克隆基因表达及基因干扰修课件

《克隆基因表达及基因干扰修课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《克隆基因表达及基因干扰修课件（100页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、克隆基因的表达及基因干扰克隆基因的表达及基因干扰1克隆基因表达及基因干扰修课件克隆基因的表达及基因干扰克隆基因的表达及基因干扰第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达第二节第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定表达产物的分离、纯化与鉴定第三节第三节 基因表达干扰技术基因表达干扰技术2克隆基因表达及基因干扰修课件克隆基因的表达及基因干扰克隆基因的表达及基因干扰第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达第二节第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定表达产物的分离、纯化与鉴定第三节第三节 基因表达干扰技术基因表达干扰技术3克隆基因表达及基因干扰修课件第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达遗传信息从遗传信

2、息从DNA到蛋白质的传递到蛋白质的传递过程过程中心法中心法则（则（central dogma）。）。 n基因表达基因表达4克隆基因表达及基因干扰修课件外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达n克隆基因表达克隆基因表达5克隆基因表达及基因干扰修课件第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系二、真核生物表达体系

3、二、真核生物表达体系 酵母，哺乳动物细胞酵母，哺乳动物细胞大肠杆菌大肠杆菌6克隆基因表达及基因干扰修课件一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系（二）原核表达载体具有的特点（二）原核表达载体具有的特点（四）包涵体（四）包涵体（一）对外源目的基因的要求（一）对外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核细胞中的表达（三）真核生物基因在原核细胞中的表达7克隆基因表达及基因干扰修课件（一）对外源目的基因的要求（一）对外源目的基因的要求 1 1、不应具有、不应具有55端非编码区以及内含子结构端非编码区以及内含子结构 2 2、不能直接用真核基因组、不能直接用真核基因组DNA.DNA. 3 3、常以、常以c

4、DNAcDNA为模板，设计引物，为模板，设计引物，PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因. . 一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系8克隆基因表达及基因干扰修课件 选择标志选择标志 启动子启动子 ：乳糖启动子：乳糖启动子laclac，色氨酸启动子，色氨酸启动子trptrp等等 翻译调控序列，如核糖体结合位点翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD(SD序列序列) )，及，及 翻译起始点和终止序列翻译起始点和终止序列 多克隆位点多克隆位点(MCS)(MCS) （二）原核表达载体具有的特点（二）原核表达载体具有的特点一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系原核启动子原核启动子SD序列序列MCS终止子

5、终止子9克隆基因表达及基因干扰修课件原核启动子原核启动子大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列：大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列： -35box -35box 和和 -10box-10box（Pribnow boxPribnow box）TTGACA10克隆基因表达及基因干扰修课件consensus sequences11克隆基因表达及基因干扰修课件核糖体结合位点（核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。SDmRNA 5AGGAGGUAUG

6、 16S rRNA3 UCCUCCAS-DS-D序列距离序列距离AUGAUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译12克隆基因表达及基因干扰修课件（三）真核生物基因在原核细胞中的表达三）真核生物基因在原核细胞中的表达1.1.非融合型表达蛋白非融合型表达蛋白2.2.融合型表达蛋白融合型表达蛋白3.3.分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系13克隆基因表达及基因干扰修课件 1. 1.非融合型表达蛋白非融合型表达蛋白 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。质融合在一起。 优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋

7、优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋 白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致 缺点：易被细菌蛋白酶破坏缺点：易被细菌蛋白酶破坏 （三）真核生物基因在原核细胞中的表达（三）真核生物基因在原核细胞中的表达 一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系SD序列ATG-外源基因-TAG14克隆基因表达及基因干扰修课件常用的非融合型表达蛋白原核表达载体常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3pKK223-3抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因 tactac启动子启动子(trp-lac)(trp-lac) SDSD序列序列 AUGAUG起始密码起始密码转录终止

8、序列转录终止序列T1T1和和T2 T2 一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系15克隆基因表达及基因干扰修课件2.2.融合型表达蛋白融合型表达蛋白 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。白连接在一起的。优点：优点：u 具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。u 便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。 一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系16克隆基因表达及基因干扰修课件融合型表达系统主要有融合型表达系统主要有GSTGST系统系统HisHis系统系统金黄

