此期期在在全全生生命命期期中中持续时间最长。持续时间最长。初代培养初代培养传代培养传代培养细胞生物学技术1.此此期期的的细细胞胞在在培培养养条条件件好好的的情情况况下下，细细胞胞增增殖殖旺旺盛盛，并并能能维维持持二二倍倍体体核核型型。呈呈二二倍倍体核型的细胞系称二倍体细胞系。体核型的细胞系称二倍

86、体细胞系。2.为为保保持持二二倍倍体体细细胞胞性性质质，细细胞胞应应在在初初代代培培养养期期或或传传代代后后早早期期冻冻存存，目目前前世世界界上上细细胞胞系系均均在在不不出出10代代后后早早期期冻冻存存，如如果果反反复复传传代，有可能失去二倍体性质。代，有可能失去二倍体性质。细胞生物学技术第第III期期衰衰退退期期：此此期期细细胞胞仍仍然然生生存存，但但不不增增殖殖或或增增殖殖很很慢慢，细细胞胞形形态态轮轮廓廓增增强强，最最后衰退死亡。后衰退死亡。*在在以以上上三三期期任任何何一一点点，由由于于不不明明原原因因的的影影响响（少少数数情情况况），细细胞胞可可能能发发生生自自发发转转化化（spon

87、taneoustransformation）。）。细胞生物学技术细胞发生转化的标志：细胞发生转化的标志：细细胞胞获获得得永永生生性性(immortality)或或恶恶性性性性(malignancy)。细细胞胞永永生生性性也也称称不不死死性性，即即细细胞胞获获得得持持久久增增殖殖能能力力。这这样样的的细细胞胞群群体体称称无无限限细细胞胞系系，或或连连续续细细胞胞系系（continuouscellline）。）。细胞生物学技术（二二） 组组织织培培养养细细胞胞一一代代生生长长过过程程 （一代生存期）（一代生存期）细胞细胞“一代一代”：仅指从细胞接种到分离再培养仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间，

88、它与细胞倍增一代非同的一段时间，它与细胞倍增一代非同一含义。在细胞一代中，细胞能倍增一含义。在细胞一代中，细胞能倍增36次。次。细胞生物学技术潜伏期潜伏期（latentphase）:刚刚接接种种后后的的细细胞胞在在培培养养液液中中呈呈悬悬浮浮状状态，又称悬浮期。此时，态，又称悬浮期。此时，细胞质回缩，胞体变圆。细胞质回缩，胞体变圆。接着细胞开始附着式贴附，接着细胞开始附着式贴附，初代培养细胞贴附慢。初代培养细胞贴附慢。连连续续细细胞胞系系贴贴附附快快，（10秒秒30秒）秒）细胞生物学技术指数增生期指数增生期是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相多，此期的细胞分裂数量可

89、作为判裂相多，此期的细胞分裂数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。初代细胞分裂指数低，连续细胞系和肿初代细胞分裂指数低，连续细胞系和肿瘤系的分裂指数高，可达瘤系的分裂指数高，可达3-5%。指数增。指数增生期是细胞一代中活动最好的时间，因生期是细胞一代中活动最好的时间，因此是进行实验的最好和最重要的阶段。此是进行实验的最好和最重要的阶段。细胞生物学技术停滞期停滞期(StagnatePhase)又称平顶期又称平顶期细胞数量达到饱和密度后，细胞逐渐停细胞数量达到饱和密度后，细胞逐渐停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量持平，止增殖，进入停滞期。此时细胞数量持平，

90、故又称平顶期。故又称平顶期。细胞生物学技术潜伏期潜伏期指数增生期指数增生期细胞增殖率极限点细胞增殖率极限点细胞数增大极限点细胞数增大极限点平顶期平顶期退退化化死死亡亡细细胞胞增增殖殖数数24487296120h细胞一代生长过程细胞一代生长过程细胞生物学技术培养细胞生存环境、条件和代谢培养细胞生存环境、条件和代谢一、一、无污染环境无污染环境培培养养环环境境的的无无毒毒和和无无菌菌是是保保证证培培养养细胞生存的首要条件。无菌的基本要求：细胞生存的首要条件。无菌的基本要求：*无菌室无菌室*超净台超净台*无菌操作无菌操作细胞生物学技术二、温度二、温度 维持细胞增殖生长，必须有适当的维持细胞增殖生长，必

