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1、基因结构与表达分析的基本策略基因结构与表达分析的基本策略StrategyforStructureandExpressionAnalysesofGenes分子生物学系分子生物学系1基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件2分子生物学的三大核心技术分子生物学的三大核心技术DNADNA序列分析序列分析DNADNA测序，测序，19771977聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA扩增，扩增，19851985DNADNA重组技术重组技术基因克隆，基因克隆，197319732基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件一、DNA序列分析二、核酸分子杂交三、聚合
2、酶链式反应三、聚合酶链式反应四、四、基因芯片和微阵列基因芯片和微阵列五、五、 WesternWestern免疫印迹免疫印迹主要内容3基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（一）（一）双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法(Sanger,1977)一、一、DNA序列分析序列分析（二）（二）DNA自动化序列分析自动化序列分析（三）化学降解法（三）化学降解法(Gilbert ,1977)4基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件FrederickSanger1918WalterGilbert1932TheNobelPrizeinChemistry1980P
3、aulBerg19265基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件DNA测序技术基础：测序技术基础：高高分分辨辨率率变变性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（ polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）技技术术，可可分分离离差差别别仅仅1个个碱碱基基的的单链寡核苷酸单链寡核苷酸DNA片段。片段。6基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件( (一）双脱氧末端终止法一）双脱氧末端终止法（dideoxychaintermination）7基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件ATP、dA
4、TP和和ddATP的结构的结构ATPAOHOHHHdATPddATPNTP: 核苷三磷酸核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；的合称；dNTP: 脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；8基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件掺入掺入N个核苷酸个核苷酸DNA合成反应模式图合成反应模式图9基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件DNADNA单链模板单链模板引物引物 掺入掺入ddNTPddNTP延伸的新合成链延伸的新合成链 末端终止末端终止1
5、0基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件1.双脱氧末端终止法原理双脱氧末端终止法原理 DNADNA合成反应中，合成反应中，ddNTPddNTP不存在不存在3-OH3-OH末端末端，故不能与下一个核苷酸，故不能与下一个核苷酸的的5-5-磷酸基团磷酸基团形成形成33，5-5-磷酸二磷酸二酯键，导致酯键，导致DNADNA新链的延伸提前终止于新链的延伸提前终止于ddNTPddNTP 。11基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5T4711G A A T G A 3A
6、CG CT12基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件2. DNA2. DNA测序主要步骤测序主要步骤13基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件A A反应管反应管G G反应管反应管G G反应管反应管T T反应管反应管C C反应管反应管T T反应管反应管14基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件15基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件GATC16基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 变性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 单链单链DNADNA模板的制备模板的制备 DN
7、ADNA模板与测序引物退火模板与测序引物退火 掺入法标记反应掺入法标记反应 延伸延伸- -终止反应终止反应 放射自显影放射自显影 阅读测序结果阅读测序结果测序步骤测序步骤 17基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（二）（二）DNA测序自动化原理测序自动化原理采采用用4种种不不同同的的荧荧光光分分别别标标记记4种种ddNTP终终止止反反应应产产物物，替替代代放放射射性性同同位位素素标标记记是是实实现现DNA测测序序自自动动化的基础。化的基础。18基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdT
8、TPdGTP5TG A A T G A 3ACG CT19基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件20基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件表示一个表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为别为C和和T,因此该位点为因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一杂合型，如果该位点只有一个峰个峰C或者或者T，则该位点基因型为，则该位点基因型为CC或或TT纯合型纯合型21基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件DNA自动测序步骤自动测序步骤4种不同荧光染料标记终止物种不同荧光染料
9、标记终止物ddNTPsSanger测序反应测序反应反应产物反应产物同一同一泳道电泳分离泳道电泳分离激光激发不同大小激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光荧光信号采集、计算机分析与荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序自动排序22基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries23基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 与末端终止法不同，与末端终止法不同，化学化学降解法是建立在对
10、原有降解法是建立在对原有DNADNA的的化学降解过程基础上。化学降解过程基础上。 （三）化学降解法（三）化学降解法24基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 将待测将待测DNADNA片段片段33或或55端进行同位素端进行同位素标记，标记的标记，标记的DNADNA片段分成五个反应，分别片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使切割，使DNADNA片段分别于某一种（类）碱基片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离处断裂。电泳分离5 5组组DNADNA混合物，放射自混合物，放射自显影检测末端标记的显影检测末端标记