9、色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A A系统系统-半乳糖苷酶系统半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统麦芽糖结合蛋白系统一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系17克隆基因表达及基因干扰修课件启动子：启动子：tac 操纵基因：操纵基因：lacP 调节基因：调节基因：lacI S-D序列序列ori：pBR322 ori 融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）GST系统系统-pGEX系列系列1、载体组成结构、载体组成结构:lacItac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacP18克隆基因表达及基因干扰修课件GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathio

10、ne Sepharose亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。GST系统系统-pGEX系列系列2、产物提纯、产物提纯:3、产物分离、产物分离:用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切下来。上切下来。柱（柱（column） GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column） GSTGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用19克隆基因表达及基因干扰修课件His-tag（组氨酸标签）：（组氨酸标签）：在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸个组氨酸（6His）His-tag能与能与Ni2+柱柱结合，但很容易被

11、咪唑（或结合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。His系统系统20克隆基因表达及基因干扰修课件21克隆基因表达及基因干扰修课件3 3. .分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白 载体表达出的外源蛋白质与细菌的载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽分泌信号肽连在连在一起，可被宿主菌分泌到细胞外。一起，可被宿主菌分泌到细胞外。 一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系pIN III系列载体系列载体pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,Ipplac Plac O S-D/ATG ompa插入位点插入位点

12、22克隆基因表达及基因干扰修课件（四）包涵体（四）包涵体 (inclusion body)一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、不溶性和无活性的蛋白质颗粒。不溶性和无活性的蛋白质颗粒。23克隆基因表达及基因干扰修课件（四）包涵体（四）包涵体 (inclusion body)1.1.包涵体的形成包涵体的形成 2.2.包涵体的分离与纯化包涵体的分离与纯化 3.3.包涵体的复性包涵体的复性 一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系24克隆基因表达及基因干扰修课件1.1.包涵体的形成包涵体的形成n表达产率

13、过高，超出细菌蛋白水解能力，产物积聚，与目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相关。n原核表达体系缺乏翻译后修饰酶类和辅助因子，中间产物易大量积聚。n发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点25克隆基因表达及基因干扰修课件有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性、复性操作才能回收活性，必须通过有效的变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。得到具有正确空间构象的目标蛋白。 缺点缺点 优点

14、优点26克隆基因表达及基因干扰修课件2.2.包涵体的分离与纯化包涵体的分离与纯化超声破碎菌体超声破碎菌体离心离心包涵体包涵体溶解包涵体溶解包涵体强蛋白质变性剂：强蛋白质变性剂：盐酸胍、尿素（盐酸胍、尿素（5-8mmol/L）3.3.包涵体的复性包涵体的复性逐步降低变性剂浓度，使表达蛋白恢复其天然构型27克隆基因表达及基因干扰修课件（一）酵母表达体系（一）酵母表达体系 （二）哺乳动物细胞表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系真核或病毒启动子真核或病毒启动子MCSPolyA信号信号终止子终止子外源基因外源基因28克隆基因表达及基因干扰修课件（一）酵母表达体系（一

15、）酵母表达体系 1.1.酵母表达载体酵母表达载体2.2.酵母表达外源性基因酵母表达外源性基因的形式的形式 二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast) cells29克隆基因表达及基因干扰修课件 1 1、酵母表达载体、酵母表达载体 n选择性标志选择性标志 大肠杆菌：大肠杆菌： Ampr、Tetr 酵母：酵母： Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; n复制子复制子 n启动子启动子n上游活性序列上游活性序列 转录起始点上游，可促进转录转录起始点上游，可促进转录n终止序列终止序列 n蛋白结构域蛋白结

16、构域 如：信号肽序列、核定位序列如：信号肽序列、核定位序列二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系（一）酵母表达体系 30克隆基因表达及基因干扰修课件2.2.酵母表达外源性基因的形式酵母表达外源性基因的形式 非分泌型非分泌型 分泌型分泌型 二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系分泌信号序列31克隆基因表达及基因干扰修课件Leu- 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色体上或整合到染色体上或独立在酵母细胞内独立在酵母细胞内转化转化Leu营养缺营养缺陷型培养基陷型培养基筛选筛选转化子克隆生长转化子克隆生长酵母载体酵母载体大肠杆菌大肠杆菌提