91、须有适当的温度。温度。细胞对温度的耐受力：总的来说对细胞对温度的耐受力：总的来说对低温的耐受比高温强。低温的耐受比高温强。即：即：培养细胞的代谢随温度降低而缓慢培养细胞的代谢随温度降低而缓慢一般要求在：一般要求在：36.6-37 细胞生物学技术三、气体环境和氢离子浓度：三、气体环境和氢离子浓度：气气体体也也是是细细胞胞生生存存的的必必须须条条件件之之一，主要有一，主要有O2和和CO2。O2：参参与与三三羧羧酸酸循循环环，产产生生能能量量供供给给细细胞胞生生长长，增增殖殖和和合合成成各各种种所所需需成成分分。某某些些细细胞胞在在乏乏氧氧情情况况下下可可借借糖糖酵酵解解来来获获取取能能量量，但大多

92、数细胞缺氧不能生存。但大多数细胞缺氧不能生存。CO2:既既是是细细胞胞代代谢谢产产物物，也也是是细细胞胞所所需需成成分分。它它的的主主要要作作用用在在于于能能维维持持培培养养基基的的PH值。值。细胞生物学技术pH：大大多多数数细细胞胞的的最最适适pH值值为为7.27.4，偏偏离离此此范范围围对对细细胞胞将将产产生生有有害害的的影影响响。但各种细胞对但各种细胞对pH的要求也不完全相同。的要求也不完全相同。如：原代培养细胞：对如：原代培养细胞：对pH变动耐受性差。变动耐受性差。永生型细胞：永生型细胞：耐受性强。耐受性强。恶恶性细胞：性细胞：还有：细胞的耐酸性比耐碱性要大一些。还有：细胞的耐酸性比耐

93、碱性要大一些。细胞生物学技术四、体外培养细胞生存所需基本物质四、体外培养细胞生存所需基本物质凡凡能能进进入入细细胞胞中中被被细细胞胞所所利利用用，参参与与细细胞胞代代谢谢和和维维持持细细胞胞生生存存的的物物质质均均属属营营养物质。养物质。糖糖氨基酸氨基酸维生素维生素促生长因子促生长因子其它物质其它物质细胞生物学技术培养方法培养方法1.单单 细细 胞胞 分分 离离 （ 克克 隆隆 ） 培培 养养 （ cellcloning）:即把单个细胞从群体内分离出来单独即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。培养技术。又称细胞克隆

94、又称细胞克隆（Cellcloning）。）。细胞经过克隆后，它的后裔细胞群是来源一细胞经过克隆后，它的后裔细胞群是来源一个共同的祖细胞，个共同的祖细胞，即形成了纯系，称细胞株即形成了纯系，称细胞株(cellstrain细胞生物学技术塑料多孔培养板单细胞克隆法塑料多孔培养板单细胞克隆法:制制备备:细细胞胞稀稀释释为为10个个毫毫升升，接接种种96孔孔板板中中，每每孔孔接接种种0.1毫毫升升，镜镜下下见见出出单单个个细细胞胞孔孔，标标记记后后培培养养，观观察察克克隆隆形形成数。成数。细胞生物学技术细胞生物学技术单层培养法：单层培养法：利用细胞对培养容器的贴壁依赖利用细胞对培养容器的贴壁依赖性，进行

95、培养而形成单层细胞层。性，进行培养而形成单层细胞层。细胞生物学技术三维细胞培养法：三维细胞培养法：即为载体细胞培养法即为载体细胞培养法利利用用不不同同载载体体，如如中中空空纤纤维维、小小球球体体、海海绵绵等等，作作为为细细胞胞的的附附着着底底物物，进进行行培培养养。可可大大量量繁繁殖殖细细胞胞，达达到到超超产产量培养细胞的目的。量培养细胞的目的。细胞生物学技术微载体细胞培养法微载体细胞培养法细胞生物学技术静静止止悬悬液液培培养养：一一些些细细胞胞能能在在悬悬浮浮状状态态下下进进行行培培养养，不不附附着着，不不贴贴壁壁，主主要有白细胞、癌细胞。要有白细胞、癌细胞。细胞生物学技术原代培养、传代培养

96、原代培养、传代培养从从直直接接取取自自动动物物细细胞胞、组组织织和和器器官官开开始始的的培培养养，称称为为原原代代培培养养（PrimaryCulture），或初代培养。或初代培养。原原 代代 培培 养养 组组 织织 块块 培培 养养 ： 将将 组组 织织 块块 切切 成成 小小 块块 培养。培养。分分散散细细胞胞培培养养（细细胞胞培培养养）：组组织织中中含含一一定定量量的的细细胞胞间间质质，妨妨碍碍细细胞胞生生长长，可去除间质，使组织松散，细胞分离。可去除间质，使组织松散，细胞分离。细胞生物学技术优优点点：a.组组织织和和细细胞胞刚刚刚刚离离体体，生生物性状尚未发生很大的变化。物性状尚未发生很