11、的DNADNA链的电泳区带位置。链的电泳区带位置。化学降解法化学降解法原理原理25基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 化学降解化学降解G G反应模式图反应模式图 硫酸二甲酯硫酸二甲酯哌啶哌啶MetMetMetMet26基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件最新测序技术最新测序技术454技术技术(Roche )焦磷酸测序（焦磷酸测序（Pyrosequencing） Solexa测序技术测序技术(Illumina )SOLiD技术技术(ABI )连接法测序连接法测序27基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件举例：举例
12、：Solexa测序测序HiSeq 200028基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件Solexa测序：在一个反应中同时加入测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（种核苷的标签，采用边合成边测序（SBSsequencingbysynthesis）。）。完成人类基因组草图不同测序仪的比较图完成人类基因组草图不同测序仪的比较图29基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件二、核酸分子杂交（NucleicAcidHybridization）（一）（一）Southern印迹杂交：检测印迹杂交：检测DNA(Southernblothybr
13、idization)SouthernEM,1975（二）（二）Northern印迹杂交：检测印迹杂交：检测RNA(Northernblothybridization)StarkGR，197730基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件核酸分子杂交原理核酸分子杂交原理 标记的标记的单链核酸探针单链核酸探针与待检测的与待检测的靶单链靶单链DNA或或RNA局部互补结合形成局部互补结合形成杂交双链。杂交双链。 应用：应用：核酸靶核酸靶DNA或或RNA序列的序列的定性与定量分析。定性与定量分析。31基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件32基因结构与表达
14、分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件33印迹技术印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到大分子转移到NCNC等各种膜上，使之成为固等各种膜上，使之成为固相化分子。相化分子。 这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为的墨迹，因此称之为“blottingblotting”, , 译为译为印迹技术。印迹技术。33基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件34探针技术探针技术 用放射性核素、生物素或荧光染料标用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸记其
15、末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为链被称为“探针探针”。 探针可以与固定在探针可以与固定在NCNC膜上的核苷酸结膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。合，判断是否有同源的核酸分子存在。 34基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件Southern印迹杂交原理印迹杂交原理将电泳分离的将电泳分离的待测待测DNA片段结合到一片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。中标记的核酸探针进行杂交的过程。（一）（一）Southern印迹杂交印迹杂交应用：应用：DNADNA（基因组（基因组DNADNA
16、）分子的定性或定）分子的定性或定 量分析。量分析。35基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件1.制备基因组制备基因组DNA2.用限制性内切核酸酶消化基因组用限制性内切核酸酶消化基因组DNA3.琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段酶切片段4.凝胶预处理凝胶预处理（如强碱，（如强碱，DNA双链变为单链）双链变为单链） 5.Southern印迹转移印迹转移6.标记核酸探针、探针与标记核酸探针、探针与DNA片段杂交片段杂交7.杂交结果显示杂交结果显示Southern印迹杂交基本过程印迹杂交基本过程36基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课
17、件Southern印迹杂交示意图印迹杂交示意图37基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件将电泳分离的将电泳分离的待测待测DNA片段结合到一片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。中标记的核酸探针进行杂交的过程。38基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件39基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 地中海贫血的地中海贫血的Southernblot基因诊断基因诊断（1）仅一条染色体上的一个）仅一条染色体上的一个基因缺失或缺陷，则基因缺失或缺陷，则链的合
18、成部分受抑制，称链的合成部分受抑制，称为为+地贫；地贫；（2）每条染色体上的）每条染色体上的2个个基因均缺失或缺陷，称为基因均缺失或缺陷，称为0地贫；地贫； (3) 1、2序列基本一致；序列基本一致； 基因不同程度的缺失可引起不同类型的基因不同程度的缺失可引起不同类型的 地中海贫血。地中海贫血。12+0+00040基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe 地中海贫血的直接基因诊断地中海贫血的直接基因诊断41基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件/-/-/-/- 正常正常缺缺1缺缺2缺缺3
19、缺缺414kb10kb42基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交(Northernblothybridization)指将指将RNA变性及电泳分离后，并转变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定中特定mRNA分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。用于用于mRNA进行定性和定量分析。进行定性和定量分析。43基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblo
20、thybridization28S18S应用举例应用举例44基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件GAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot杂交分析杂交分析mRNA的表达的表达靶靶mRNA3-磷酸甘油醛脱氢酶45基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件46三、其他杂交技术三、其他杂交技术1.斑点杂交斑点杂交(dotblothybridization）将将RNA或或DNA变性后变性后直接点样于硝酸纤维素膜直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定中特定基因及其表达的定性及定量研究。性及定量
21、研究。46基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件472.原位杂交原位杂交（in situhybridization）用标记的核酸探用标记的核酸探针与组织切片或细胞针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对行定性、定位和相对定量分析。定量分析。 47基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 3 3核酸酶核酸酶S1 S1 保护分析法保护分析法 (nuclease S1 protection (nuclease S1 protection assayassay） 单单链链DNADNA探
22、探针针与与待待测测RNARNA形形成成DNA/RNADNA/RNA杂杂交交双双链链，加加入入核核酸酸酶酶S1S1专专一一性性地地降降解解未未形形成成杂杂交交体体的的DNADNA或或RNARNA单单链链，DNA/RNADNA/RNA杂杂交交双双链链则则受受到到保保护护而而不被降解。不被降解。 48基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件4RNA酶保护分析法酶保护分析法（RNaseprotectionassay，RPA）49基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件RPA基本程序：基本程序：待测待测RNARNA的分离的分离体外转录标记体外转录标记RNA
23、RNA探针探针待测待测RNARNA与探针与探针RNARNA进行液相杂交进行液相杂交RNA酶消化酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离50基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件三、聚合酶链式反应三、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)（一）（一）PCRPCR技术原理技术原理（二）耐热（二）耐热DNADNA聚合酶聚合酶（三）（三）PCRPCR引物及设计原则引物及设计原则（四）（四）PCRPCR条件的优化条件的优化 （五）（五）PCRPCR改进技术改进技术（六）其它（六）其它PCR技术技术51基因结构与表达分析的基
24、本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR):（一）（一）PCRPCR技术原理技术原理MullisK.1985年发明的一种模拟天年发明的一种模拟天然然DNA复制过程的核复制过程的核酸体外扩增技术。酸体外扩增技术。 TheNobelPrizeinChemistry199352基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件The replication of DNA53基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 原原理理：PCRPCR是是模模拟拟天天然然DNADNA复复制制过过程程，利利用用DNA DNA 聚聚合合酶酶催催
25、化化一一对对引引物物间间特特异异DNADNA片片段段合合成成的的体体外外扩扩增增技技术术。 其其主主要要热热循循环环过过程程为为：变变性性、退火、延伸三个步骤。退火、延伸三个步骤。54基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件1.PCR循环由三步组成：循环由三步组成：变性变性（denaturation）退火退火（annealing）延伸延伸（extension）高温高温合适温度合适温度合适温度合适温度55基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件56基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件57基因结构与表达分析的基本策略课件基
26、因结构与表达分析的基本策略课件2.PCR扩增终产物大小扩增终产物大小: 介介于于两两条条退退火火引引物物55末末端端之之间间的的双链双链DNA片段片段。循环一循环一58基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件循环二循环二59基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件循环三循环三60基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件一对引物：正向和反向一对引物：正向和反向限制了限制了PCR扩增的片段的范围扩增的片段的范围5/5/3/3/5/5/3/3/61基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件5CAGTTAAG
27、GGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGCAGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AG
28、TGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG 3GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT3.引物设计实例引物设计实例62基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件Y=A（1+E）nY:扩增产物的量扩增产物的量A:最初靶最初靶DNA分子数分子数E:PCR扩增效率扩增效率n:循环次数循环次数3.PCR产量产量当当E100,A=1时时Y=2n2n(引物延伸产物的量）引物延伸产物的量）63基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（二）平台期与平台效应（二）平台期与平台效应1.平台效应平台效应（platea
29、ueffect）：）：PCR经过一定数量的循环后，经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，长期或静止期，即平台效应即平台效应。影响因素：影响因素：引物及引物及dNTP底物浓度降低。底物浓度降低。酶与模板比例下降。酶与模板比例下降。64基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件PCR平台效应平台效应65基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（二）耐热（二）耐热DNADNA聚合酶聚合酶1.TaqDNA聚合酶（聚合酶（实现了实现了PCR自动化）自动化） 从嗜热水生菌从嗜热水生菌the
30、rmus aquaticsYT-1株中株中直接分离出来。直接分离出来。95的半衰期的半衰期:40min最适温度最适温度:7280催化反应催化反应速率速率:150300核苷酸核苷酸/秒秒/酶分子酶分子66基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件67基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件TaqDNA聚合酶特性：聚合酶特性：53聚合酶活性；聚合酶活性；53外切酶活性；外切酶活性；较弱的非模板依赖性；较弱的非模板依赖性；缺乏缺乏35外切酶活性。外切酶活性。68基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件PCRthermalcycle