17、取提取插入外源基因插入外源基因鉴定克隆鉴定克隆发酵表达发酵表达外源基因产物外源基因产物分离、分离、纯化纯化 酵母转化和表达的一般过程酵母转化和表达的一般过程 32克隆基因表达及基因干扰修课件（二）哺乳动物细胞表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系1.1.哺乳动物细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体2.2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式3.3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系33克隆基因表达及基因干扰修课件（二）哺乳动物细胞表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系 1. 1.哺乳动物细胞表

18、达载体哺乳动物细胞表达载体 (1)(1)原核原核DNADNA序列序列 (2)(2)启动子启动子 (3)(3)增强子增强子 (4)(4)剪接信号剪接信号 (5)(5)遗传标记遗传标记 (6)(6)终止信号和多聚腺苷化的信号终止信号和多聚腺苷化的信号二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系34克隆基因表达及基因干扰修课件细胞系细胞系DNADNA转染方式转染方式最初的应用最初的应用CV-1CV-1SV40SV40病毒感染病毒感染表达野生型、突变蛋白表达野生型、突变蛋白CV-1/293CV-1/293腺病毒感染腺病毒感染表达野生型、突变蛋白表达野生型、突变蛋白COSCOS瞬时瞬时DEAE-DEAE-葡

19、聚糖葡聚糖在哺乳类细胞中表达，快速鉴在哺乳类细胞中表达，快速鉴定定cDNAcDNA克隆，表达突变蛋白。克隆，表达突变蛋白。NIH3T3NIH3T3逆转录病毒感染逆转录病毒感染转基因动物、在不同类型细胞转基因动物、在不同类型细胞中表达中表达鼠成纤维细胞鼠成纤维细胞MOPMOP瞬时瞬时DEAE-DEAE-葡聚糖葡聚糖快速鉴定快速鉴定cDNAcDNA克隆表达突变蛋克隆表达突变蛋白白CHO-DHFRCHO-DHFR稳定稳定DHFR+DHFR+转染转染用氨甲喋呤扩增用氨甲喋呤扩增高效稳定表达高效稳定表达灵长灵长/ /啮齿类啮齿类痘病毒痘病毒疫苗疫苗神经元细胞神经元细胞EBEB病毒载体病毒载体HSVHSV

20、病毒载体病毒载体克隆表达克隆表达基因转移基因转移2.2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系35克隆基因表达及基因干扰修课件 3. 3.哺乳动物细胞的瞬时表达哺乳动物细胞的瞬时表达 和稳定表达系统和稳定表达系统（1 1）COSCOS细胞瞬时表达系统细胞瞬时表达系统 （2 2）CHOCHO细胞稳定表达系统细胞稳定表达系统 二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系36克隆基因表达及基因干扰修课件用复制起点有缺陷的用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称得到的。所以称COS（CV-

21、1，Origin, SV40）COS细胞细胞37克隆基因表达及基因干扰修课件利用利用COS细胞表达外源基因细胞表达外源基因38克隆基因表达及基因干扰修课件克隆基因的表达及基因干扰克隆基因的表达及基因干扰第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达第二节第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定表达产物的分离、纯化与鉴定第三节第三节 基因表达干扰技术基因表达干扰技术39克隆基因表达及基因干扰修课件第二节第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定表达产物的分离、纯化与鉴定二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化三、表达产物的鉴定三、表达产物的鉴定一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化一、大肠杆

22、菌重组表达蛋白的分离与纯化40克隆基因表达及基因干扰修课件一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化 1.1.粗制品粗制品的分离纯化的分离纯化 2.2.精制品的分离纯化精制品的分离纯化 离心收集菌体超声波破碎离心收集上清热处理变性离心上清用硫酸铵沉淀凝胶层析、离子交换层析41克隆基因表达及基因干扰修课件二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化 1.1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化 以-蛋白酶抑制剂的纯化为例： 2.2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化以酵母表达干