97、大的变化。b.具具有有二二倍倍体体遗遗传传性性，在在一定程度上能反映体内状态。一定程度上能反映体内状态。缺缺点点：a.由由于于原原代代培培养养是是由由多多种种细细胞胞成成分分组组成成的的，比比较较复复杂杂，具具有有异异质质性性，在分析细胞生物学特性是比较困难。在分析细胞生物学特性是比较困难。b.供供体体的的个个体体差差异异及及其其它它一一些原因，细胞群生长效果不好。些原因，细胞群生长效果不好。细胞生物学技术传代培养：传代培养：（Subculture）原原代代培培养养的的细细胞胞进进行行分分离离培培养养（由由于于空空间间和和营营养养的的缘缘故故）的的过过程程，也也就就是是将将原原代代培培养养的的

98、细细胞胞从从一一个个培培养养瓶转移到另一个培养瓶进行培养。瓶转移到另一个培养瓶进行培养。细胞生物学技术细胞培养在实验研究中的应用细胞培养在实验研究中的应用一、一、用于药物的测试用于药物的测试用培养细胞检测药物的优点：用培养细胞检测药物的优点：1.减少种属差异：减少种属差异：2.具有组织特异性：具有组织特异性：3.培养细胞具有均一的遗传背景：培养细胞具有均一的遗传背景：4.获得实验结果迅速：获得实验结果迅速：细胞生物学技术药物的检测药物的检测1.药物剂量的确定：药物剂量的确定：2.细细胞胞的的形形态态和和增增殖殖生生长长对对药药物物的反应的反应3.观察药物作用的时间。观察药物作用的时间。4.抗癌

99、药物的研究。抗癌药物的研究。5.细细胞胞培培养养在在杂杂交交瘤瘤技技术术中中的的应应用用细胞生物学技术二、细胞培养在杂交瘤中的应用二、细胞培养在杂交瘤中的应用杂交瘤技术，是医学生物领域中的一项技杂交瘤技术，是医学生物领域中的一项技术革命，它是生物工程的重要组成部分。术革命，它是生物工程的重要组成部分。杂杂交瘤技术主要有：交瘤技术主要有：细胞融合、细胞融合、抗体筛选抗体筛选克隆化培养克隆化培养三部分组成一套完整的技术体系三部分组成一套完整的技术体系细胞生物学技术三、单克隆抗体的大量制备三、单克隆抗体的大量制备1.加大培养容器加大培养容器：大量培养方法，可大量：大量培养方法，可大量收集培养上清。同

100、时需对抗体进行浓缩。收集培养上清。同时需对抗体进行浓缩。2.体内移植法体内移植法：取同系雌性小鼠（：取同系雌性小鼠（6-8周周龄），腹腔注射龄），腹腔注射0.5ml石蜡油，一周后石蜡油，一周后腹腔内注射腹腔内注射107杂交细胞。杂交瘤细胞杂交细胞。杂交瘤细胞在腹腔内可增殖并产生腹水，腹水中可在腹腔内可增殖并产生腹水，腹水中可含大量的抗体（达含大量的抗体（达mg水平），水平），细胞生物学技术原位杂交组织化学技术原位杂交组织化学技术的基本方法的基本方法细胞生物学技术一、核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术1961年年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利

101、用核酸分子单链之间有互补的其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。出现稳定的双链区，形成杂交的双链。细胞生物学技术细胞生物学技术细胞生物学技术液相杂交：液相杂交：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，即在溶液中，即待测核酸链和探针双方均在溶液待测核酸链和探针双方均在溶液中所进行的杂交。中所进行的杂交。细胞生物学技术固相杂交：是将参加反应的一条核酸链固定固相杂交：是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上，另一条参加反应的核酸在固体的

102、支持物上，另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。即链游离在溶液中。即待测核酸链固定于固相待测核酸链固定于固相支持物上支持物上(如尼龙膜如尼龙膜)、探针在溶液中所进行、探针在溶液中所进行的杂交。分为膜上印迹杂交与原位杂交的杂交。分为膜上印迹杂交与原位杂交常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），乳胶颗粒和微孔板等），细胞生物学技术细胞生物学技术固相杂交包括：固相杂交包括：菌落原位杂交（菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）、）、斑点杂交法（斑点杂交法（Dotblot）、）、Southern印迹杂交（印迹杂交（Sou

