基因工程10DNA重组技术课件

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1、基因工程10DNA重组技术课件Geneengineering原理与实践基因工程10DNA重组技术课件 Take a donor egg, suck out the nucleus, and hence the DNA, and fuse it with, say, a skin cell from the human being copied. Then, with the help of an electrical current, the reconstituted cell should begin growing into a genetic duplicate.基因工程10DNA重组

2、技术课件1)重组DNA技术的重大突破引发现代生物技术的兴起，并很快诞生了许多生命科学的高技术产业。2)重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术，包括了一系列分子生物学操作步骤。3)基因工程(gene engineering)就是有意识地将一个生物体中有价值的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产品。 重组DNA技术是基因工程的核心基因工程10DNA重组技术课件DNA重组技术示意图基因工程10DNA重组技术课件Onebasiccloningtechniquebeginswiththeinsertionofaforeigngeneintoabacte

3、rialplasmid.Fig. 20.1基因工程10DNA重组技术课件DNA重组技术质粒、DNA或RNA提取(Extraction)酶切（Enzymedigest)连接（ligation)转化（transformation)筛选（selection)蛋白表达（Proteinexpression)基因工程10DNA重组技术课件第一节质粒和质粒提取Chapter1PlasmidandPlasmidextract基因工程10DNA重组技术课件（一）关于质粒（1）质粒的概念质粒(Plasmid)是双链、闭环DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞染色体外的遗传因子 。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细

4、胞中。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶，离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使无它们也可存活。基因工程10DNA重组技术课件Chromosomal DNAPlasmid（已经连接外源（已经连接外源DNA)基因工程10DNA重组技术课件单拷贝质粒单拷贝质粒（plasmid）质粒质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组可作为重组 DNA操作的载体操作的载体染色体染色体质粒质粒基因工程10DNA重组技术课件（2）质粒的复制紧密控制型紧密控制型(Stringentcontrol)：只在细胞周期的特定阶段进行复制。染色体不复制时, 它也不能复制。

5、松驰控制型松驰控制型(Relaxedcontrol)：在细胞周期中随时可以复制, 有多拷贝。 蛋白质合成抑制剂-氯霉素使细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受抑制。紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制。基因工程10DNA重组技术课件（3）质粒的不相容性）质粒的不相容性(Incompatibility)同一复制系统的不同质粒不能共存于同同一复制系统的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中一宿主细胞中, ,两种质粒彼此竞争。细胞两种质粒彼此竞争。细胞生长几代后生长几代后, ,某个质粒丢失。某个质粒丢失。发酵出发菌株发酵出发菌株 单质粒单质粒基因工程10DNA重组技术课件（4）质粒载体）质粒载

6、体质粒载体质粒载体是由天然质粒经人工改造而成。是由天然质粒经人工改造而成。与天然质粒相比与天然质粒相比, , 质粒载体带有选择性质粒载体带有选择性标记基因标记基因( (如抗生素抗性基因如抗生素抗性基因) )和人工合和人工合成多克隆位点序列成多克隆位点序列, ,并去掉了许多非必需并去掉了许多非必需序列序列, ,使分子量减小使分子量减小, ,便于基因工程操作。便于基因工程操作。基因工程10DNA重组技术课件理想克隆载体的特性理想克隆载体的特性分子量小、多拷贝、松驰控制型具有多种常用的限制性内切酶的单切点能插入较大的外源DNA片段具有容易操作的检测表型。常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pB

7、R322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。基因工程10DNA重组技术课件pBR322old-stylegeneralpurposeplasmid4362 bp基因工程10DNA重组技术课件以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。基因工程10DNA重组技术课件pUC192.68kbp基因工程10DNA重组技术课件MultipleCloningSequence(Polylinker)GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACPart of MCS

8、 of pUC19 and other plasmidsEcoRIKpnIBamHISal IXbaISmaISacI基因工程10DNA重组技术课件基因工程10DNA重组技术课件（二）提取质粒DNA的方法3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。用溶菌酶破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜。经溶菌酶和SDS处理后,细菌染色体DNA会缠绕在细胞碎片上,而质粒比细菌染色体DNA小得多，所以3000-5000g离心后，质粒留在上清液中。基因工程10DNA重组技术课件用强热或酸、碱处理时，细菌线性染色用强热或酸、碱处理时，细菌线性染色体体DNA变性变性, 而

9、共价闭合环状而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简，简称称cccDNA)两条链不会分开。两条链不会分开。 当外界条件恢复正常时，线状染色体当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片片段难以复性段难以复性, ,而是与变性蛋白质和而是与变性蛋白质和细胞碎片缠绕在一起细胞碎片缠绕在一起, , 而质粒而质粒DNADNA双链又双链又恢复原状恢复原状, ,重新形成天然超螺旋分子重新形成天然超螺旋分子, ,并并溶解于液相中。溶解于液相中。基因工程10DNA重组技术课件共价闭环质粒以共价闭环质粒以超螺旋形式超螺旋形式存在。提取质粒时，除超存在。提取质粒时，除超螺旋螺旋D