23、扰素纯化为例： 收集酵母细胞玻璃珠破碎离心取上清DEAE Sepharose柱层析梯度洗脱收集活性部分浓缩葡聚糖凝胶G75柱层析收集、浓缩SDS-PAGE纯度鉴定发酵液用0.45m孔径滤膜过滤浓缩DEAE-Trisacryl柱层析梯度洗脱收集干扰素部分葡聚糖凝胶G75柱层析洗脱收集干扰素稀释层析聚焦缓冲液洗脱电泳鉴定42克隆基因表达及基因干扰修课件三、表达产物的鉴定三、表达产物的鉴定uWestern印迹（印迹（Western blotting）1.1.蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 2.SDS2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)(SDS-PAGE)3.3.蛋白

24、质的电转移蛋白质的电转移( (胶胶 膜膜) ) 43克隆基因表达及基因干扰修课件三、表达产物的鉴定三、表达产物的鉴定44克隆基因表达及基因干扰修课件三、表达产物的鉴定三、表达产物的鉴定 4. 4.靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测封闭封闭脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSA 靶蛋白与第一抗体反应靶蛋白与第一抗体反应 与第二抗体反应与第二抗体反应 HRP标记标记显色显色45克隆基因表达及基因干扰修课件三、表达产物的鉴定三、表达产物的鉴定46克隆基因表达及基因干扰修课件第七章第七章 克隆基因的表达及基因干扰克隆基因的表达及基因干扰第一节第一节 外源基因的表达外源基因的表达第二节第二节 表达产物的分离、纯化

25、与鉴定表达产物的分离、纯化与鉴定第三节第三节 基因表达干扰技术基因表达干扰技术47克隆基因表达及基因干扰修课件第三节第三节 基因表达干扰技术基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶三、小干扰三、小干扰RNA( small interference RNA, siRNA)四、微四、微RNA( microRNA)一、反义核酸技术一、反义核酸技术48克隆基因表达及基因干扰修课件一、反义核酸技术一、反义核酸技术 （二）（二）反义反义RNA技术技术 （三）反义核酸技术的应用（三）反义核酸技术的应用（一）反义寡核苷酸技术（一）反义寡核苷酸技术（反义反义DNA技术技术）49克隆基因表达及基因干扰

26、修课件（一）反义寡核苷酸技术（一）反义寡核苷酸技术1.1.反义寡核苷酸的作用机制反义寡核苷酸的作用机制2.2.反义寡核苷酸的设计与合成反义寡核苷酸的设计与合成 3.3.反义寡核苷酸的修饰反义寡核苷酸的修饰 4.4.反义寡核苷酸的给药途径反义寡核苷酸的给药途径 一、反义核酸技术一、反义核酸技术50克隆基因表达及基因干扰修课件（一）反义寡核苷酸技术（一）反义寡核苷酸技术 1.1.反义寡核苷酸的作用机制反义寡核苷酸的作用机制 (1) (1) 抑制抑制mRNAmRNA的翻译的翻译 (2) (2) 抑制复制或转录抑制复制或转录 (3) (3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达抑制蛋白质的加工、修饰及功能

27、表达一、反义核酸技术一、反义核酸技术51克隆基因表达及基因干扰修课件2 2、反义寡核苷酸的设计与合成、反义寡核苷酸的设计与合成 1 1）设计）设计 计算机软件预测计算机软件预测RNARNA的二级结构的二级结构 利用寡核苷酸随机文库鉴别利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNAmRNA上的上的RNaseHRNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNAmRNA进进行设计行设计 一、反义核酸技术一、反义核酸技术52克隆基因表达及基因干扰修课件 2 2）合成）合成 长度一般为长度一般

28、为15152525个核苷酸个核苷酸 G-CG-C含量为含量为60%60%65% 65% 一、反义核酸技术一、反义核酸技术53克隆基因表达及基因干扰修课件 3. 3.反义寡核苷酸的修饰反义寡核苷酸的修饰 最常见的是对最常见的是对ASONASON的骨架中的磷酸基团进行修饰的骨架中的磷酸基团进行修饰 （1 1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子 （2 2）甲基修饰磷酸骨架）甲基修饰磷酸骨架 （3 3）聚酰胺键代替磷酸骨架）聚酰胺键代替磷酸骨架一、反义核酸技术一、反义核酸技术54克隆基因表达及基因干扰修课件 4. 4.反义寡核苷酸的给药途径反义寡核苷酸的给药途径 （1 1）直接

