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1、基因重组与基因工程Genetic Recombination & Genetic Engineering 基因重组与基因工程课件基因研究的三步曲一、20世纪50年代以前：染色体遗传学阶段二、20世经50年代70年代： 基因的分子生物学阶段三、20世经70年代至今： DNA重组工程学的发展，基因研究走向 反向生物学阶段 基因重组与基因工程课件基本概念基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程第一节 自然界的基因转移与重组一、接合作用(conjugation)二、转化(transformation)及转导(transduction)三、转座(transposition)四、基因重组第二节 重组DNA
2、技术一、重组DNA技术相关概念二、重组DNA技术基本原理三、重组DNA技术与医学的关系基因重组与基因工程课件接合作用：接合作用：当细当细胞与细胞、或细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互菌通过菌毛相互接触时，质粒接触时，质粒DNADNA就可以从一个细就可以从一个细胞（细菌）转移胞（细菌）转移至另一细胞（细至另一细胞（细菌）的方式。菌）的方式。一、接合作用(conjugation)基因重组与基因工程课件转化：转化：通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 二、转化(transformation
3、)基因重组与基因工程课件转导转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的间的DNA转移及基因重组即为转导作用转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)基因重组与基因工程课件*转染(transfection)l转染是转化的一种特殊形式。 由由transformation（转化）和化）和 infection（感染）（感染）两两词构成。构成。l原指将噬菌体、病毒或以其原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重体构建的重组子子导入受体入受体细胞的胞的过程。程
4、。l通过感染方式感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改性状改变的过程称为转染。l将任何将任何类型型DNA转移至移至动物物细胞内的胞内的过程均可叫程均可叫转染。染。基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件第二节 重组DNA技术基因重组与基因工程课件一、重组DNA技术相关概念（一）（一）DNA克隆克隆克克 隆隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化：克隆化：获取同一拷贝的过程。 DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重组克隆（分子克隆、基因克隆
5、、重组DNA ）：）：应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质与载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。基因重组与基因工程课件基 因 工 程基因工程：基因工程：重组DNA工艺学生物工程生物工程基因工程基因工程蛋白质工程酶工程细胞工程基因重组与基因工程课件基 因 工 程 基因工程：基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆，产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。基
6、因重组与基因工程课件（二）工具酶 工具酶工具酶 功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶 催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基形成二酯键羟基形成二酯键DNA聚合酶聚合酶I a.合成合成cDNA的第二条链的第二条链b.缺口平移缺口平移c.测序测序d.补平补平反转录酶反转录酶 合成合成cDNA多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化末端转移酶末端转移酶 同聚物加尾同聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基基因重组与基因工程课件限制性核酸内切酶限制性核酸
7、内切酶主主要要来来源源于于原原核核生生物物，具具有有识识别别自自身身DNA或或异异源源DNA的的功功能能，通通过过切切割割破破坏坏或或限限制制异异源源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。分子侵入宿主细胞来保护自身。识别特性：识别特性：具有双链对称的回文结构具有双链对称的回文结构 5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 5 基因重组与基因工程课件Restriction-modification system1.restriction endonuclease2.methylase3.Sticky end Blunt end基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件限制
8、性核酸内切酶限制性核酸内切酶命名命名：H in d III 属属 种种 株株 同一株具不同特异性酶同一株具不同特异性酶分类分类：I、II、III类，常用类，常用 II类类异源同功酶异源同功酶：识别及切割位点相同识别及切割位点相同同尾酶同尾酶：产生相同的粘性末端产生相同的粘性末端 BamH I: GGATCC Sau3A I: GATC基因重组与基因工程课件（三）目的基因cDNA：complementary DNA经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。基因组DNA：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。基因重组与基因工程课件（四）基因载体（四）基因载体克隆载体（cloning v
9、ector)携带目的基因、并实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。可充当克隆载体的DNA分子有：质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件l常用的常用的为SV40，通通过感染方式将其感染方式将其DNA送入哺送入哺乳乳动物物细胞中胞中进行增殖。目前行增殖。目前应用相用相对较少。少。 基因重组与基因工程课件载 体(vector)供插入目的基因并将其导入宿主细胞内供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具表达或复制的运载工具l载体具备条
10、件载体具备条件l1 1. .自主稳定复制自主稳定复制l2.2.多克隆位点多克隆位点l3.3.遗传标记遗传标记l4.4.插入容量大插入容量大l5.5.分子量小，拷贝多分子量小，拷贝多l6.6.安全安全l载体的分类载体的分类l按来源：质粒、噬菌体、按来源：质粒、噬菌体、病毒病毒l按产物：克隆载体、表按产物：克隆载体、表达载体达载体l按宿主细胞：原核细胞按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体载体、真核细胞载体基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件二、重组二、重组DNADNA技术的基本原理技术的基本原理1. 目的基因的获取目的基因的获取2. 克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建3. 外源基因
11、与载体的连接外源基因与载体的连接4. 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌5. 重组体的筛选重组体的筛选6. 克隆基因的表达克隆基因的表达基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件DNA克隆的基本过程1.分：分：分离目的基因2.切：切：对目的基因和载体适当切割3.接：接：目的基因与载体连接4.转：转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛：筛选出含有重组体的受菌体基因重组与基因工程课件一、分载体和目的基因的分离（一）载体（一）载体 1. 质粒质粒 2. 噬菌体噬菌体 3. 病毒病毒 常用逆转录病毒、腺病毒常用逆转录病毒、腺病毒基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件( (二二
12、) )目的基因的来源目的基因的来源 1. 从染色体从染色体DNA中分离中分离 2. 人工合成人工合成 3. 从从mRNA合成合成cDNA 4. 基因文库基因文库基因重组与基因工程课件二、切限制性内切酶的应用 酶酶 辨认的序列和切口辨认的序列和切口 说明说明BamH GGATCC 六核苷酸 CCTAGG 粘端切口EcoR GAATTC 六核苷酸 CTTAAG 粘端切口Sma CCCGGG 六核苷酸 GGGCCC 平端切口基因重组与基因工程课件三、接 把载体和目的基因连接成重组体 1. 粘端连接粘端连接 2. 平端连接平端连接 3. 尾接法尾接法基因重组与基因工程课件基因重组与基因工程课件四、转重
13、组体的转化1. 重组体导入大肠杆菌重组体导入大肠杆菌（1）氯化钙法）氯化钙法（2）电击法）电击法（3）体外包装法）体外包装法2. 重组体导入哺乳动物细胞重组体导入哺乳动物细胞（1）磷酸钙共沉淀法）磷酸钙共沉淀法（2）脂质体介导法）脂质体介导法（3）病毒感染法）病毒感染法（4）显微注射法）显微注射法基因重组与基因工程课件五、筛 DNA重组体的筛选与鉴定1.根据重组载体的表型进行筛选根据重组载体的表型进行筛选2.DNA限制酶切图谱分析限制酶切图谱分析3.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定 基因重组与基因工程课件基因工程技术策略分：分： 基因载体基因载体 目的基因目的基因 质粒质粒 噬菌体噬菌体 病毒病毒 直接分离直接分离 cDNA 人工合成人工合成 基因文库基因文库切：切： 限制性内切酶限制性内切酶 有缺口的载体有缺口的载体 目的基因目的基因接：接： 连接酶连接酶 粘端连接粘端连接 平端连接平端连接 尾接法尾接法 重组体重组体转：转： 转化转化 转染转染 体外包装体外包装 带重组体的宿主带重组体的宿主筛：筛： 表型筛选表型筛选 电泳法电泳法 核酸杂交核酸杂交基因重组与基因工程课件