10、NA外，还有其它形式质粒外，还有其它形式质粒DNA。如果质粒如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状形成松驰型的环状分子分子,称称开环开环DNA (Open circular DNA, 简称简称 ocDNA)；如果质粒如果质粒DNA的两条链在同一处断裂的两条链在同一处断裂,则形成则形成线状线状DNA (Linear DNA)。当质粒当质粒DNA电泳时电泳时,同一质粒同一质粒DNA其超螺旋形式的泳其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。动速度要比开环和线状分子的泳动速度

11、快。所以电所以电泳有泳有23条带条带。基因工程10DNA重组技术课件附：试剂配制1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.0-7.5（有时pH试纸比pH计更可靠），加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。基因工程10DNA重组技术课件2 2、 LBLB固体培养基固体培养基： 每升液体培养基中加每升液体培养基中加10-12g10-12g琼脂粉琼脂粉, ,高高压灭菌。压灭菌。问题：问题： 如果配制如果配制1 1升升LBLB固体培养基，固体培养

12、基， 然后分然后分装到装到1010个三角瓶，何时加琼脂粉？个三角瓶，何时加琼脂粉？基因工程10DNA重组技术课件3、 氨苄青霉素氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液母液：配成配成 50mg/ml水溶液水溶液, -20保存备用。保存备用。 注意分装注意分装 4、 溶菌酶溶液溶菌酶溶液： 用用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成溶液配制成10mg/ml,并分并分装成小份装成小份(如如1.5ml)保存于保存于-20。问题问题: 溶菌酶的作用是什么溶菌酶的作用是什么?基因工程10DNA重组技术课件5、RNA酶酶A母液母液 将将RNA酶酶A溶于溶于10mmol/L Tris

13、Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中中,配成配成10mg/ml的溶液的溶液,于于100加热加热15分钟分钟,使使DNA酶失活。冷却后用酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于管分装成小份保存于-20。基因工程10DNA重组技术课件6、TE缓冲液缓冲液：10 mmo/L TrisCl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后。高压灭菌后储存于储存于4冰箱中冰箱中 问题问题: (1).如何配制如何配制10 mmo/L TrisCl (pH8.0) ? (2). TE缓冲液的作用缓冲液的作用?何种溶液可以何种溶液可以代替它代替它?基

14、因工程10DNA重组技术课件7、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解水中溶解 NaAc3H2 O,用冰醋酸调用冰醋酸调pH至至5.2, 加水加水定容至定容至100ml, 分装后高压灭菌分装后高压灭菌,储存于储存于4冰箱。冰箱。 基因工程10DNA重组技术课件8、 溶液溶液：50 mmol/L 葡萄糖，葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液溶液可成批配制可成批配制,每瓶每瓶100ml,高压灭菌高压灭菌15分钟分钟,储存于储存于4冰箱。冰箱。9、溶液溶液：0.2 mol/L NaOH (临用前用临用前

15、用10mol/L NaOH母液稀释母液稀释)，1 SDS。现用现配现用现配10、溶液溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至，定容至100ml, 并高压灭菌。并高压灭菌。溶液终浓度为溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。基因工程10DNA重组技术课件11、酚：市售酚中含有醌等氧化物可引起、酚：市售酚中含有醌等氧化物可引起磷酸二酯键的断裂，及导致磷酸二酯键的断裂，及导致RNA和和DNA的交联的交联, 应在应在160用冷凝管进行重蒸。用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入重蒸酚加入0.1的的8-羟基喹啉羟基喹啉(作为抗氧作为抗氧

16、化剂化剂),并用等体积的并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液缓冲液反复抽提使之饱和并使其反复抽提使之饱和并使其pH值达到值达到7.6以以上上,因为酸性条件下因为酸性条件下DNA会分配于有机相。会分配于有机相。基因工程10DNA重组技术课件1212、氯仿、氯仿: : 按氯仿按氯仿: :异戊醇异戊醇24:124:1体积比体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开于液相与有机相的分开, ,异戊醇则可消除异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。抽提过程中出现的泡沫。 按体积按体积

17、/ /体积体积1:11:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚混合上述饱和酚与氯仿即得酚/ /氯氯仿仿(1:1)(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。操作时应戴手套。 基因工程10DNA重组技术课件（三）质粒提取步骤（三）质粒提取步骤 1、 细菌的培养和收集细菌的培养和收集 将含有质粒菌种接种在将含有质粒菌种接种在LB固体培养基固体培养基(含含50g/ml Amp)中中, 37培养培养12-24小时。小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液液体培养基体培养基(含含50g/ml Amp)中中,37振荡振荡培养至对数生长后期。培养至对数