29、作用于培养细胞）直接作用于培养细胞（2 2）结合）结合L-L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（3 3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径瘤体内注射或气雾吸入等途径 一、反义核酸技术一、反义核酸技术55克隆基因表达及基因干扰修课件（二）反义（二）反义RNARNA技术技术1.1.反义反义RNARNA的作用机制的作用机制 2.2.反义反义RNARNA的设计的设计 一、反义核酸技术一、反义核酸技术56克隆基因表达及基因干扰修课件（二）反义（二）反义RNARNA技术技术1.1.反义反义RNARNA的作用机制的

30、作用机制 (1) (1) 与引物与引物RNARNA前体互补结合，抑制前体互补结合，抑制DNADNA复制复制 (2) (2) 阻止目的阻止目的mRNAmRNA的成熟及向胞浆内转运的成熟及向胞浆内转运 (3) (3) 抑制抑制mRNAmRNA翻译翻译(4) (4) 使使mRNAmRNA更易被核酸酶识别而降解更易被核酸酶识别而降解一、反义核酸技术一、反义核酸技术57克隆基因表达及基因干扰修课件 2. 2.反义反义RNARNA的设计的设计 与与ASONASON相比，反义相比，反义RNARNA的设计较为简单的设计较为简单一、反义核酸技术一、反义核酸技术58克隆基因表达及基因干扰修课件（三）反义核酸技术的

31、应用（三）反义核酸技术的应用需要完善或解决的问题：需要完善或解决的问题： 防止被核酸酶降解防止被核酸酶降解 需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制 很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合的结合 ASONASON是否会影响正常细胞的基因表达是否会影响正常细胞的基因表达 用载体导入反义用载体导入反义RNARNA在体内表达时，存在安全性在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题和转染效率不高等问题 一、反义核酸技术一、反义核酸技术59克隆基因表达及基因干扰修课件二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶（一）核

32、酶：能够催化（一）核酶：能够催化RNA剪接的由剪接的由RNA组成的组成的酶。酶。Cech与与Altman分享了分享了1989年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。（二）脱氧核酶：（二）脱氧核酶：1994年年Breaker发现具有催发现具有催化功能的化功能的DNA分子。分子。60克隆基因表达及基因干扰修课件（一）核酶（一）核酶1.1.核酶的分类核酶的分类 2. 2.核酶的结构核酶的结构3.3.核酶的设计与修饰核酶的设计与修饰 4.4.核酶转移方法核酶转移方法5.5.核酶的应用核酶的应用二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶61克隆基因表达及基因干扰修课件（一）核酶（一）核酶 1.1.核酶的分类核酶的分类

33、 （1 1）大分子核酶：）大分子核酶： 第第类内含子、第类内含子、第类内含子、核糖核酸酶类内含子、核糖核酸酶P P （2 2）小分子核酶）小分子核酶 ： 锤头状锤头状RNARNA、发夹形、发夹形RNARNA、肝炎、肝炎D D病毒病毒RNARNA和和 neurospora Varkud satelliteneurospora Varkud satellite核酶核酶 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶62克隆基因表达及基因干扰修课件 2.2.核酶的结构核酶的结构（1 1）锤头状核酶：）锤头状核酶： 二级结构有三个二级结构有三个 螺旋环结构区和螺旋环结构区和 一个催化中心一个催化中心 二、核酶与

34、脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶H：除：除G以外的任一核苷酸以外的任一核苷酸不可逆的自切割反应63克隆基因表达及基因干扰修课件（2 2）发夹形核酶：）发夹形核酶： 二级结构分成两个结二级结构分成两个结构域，每个结构域由构域，每个结构域由 螺旋螺旋- -环环- -螺旋组成螺旋组成 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶可逆的自切割反应BNGUCB：除：除A以外的任一核苷酸以外的任一核苷酸N：任意核苷酸：任意核苷酸64克隆基因表达及基因干扰修课件二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶 3.3.核酶的设计与修饰核酶的设计与修饰 n设计三要素：高效、特异、稳定两方面：核酶核心与结合臂的设计 在底物RNA中选择最