31、r69基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件PCRPCR产物的产物的琼琼脂糖凝胶电泳分析脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物产物70基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件无机离子及抑制剂的影响无机离子及抑制剂的影响 TaqDNA聚合酶的活性聚合酶的活性对对Mg2+浓浓度和单价离子（度和单价离子（K+或或NH4+）的性质和）的性质和浓度较敏感。浓度较敏感。最适最适Mg2+浓度浓度：2mmol/LK+浓度浓度：50mmol/L71基因结构与表达分析的基本
32、策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件u几种高保真的耐热几种高保真的耐热DNA聚合酶聚合酶1.TthDNA聚合酶聚合酶2.VentDNA聚合酶聚合酶3.Pfu DNA聚合酶聚合酶72基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（三）（三）PCRPCR引物设计原则引物设计原则引物的化学本质是什么？引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸单链寡核苷酸DNA或或RNA片段。片段。DNA复制引物：单链复制引物：单链RNA片段片段PCR引物：引物：单链单链DNA片段片段73基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件PCR引物设计原则引物设计原则：1.1.引物与模板的
33、序列要完全互补引物与模板的序列要完全互补2.2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构或发夹结构3.3.引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNADNA聚合反应聚合反应( (错配错配) )74基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件5CACTGAACGTAGGCCT33GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5特异扩增特异扩增5CACTGAACGTAGGCCT33GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5错误引发错误引发1.引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序
34、列要紧密互补2. 2. 引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发 DNADNA聚合反应聚合反应( (错配错配) )75基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件引物之间应避免引物之间应避免33端互补端互补3.3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构或发夹结构76基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件引物自身不应形成发夹结构引物自身不应形成发夹结构77基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件4.4.其它原则其它原则: : 引物长度引物长度引物长度引物长度: 10:
35、 10: 10: 1030 nt30 nt30 nt30 nt 碱基分布碱基分布碱基分布碱基分布: A: A: A: A、T T T T、G G G G、C C C C 随机分布随机分布随机分布随机分布 G+CG+CG+CG+C含量含量含量含量：40 40 40 40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T)60% Tm=4(G+C)+2(A+T)60% Tm=4(G+C)+2(A+T)60% Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物引物33末端碱基末端碱基：最好选：最好选T T、C C、G G，不选，不选A A 避免出现避免出现3 3个以上的连续碱基，如个以上的连续碱基，如GGGGGG或或CC
36、CCCC 引物引物55末端碱基可不与模板末端碱基可不与模板DNADNA互补互补78基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件1A260oligoDNA33gN:引物引物碱基数碱基数X：合成的：合成的oligoDNAA260单位单位Y：引物的：引物的pmol数数106Y（pmol）=X33330.NX=105N2.引物用量计算引物用量计算79基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件模板模板引物引物TaqDNA聚合酶聚合酶dNTPMg2+退退火火变变性性延延伸伸PCR反应反应80基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（四）（四
37、）PCRPCR条件的优化条件的优化1.TaqDNA聚合酶浓度：聚合酶浓度： 1.02.5U/100l反应液反应液 2.dNTP浓度：浓度：20200mol/L 3.Mg2+浓度：浓度：0.52.5mmol/L 4.引物浓度：引物浓度：0.10.5mol/L81基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（五）（五）PCR改进技术改进技术1.RT-PCR(reversetranscriptionPCR) 以以mRNAmRNA为模板逆转录合成为模板逆转录合成cDNAcDNA，再以此再以此cDNAcDNA为模板进行为模板进行PCRPCR反应反应。82基因结构与表达分析的基本策略课
38、件基因结构与表达分析的基本策略课件RT-PCR原理原理83基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件逆转录酶逆转录酶AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最适温度酶活性最适温度42MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最适温度）：最适温度3784基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件2.定量定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量半定量RT-PCR 以样本以样本mRNA为模板逆转录为模板逆转录合成合成cDNA，在不同引物对引导，在不同引物对引导下共同下共同PCR扩增扩增“看家看家”基因基因和和
39、目的基因目的基因cDNA。85基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件选择内对照基因选择内对照基因组织中普遍表达、表达量比组织中普遍表达、表达量比较恒定的较恒定的“看家看家”基因基因mRNA。如如GAPDH和和-actinmRNA等。等。半定量标准半定量标准 计算计算PCR产物产物：靶靶cDNA/GAPDHcDNA86基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析87基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件88基因结构与表达分析的基本策略