103、thernblot）、）、Northern印迹杂交（印迹杂交（Northernblot）组织原位杂交（组织原位杂交（Tissueinsituhybridization），），即原位杂交组织化学技术和即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。原位杂交免疫细胞化学技术。细胞生物学技术斑点及狭缝印迹杂交（斑点及狭缝印迹杂交（Dotandslotblot）直接将核酸样品点样于滤膜上，然后直接将核酸样品点样于滤膜上，然后与探针进行杂交的方法称之。与探针进行杂交的方法称之。菌落杂交：菌落杂交：系细菌裂解释放出系细菌裂解释放出DNA，然后进，然后进行杂交。行杂交。将菌落（噬斑）原位转移至滤膜上，将菌

104、落（噬斑）原位转移至滤膜上，原位裂解、变性，然后进行分子杂交。原位裂解、变性，然后进行分子杂交。细胞生物学技术Southern印迹杂交法：印迹杂交法：是以鉴定是以鉴定DNA中某中某一特定的基因片段，一特定的基因片段，DNA片段经电泳分离片段经电泳分离后，原位转印至膜，再进行分子杂交的技后，原位转印至膜，再进行分子杂交的技术。术。Northern印迹杂交法：印迹杂交法：RNA经电泳分离后，原位转印至膜，再经电泳分离后，原位转印至膜，再进行分子杂交的技术。进行分子杂交的技术。是用以检测某一特定是用以检测某一特定的的RNA片段的。片段的。细胞生物学技术Westernblot（蛋白质的原位测定技术）（

105、蛋白质的原位测定技术）蛋白质经电泳分离后，原位转印蛋白质经电泳分离后，原位转印至膜，再进行免疫反应或亲和、结合反应的至膜，再进行免疫反应或亲和、结合反应的测定技术测定技术但以上这些杂交都只能证明该病原体、细胞但以上这些杂交都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。核酸分子在细胞或组织中存在的部位。细胞生物学技术组织原位杂交（组织原位杂交（Tissueinsituhybridization），），即原位杂交组织化学技术即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。和原位杂交免疫细胞化学技术。可对可对核

106、酸在细胞中进行定位。核酸在细胞中进行定位。Orth（1970）应用）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。细胞生物学技术二探针二探针广义广义带有可检测的标记物能与特定的靶分子发带有可检测的标记物能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子。生特异性相互作用的分子。核酸探针核酸探针指用同位素或

107、其他标记物标记的特定已知指用同位素或其他标记物标记的特定已知的核酸分子。的核酸分子。细胞生物学技术根据标记方法的不同可粗略分为根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针放射性探针和和非放射性探针非放射性探针两类。两类。根据探针的核酸性质不同可分为根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、探针、RNA探针、探针、cDNA探针、探针、cRNA探针和寡核苷探针和寡核苷酸探针等。酸探针等。DNA探针还有单链探针还有单链DNA（Singlestranded,ssDNA）和双链）和双链DNA（Doublestranded,dsDNA）之分。）之分。细胞生物学技术(1)DNA探针探针GenomicDNA:尽可能选

108、用基因的尽可能选用基因的编码序列编码序列(外显子外显子),避免使用内含子避免使用内含子及其它非编码序列及其它非编码序列cDNA：无内含子及高度重复序列无内含子及高度重复序列细胞生物学技术(2)RNA探针探针优点：优点：杂交稳定性与效率高、杂交稳定性与效率高、特异性强、特异性强、本底低本底低缺点：缺点：易降解，易降解，polyA干扰干扰细胞生物学技术(3)寡核苷酸探针寡核苷酸探针最适于点突变检测最适于点突变检测选择原则基本同选择原则基本同PCR引物设计长引物设计长18-50nt,GC含量含量40-60%,与非靶序列同源性不超过与非靶序列同源性不超过70%或连续或连续8个以上相同碱基个以上相同碱基

109、.细胞生物学技术原位杂交组织化学技术原位杂交组织化学技术在生命科学的研究在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各。为各个学科的研究带来突破性的进展。个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学色体分析、病毒诊断和发育生物学。一、原位杂交组织化学技术一、原位杂交组织化学技术细胞生物学技术二、原位杂交组织化学技术的由来及发展二、原位杂交组织化学技术的由来及发展原位杂交组织（或