35、佳剪切位点n化学修饰 主要是对核酶的磷酸二酯骨架的修饰、戊糖环 的修饰和碱基的修饰。65克隆基因表达及基因干扰修课件二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶n外源性转移 物理方法：裸露DNA直接注射、电脉冲介导、 显微注射微粒轰击等。 化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、 脂质体等。n内源性转移 病毒载体（逆转录病毒或腺病毒载体） 4.4.核酶转移方法核酶转移方法66克隆基因表达及基因干扰修课件二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶 5.5.核酶的应用核酶的应用已利用组合筛选法得到抑制乙肝病毒复制的发夹核酶、抑制丙肝病毒复制的锤头核酶、能在体外抑制艾滋病毒复制的核酶。为将核酶作为基因工程药物的

36、开发奠定了基础。67克隆基因表达及基因干扰修课件（二）脱氧核酶（二）脱氧核酶 1. 1.脱氧核酶的结构种类及特征脱氧核酶的结构种类及特征 2.2.脱氧核酶的催化特性脱氧核酶的催化特性 3.3.设计合成脱氧核酶的原则设计合成脱氧核酶的原则 4.4.脱氧核酶的应用脱氧核酶的应用二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶68克隆基因表达及基因干扰修课件（二）脱氧核酶（二）脱氧核酶 1.1.脱氧核酶的结构种类及特征脱氧核酶的结构种类及特征 （1 1）10-2310-23型脱氧核酶：型脱氧核酶： 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶嘌呤-嘧啶连接处69克隆基因表达及基因干扰修课件（2 2）8-178-17型脱

37、氧核酶：型脱氧核酶： 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶70克隆基因表达及基因干扰修课件2.2.脱氧核酶的催化特性脱氧核酶的催化特性 （1 1）RNARNA切割活性切割活性 （2 2）DNADNA连接酶活性连接酶活性 （3 3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性）卟啉金属化酶和过氧化酶活性 （4 4）DNADNA切割活性切割活性 （5 5）N-N-糖基化酶活性糖基化酶活性 （6 6）DNADNA激酶活性激酶活性 （7 7）DNADNA戴帽活性戴帽活性 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶71克隆基因表达及基因干扰修课件3.3.设计合成脱氧核酶的原则设计合成脱氧核酶的原则 （1 1）总核苷酸数不超过）

38、总核苷酸数不超过5050 （2 2）催化效率不低于核酶）催化效率不低于核酶 （3 3）具有广泛的）具有广泛的RNARNA切割功能切割功能 （4 4）能通过碱基配对与底物结合）能通过碱基配对与底物结合 （5 5）具有可重复性）具有可重复性二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶72克隆基因表达及基因干扰修课件4.4.脱氧核酶的应用脱氧核酶的应用 为治疗为治疗RNARNA病毒感染的疾病提供了一条新途径病毒感染的疾病提供了一条新途径 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶73克隆基因表达及基因干扰修课件三、小干扰三、小干扰RNARNA(siRNA)(siRNA) （二）（二）RNAi的作用机制的作用机制

39、（三）（三）siRNA的设计原则的设计原则 （四）（四）siRNA的制备方法的制备方法（六）（六）RNAi沉默效果的检测沉默效果的检测 （一）一般研究路线（一）一般研究路线（七）（七）RNAi的应用的应用（五）（五）siRNA的导入的导入74克隆基因表达及基因干扰修课件（一）一般研究路线（一）一般研究路线三、小干扰三、小干扰RNARNA75克隆基因表达及基因干扰修课件（二）（二）RNAiRNAi的作用机制的作用机制 1.1.起始阶段起始阶段 2.2.效应阶段效应阶段 3.3.倍增阶段倍增阶段 三、小干扰三、小干扰RNARNA76克隆基因表达及基因干扰修课件三、小干扰三、小干扰RNARNA77克