40、课件基因结构与表达分析的基本策略课件3.实时荧光定量实时荧光定量RT-PCRReal-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCRPCR扩增指数期内极小的扩增效扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。率改变会极大地影响产量。应用：用应用：用于基因于基因DNA拷贝数和拷贝数和mRNA表达定量分析。表达定量分析。89基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件荧光染料荧光染料90基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件91基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 每形成一个每形成一个DNADN
41、A双链，双链，就有一定数量的染料结合就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生上去，染料一结合就产生荧光信号，荧光信号，信号强度与信号强度与DNADNA分子总数目成正比分子总数目成正比。92基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件TaqManProbe 一一种种水水解解式式荧荧光光标标记记探探针针。寡寡核核苷苷酸酸探探针针的的5端端标标记记一一个个荧荧光光报报告告基基团团（reporter ），3端端标标记记一一个个荧荧光光淬淬灭灭基基团团（quencher ）。）。93基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 每产生一条每产生一条DNADNA
42、链，就切断一条探针，链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的信号强度与结合探针的DNADNA分子数成正比分子数成正比。94基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件。 分子信标探针（分子信标探针（MolecularBeaconProbe）该该探探针针具具有有发发夹夹结结构构，5端端标标记记荧荧光报告基团，光报告基团，3端标记淬灭基团。端标记淬灭基团。95基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发
43、出荧光。与淬灭染料分离，发出荧光。96基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR计算原理计算原理PCR扩增效率的差异使相同的样品扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异最终产量有很大差异97基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件98基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件CT或或Tc或或Ct值：值：临临界界点点循循环环（Thresholdcycle），即即从从基线到指数增长的拐点所对应的循环数基线到指数增长的拐点所对应的循环数99基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基
44、本策略课件100基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件传染病诊断、监测与疗效预后评估：传染病诊断、监测与疗效预后评估：揭示疾病发病机制揭示疾病发病机制101基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 荧光定量荧光定量PCR仪仪带有激发光源和荧光信号检测系统带有激发光源和荧光信号检测系统的的PCR仪，配有电脑系统及分析软件。仪，配有电脑系统及分析软件。102基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件（六）其它（六）其它PCR技术技术1.反向反向PCR（inversePCR）原理）原理103基因结构与表达分析的基本策略课件基因结
45、构与表达分析的基本策略课件2. Alu-PCR 104基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件3. 原位原位PCR(in-situ PCR)4. 巢式巢式PCR（nested PCR） 5. 不对称不对称PCR（asymmetric PCR） 105基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件 DNAChipandMicroarray 四、四、 基因芯片和微阵列基因芯片和微阵列基因芯片上的阵列是由有规则排列的基因芯片上的阵列是由有规则排列的cDNA或寡核苷酸等样本所组成的或寡核苷酸等样本所组成的。106基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分
46、析的基本策略课件宏阵列宏阵列(Macroarray)高密度高密度微阵列微阵列(Microarray)举例：举例：HPV诊断芯片诊断芯片107基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件DNADNA微阵列：微阵列：寡核苷酸微阵列（寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）cDNA微阵列（微阵列（cDNAmicroarray）在在一一微微小小的的基基片片（硅硅片片等等）表表面面集集成成了了大大量量分分子子识识别别探探针针，能能够够平平行行分分析析大大量量基基因因转转录录表表达达，因因此此又又被被称称为为cDNA芯片。芯片。108基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表
47、达分析的基本策略课件DNA芯片（芯片（cDNA芯片）主要技术流程：芯片）主要技术流程：样品荧光标记及芯样品荧光标记及芯片制备片制备 杂交反应及过程控杂交反应及过程控制制杂交信号检测杂交信号检测 信号分析与解读信号分析与解读109基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件CBACy5-标记标记cDNACy3-标记标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品样品1样品样品2Cy5/Cy3荧光标记荧光标记RNARNA提取提取竞争性杂交显示竞争性杂交显示基因表达量差异基因表达量差异二种样品竞争性杂交示意图二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理110基因结构与表达分析
48、的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件DNA芯片技术的主要应用芯片技术的主要应用1.1.基因组分析及发现新的基因基因组分析及发现新的基因2.2.基因表达的研究基因表达的研究3.3.DNADNA序列分析序列分析4.4.基因诊断和基因药物设计基因诊断和基因药物设计111基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件五、五、 WesternWestern免疫印迹免疫印迹Westernblotting原原理理与与核核酸酸分分子子杂杂交交相相似似，只只是是以以偶偶联联标标记记物物的的抗抗体体分分子子作作为为探探针针，检检测测转转移移到到固固相支持物上的相支持物上的蛋白质蛋白质分
49、子。分子。112基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件Western免疫印迹信号检测原理免疫印迹信号检测原理113基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件1.蛋白质样品制备蛋白质样品制备2.SDS-PAGE分离分离3.蛋白质转膜蛋白质转膜Westernblot程序程序114基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件4.抗体与抗原杂交抗体与抗原杂交5.信号检测分析信号检测分析115基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件谢谢大家！谢谢大家！116基因结构与表达分析的基本策略课件基因结构与表达分析的基本策略课件