110、细胞）化学技术简称原原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（位杂交（Insituhybridization），属于固相），属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。1969年美国耶鲁大学年美国耶鲁大学Gall和和Pardue首先用首先用爪爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，有基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，有人相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或人相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞

111、或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。组织化学技术。细胞生物学技术由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。位杂交。荧光素标记荧光素标记cRNA探针做原位杂交探针做原位杂交2，4二硝基苯甲醛（二硝基苯甲醛（DNP）标记标记DNA探针探针，使该，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗探针具有抗原性，然后用兔抗DNP

112、的抗体来识的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。定位杂交探针。生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。探针标记探针标记细胞生物学技术原位杂交组织化学技术的基本方法原位杂交组织化学技术的基本方法由于核酸探针的种类和标记物的不同，大致由于核酸探针的种类和标记物的不同，大致可分为：可分为：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；背景染色等；杂交；杂交；杂交后处理；杂交后

113、处理；显示（显示（visualization）：包括放射性自显）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。影和非放射性标记的显色。细胞生物学技术（一）固定（一）固定原位杂交组织化学技术（原位杂交组织化学技术（InSituHybridizationHistochemistry,ISHH）在）在固定剂的应用和选择上固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：应兼顾到三个方面：保持细胞结构，保持细胞结构，最大限度地保持细胞内最大限度地保持细胞内DNA或或RNA的水平；的水平；使探针易于进入细胞或组织。使探针易于进入细胞或组织。 细胞生物学技术最常用的是多聚甲醛最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊。和其它

114、的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。组织。常采用的方法常采用的方法是将组织固定于是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸多聚甲醛磷酸缓冲液中缓冲液中12h，在冷冻前浸入，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，蔗糖溶液中，置置4冰箱过夜，次日切片。或保存在液氮中。冰箱过夜，次日切片。或保存在液氮中。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入将其浸入4%多聚甲醛约多聚甲醛约10min，空气干燥后保，空气干燥后保存在存在-70

115、。细胞生物学技术（二）玻片和组织切片的处理（二）玻片和组织切片的处理1玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水，清水洗净烘干，洗净烘干，95%酒精中浸泡酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何或以上过夜以去除任何RNA酶。酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。存放。应用应用粘附剂预先涂抹粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，在玻片

116、上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾剂有铬矾-明胶液，多聚赖氨酸液具有较好的粘附效明胶液，多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。果，但价格昂贵，需进口。细胞生物学技术2增强组织的通透性和核酸探针的穿透性增强组织的通透性和核酸探针的穿透性此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。度和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强

117、的增强组织通透性的试剂。连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。常用的方法：常用的方法：如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂或称清洗剂TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。）等。细胞生物学技术蛋白酶蛋白酶K（ProteinaseK）的消化作用）的消化作用应用于蛋白的消化，其浓度及孵育时间视组织应用于蛋白的消化，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。蛋白酶蛋白酶K

118、还具有消化包围着靶还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。用，从而提高杂交信号。细胞生物学技术预杂交（预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。将组）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。杂交点的目的，从而减低背景染色。细胞生物学技术（三）杂交（三）杂交（Hybridisation）杂交是将杂交

119、液滴于切片组织上，加盖硅化的杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。盖玻片。在此过程中核酸探针进入细胞或组织在此过程中核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是因此，杂交是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。中关键的而且是最重要的一个环节。细胞生物学技术为获得满意的实验结果，在杂交这一实验过程中必须注意为获得满意的实验结果，在杂交这一实验过程中必须注意以下的环节：以下的环节：1把握探针的浓度把握探针的浓度：最佳原则应是应用最低探针浓度以达：最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。即探针浓度必须给到与靶核苷酸的最大饱

120、和结合度为目的。即探针浓度必须给予该实验最大的信予该实验最大的信/噪比值。噪比值。2.把握探针的长度：一般应用于把握探针的长度：一般应用于ISHH探针的最佳长度应在探针的最佳长度应在50100个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。时间短。3把握杂交的温度和时间：杂交的温度也是杂交成功与否的把握杂交的温度和时间：杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节。根据探针的种类不同，温度略有差异，一个重要环节。根据探针的种类不同，温度略有差异，RNA和和cRNA探针一般在探针一般在3742左右，而左右，而DNA探针或细胞内靶探针或细胞内靶核苷酸为核