40、隆基因表达及基因干扰修课件（三）（三）siRNAsiRNA的设计原则的设计原则 1.siRNA1.siRNA中中G+CG+C碱基含量碱基含量30%30% -70%-70%，50%50%沉默效沉默效应较高。高。 2.siRNA 2.siRNA作用位点作用位点 避免起始密避免起始密码下游下游50-10050-100碱基碱基处、终止密止密码上上游游100bp100bp处及及55端非端非编码区。区。 3.siRNA 3.siRNA序列序列避免连续避免连续4 4个以上个以上A A及及3 3个个G/CG/C，须经，须经BLAST(hppt:/)BLAST(hppt:/)比对。比对。三、小干扰三、小干扰RN

41、ARNA78克隆基因表达及基因干扰修课件（三）（三）siRNAsiRNA的设计原则的设计原则 4.siRNA4.siRNA碱基数碱基数选择以选择以A A或或G G开始的开始的21-23bp21-23bp的目的的目的mRNAmRNA。 5. 5.环碱基数环碱基数一般为一般为9 9个碱基，个碱基，TTCAAGAGATTCAAGAGA 6. 6.对照系统对照系统将已设计将已设计siRNAsiRNA碱基序列随机排列，且与其他基碱基序列随机排列，且与其他基因无同源性。因无同源性。三、小干扰三、小干扰RNARNA79克隆基因表达及基因干扰修课件（四）（四）siRNAsiRNA的制备方法的制备方法 1.1.

42、化学合成法化学合成法 2.2.体外转录法体外转录法 3.RNase 3.RNase 消化法消化法 4.siRNA4.siRNA表达载体法表达载体法 5.siRNA5.siRNA表达框架法表达框架法 三、小干扰三、小干扰RNARNA80克隆基因表达及基因干扰修课件三、小干扰三、小干扰RNARNA小发夹RNA(Small hairpin RNA, shRNA)81克隆基因表达及基因干扰修课件siRNAsiRNA的合成方式及特点的合成方式及特点化学合成法化学合成法体外转录法体外转录法RNase RNase 消化消化法法siRNAsiRNA表达载体法表达载体法siRNAsiRNA表达框架法表达框架法核

43、酸特征核酸特征212123nt23nt双双链链RNARNA29nt29nt双链双链DNADNAT T7 7启动子后启动子后200200800 bp800 bp的转录模板的转录模板555560bp60bp双链双链DNADNA50bp50bp双链双链DNADNA制备时间制备时间4 4天天制备制备DNADNA双链后双链后2424小时小时制备转录模板制备转录模板后后2424小时小时制备双链制备双链DNADNA后后5 5天天制备制备DNADNA后约后约6 6小小时时转染时间转染时间短短中等中等中等中等长长中等中等测序测序需要需要需要需要不必不必需要需要需要需要标志标志可以可以可以可以可以可以不可不可不可

44、不可转染难易程度转染难易程度容易容易容易容易容易容易非常容易非常容易非常容易非常容易大规模制备大规模制备可以可以有限有限有限有限可以可以有限有限抗性筛选抗性筛选不可不可不可不可不可不可可以可以不可不可抑制作用时间抑制作用时间短短短短短短长长短短费用费用较高较高中等中等较低较低中等中等中等中等三、小干扰三、小干扰RNARNA（五）（五）siRNAsiRNA的导入的导入 1.1.脂质体或电穿孔脂质体或电穿孔 2.2.病毒携带病毒携带 3.3.细胞穿透肽细胞穿透肽 三、小干扰三、小干扰RNARNA83克隆基因表达及基因干扰修课件（六）（六）RNAiRNAi沉默效果的检测沉默效果的检测u mRNAmR

45、NA水平水平RT-PCR、realtime RT-PCR、Northern blottingu 蛋白质水平蛋白质水平Western blotting、ELISA、 免疫免疫荧光、流式光、流式细胞胞三、小干扰三、小干扰RNARNA84克隆基因表达及基因干扰修课件Kumar PP et al NCB, 2007RT-PCR85克隆基因表达及基因干扰修课件stable 14-fold CD8 knockdown by lentivirus siRNAsRubinson et al Nature Genetics, 2003Western blotting86克隆基因表达及基因干扰修课件（七）（七）R

46、NAiRNAi的应用的应用 1. 1.基因功能的研究基因功能的研究 2.2.基因剔除基因剔除 3.3.基因治疗基因治疗 4.4.细胞信号传导途径分析细胞信号传导途径分析 5.5.药物开发药物开发 三、小干扰三、小干扰RNARNA87克隆基因表达及基因干扰修课件Breakthrough of the YearmiRNA - 2002 四、微四、微RNA(microRNA)RNA(microRNA)88克隆基因表达及基因干扰修课件MicroRNAs (miRNAs)是一种进化上保守，长2123nt，非编码的单链小RNA分子。Eva van Rooij Circ. Res. 2011;108;219

47、-234四、微四、微RNA(microRNA)RNA(microRNA)89克隆基因表达及基因干扰修课件mRNAmiRNANo translation四、微四、微RNA(microRNA)RNA(microRNA)MicroRNAs 在翻译水平调控基因的表达，绝大多数蛋白编码基因(人类约1/3的mRNA)受其调控。90克隆基因表达及基因干扰修课件四、微四、微RNA(microRNA)RNA(microRNA)（二）（二）miRNAmiRNA的作用机制的作用机制 （三）（三）siRNAsiRNA与与microRNAmicroRNA的区别的区别（四）（四）miRNAmiRNA的生物学功能的生物学功

48、能 （一）（一）miRNAmiRNA的命名的命名91克隆基因表达及基因干扰修课件miR-#miR-#（# #代表数字）表示代表数字）表示miRNAmiRNAmir-#mir-#（# #代表数字）表示相应的编码基因代表数字）表示相应的编码基因 （一）（一） miRNAmiRNA的命名的命名四、微四、微RNARNA92克隆基因表达及基因干扰修课件miRBase Human miRNAs ( Jan 17, 2011) 93克隆基因表达及基因干扰修课件（二）（二）miRNAmiRNA的作用机制的作用机制 1. 1.起始阶段起始阶段 2.2.成熟阶段成熟阶段 3.3.功能阶段功能阶段 四、微四、微RN

49、ARNA94克隆基因表达及基因干扰修课件（三）（三）siRNAsiRNA与与microRNAmicroRNA的区别的区别 共同点共同点 由由2222个左右的核苷酸组成个左右的核苷酸组成 是是DicerDicer酶的产物酶的产物 需需ArgonateArgonate家族蛋白的存在家族蛋白的存在 与与RISCRISC形成复合物起干扰、调节作用形成复合物起干扰、调节作用 可在转录后、翻译水平上干扰靶可在转录后、翻译水平上干扰靶mRNA mRNA 四、微四、微RNARNA95克隆基因表达及基因干扰修课件siRNAsiRNA与与microRNAmicroRNA的不同的不同siRNAsiRNAmicroR

50、NAmicroRNA外源性外源性内源性内源性由长由长dsRNAdsRNA经经DicerDicer酶切割得到酶切割得到由由pre-miRNApre-miRNA经经DicerDicer酶切割而来酶切割而来双链双链单链单链与靶与靶mRNAmRNA完全互补配对完全互补配对与靶与靶mRNAmRNA并不完全互补并不完全互补AGO2AGO2蛋白蛋白AGO1AGO1蛋白蛋白降解降解mRNAmRNA而抑制蛋白质翻译而抑制蛋白质翻译 阻止阻止mRNAmRNA的翻译而不降解靶的翻译而不降解靶mRNAmRNA抑制转座子活性和病毒感染抑制转座子活性和病毒感染还可作为合成蛋白质的模板；表达还可作为合成蛋白质的模板；表达具有时序性、保守性和组织特异性具有时序性、保守性和组织特异性四、微四、微RNARNA97克隆基因表达及基因干扰修课件（四）（四）miRNAmiRNA的生物学功能的生物学功能 miRNAmiRNA与生物体的阶段性发育密切相关，可与生物体的阶段性发育密切相关，可以使特异基因在翻译水平被抑制以使特异基因在翻译水平被抑制 四、微四、微RNARNA98克隆基因表达及基因干扰修课件99克隆基因表达及基因干扰修课件Thanks！100克隆基因表达及基因干扰修课件