121、苷酸为DNA的，则必须在的，则必须在8095加热使其变性。加热使其变性。细胞生物学技术（四）杂交后处理（四）杂交后处理（posthybridisationtreatment）杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。在原位杂交组织化学的实验程序中，这也是一个重要的环在原位杂交组织化学的实验程序中，这也是一个重要的环节。节。通过杂交后的洗涤可有效地减低背景染色，获得较好的通过杂交后的洗涤可有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。反差效果。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核

122、酸探针的类型和标记的种类不同而有差异。核酸探针的类型和标记的种类不同而有差异。细胞生物学技术（五）显示（五）显示（Visualization）显示又可称为检测系统（显示又可称为检测系统（Detectionsystem）。根据）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理检测系统进行不同显色处理细胞生物学技术ISHH的最大优点是它的高度特异性，的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。提取物中的核苷酸含量。细胞生物学技术组织原位杂交组织原位杂交

123、细胞生物学技术荧光原位杂交荧光原位杂交细胞生物学技术抗微管蛋白免疫染色法显示培养细胞微管细胞生物学技术激光扫描共聚焦显微镜系统及激光扫描共聚焦显微镜系统及 其在细胞生物学中的应用其在细胞生物学中的应用细胞生物学技术激光扫描共聚焦显微镜是近二十年发展起激光扫描共聚焦显微镜是近二十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个

124、补充。的飞跃，是电子显微镜的一个补充。细胞生物学技术激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称，简称LSCM）它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。形

125、态的变化。细胞生物学技术已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。些领域新一代强有力的研究工具。细胞生物学技术激光器发出的激光束经过扩束透镜和光激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜度，经

126、过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。处的针孔，由检测器接收。激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成细胞生物学技术激激光光扫扫描描共共聚聚焦焦显显微微镜镜成成像像原原理理只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，

127、其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。细胞生物学技术 ACASULTIMa312硬件及参数指标硬件及参数指标激光光源：激光光源：氩离子激光（氩离子激光（50mW的紫外光、的紫外光、999mW的可的可见光），能同时见光），能同时/顺序顺序/分别输出紫外光和可见光，激发分别输出紫外光和可见光，激发波长为波长为351-364nm；488nm；514nm。计算机系统：计算机系统：80586/133MHzPCI/

128、80MBRAM/2000MBSCSI硬盘硬盘/150MBBernoulli盘驱动器盘驱动器/17大屏幕显示大屏幕显示器。器。共聚焦系统：共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小；自动径校准；计算机调节孔径大小；自动Z轴调节（最小轴调节（最小0.1m）。）。细胞生物学技术光学探测系统：光学探测系统：3个测窗式个测窗式PMT采集荧光；采集荧光；1个个CCD系统；系统；12位的高速位的高速A/D转换器。转换器。图像分辨率：图像分辨率：图像大小图像大小15351535；像素最小距离：像素最小距离：0.1m；灰度为；灰度为4096

129、级。级。扫描方式：扫描方式：快速镜扫描快速镜扫描DualScan台阶扫描；扫描精度台阶扫描；扫描精度0.1m；扫描面积最大为；扫描面积最大为10cm8cm ；扫描平面：扫描平面：XY和和XZ和独特点、线、面扫描。和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚激光扫描共聚焦显微镜软件系统焦显微镜软件系统细胞生物学技术ACASULTIMa312系统系统采用独特设计的软采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学数据采集、分析与管理功能。基于生物

130、医学研究有如下的软件。研究有如下的软件。细胞生物学技术 激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用 定量荧光测量定量荧光测量可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速

131、的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。息。细胞生物学技术Survivin在大肠癌中的表达在大肠癌中的表达（FITC和和PI双染色）双染色）细胞生物学技术定量共聚焦图像分析定量共聚焦图像分析借助于借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系像

132、。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如如DNA含量、含量、RNA含量、分子扩散、胞内离含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。定量、定时及定位分析。细胞生物学技术三维重组分析生物结构三维重组分析生物结构ACAS使用使用SFP进行三维图像重组，进行三维图像重组，SFP将各

133、光将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。细胞生物学技术细胞生物学技术 动态荧光测定动态荧光测定Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，利用及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧等多种

134、荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和和CNARF进行进行Ca2+和和pH的同时测定。的同时测定。细胞生物学技术荧光光漂白恢复（荧光光漂白恢复（FRAP）-活细胞的活细胞的动力学参数动力学参数 胞间通讯研究胞间通讯研究细胞膜流动性测定细胞膜流动性测定笼锁笼锁解笼锁测定解笼锁测定 粘附细胞分选粘附细胞分选细胞激光显微外科及光陷阱技术细胞激光显微外科及光陷阱技术细胞生物学技术