18、生长后期。 基因工程10DNA重组技术课件2、 质粒质粒DNA少量快速提取少量快速提取（A）煮沸法）煮沸法 1、将、将1.5ml培养液倒入培养液倒入eppendorf管中管中,12000离心离心30秒。秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中溶液中, 涡旋混匀。涡旋混匀。 4、加入、加入10ml新配制的溶菌酶溶液新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振涡旋振荡荡 3秒钟。秒钟。5、将、将eppendorf管放入管放入沸水浴沸水浴中中,50秒后立即取出。秒后立即

19、取出。 6、12000g离心离心10分钟。分钟。7、用无菌牙签从、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。管中去除细菌碎片。 8、电泳检查。、电泳检查。 基因工程10DNA重组技术课件（B） 碱法碱法1、1.5ml菌液倒入1.5mleppendorf管中,12000g离心30秒。2、弃上清,倒置于卫生纸上,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液200l,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,千万不要振荡,冰浴5分钟。5、加入150L预冷的溶液,温和振荡10秒,冰浴5分钟,12000g离心5分钟。6、上清液移入e

20、ppendorf管中,加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀,12000g离心5分钟。基因工程10DNA重组技术课件7、水相移入eppendorf管中,加2倍体积无水乙醇,振荡混匀，-20放置20分钟，4下12000g离心10分钟。8、弃上清,加入1ml70乙醇,12000g离心5分钟。9、弃上清,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。10、将沉淀溶于20lTE(pH8.0，含20g/mlRNaseA)中，储于-20冰箱。注意注意1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙

21、醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。基因工程10DNA重组技术课件（C）CTABCTAB法法 菌液5000rpm离心3分钟，得细胞沉淀；加入STET缓冲液及裂解酶，震荡混匀，室温下放置10分钟；沸水浴45秒，12000rpm离心15分钟，去沉淀留上清；加入RNA酶，65水浴15分钟；加入CTAB，12000rpm离心5分钟；用1.2M的NaCl悬浮；用2倍无水乙醇沉淀DNA；12000rpm离心10分钟；75%乙醇洗涤一次；12000rpm离心5分钟；再用75%乙醇洗涤一次；干燥后加入TE，-20保存。基因工程10DNA重组技术课件CTABCTAB法的优缺点法的优缺点优点：避免使用

22、氯仿等腐蚀性试剂缺点：得率较低基因工程10DNA重组技术课件3、质粒DNA的大量提取（A）碱法）碱法 1、取对数生长后期菌液、取对数生长后期菌液250ml，5000g离离心心10分钟分钟,弃上清弃上清, 离心管倒置使上清流尽。离心管倒置使上清流尽。 2、细菌沉淀重悬浮于、细菌沉淀重悬浮于5ml溶液溶液I中。中。 3、加入、加入10ml新配制的溶液新配制的溶液II, 缓缓地颠倒缓缓地颠倒离心管数次离心管数次,以混匀内容物以混匀内容物,冰浴冰浴10分钟。分钟。 4、加、加10ml用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液III, 摇匀离心管摇匀离心管,冰置冰置15分钟分钟,此时形成白色絮状沉淀。此时形成白色絮状

23、沉淀。基因工程10DNA重组技术课件 5、5000g离心离心15分钟。分钟。 6、取上清、取上清,加入加入RNA酶酶A(10mg/ml), 37水水浴浴20分钟。分钟。 7、加入等体积的饱和酚、加入等体积的饱和酚/氯仿氯仿,振荡混匀振荡混匀, 12000g离心离心10分钟。分钟。 8、取上层水相、取上层水相, 加入等体积氯仿加入等体积氯仿,振荡混匀振荡混匀, 12000g离心离心10分钟。分钟。 9、取上层水相、取上层水相, 用用70%冷乙醇洗涤，冷乙醇洗涤，12000g离心离心5分钟。分钟。 10、倒置离心管，风干沉淀，溶于、倒置离心管，风干沉淀，溶于500ml TE或水中。或水中。基因工程

24、10DNA重组技术课件注意注意 1. 1. 提取过程中应尽量保持低温。提取过程中应尽量保持低温。 2. 2. 加入溶液加入溶液IIII和溶液和溶液IIIIII后操作应混和后操作应混和, ,切忌剧烈振荡。切忌剧烈振荡。 3. 3. 由于由于RNARNA酶酶A A中常有中常有DNADNA酶酶, ,利用利用RNARNA酶酶耐热的特性耐热的特性, , 应先对该酶液进行热处理应先对该酶液进行热处理(80 1(80 1小时小时),),使使DNADNA酶失活。酶失活。基因工程10DNA重组技术课件(B)(B)煮沸法煮沸法 将培养液倒入将培养液倒入eppendorfeppendorf管中管中, 12000g,

25、 12000g离心离心3030秒。弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使秒。弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。将菌体沉淀悬浮于液体流尽。将菌体沉淀悬浮于 STET STET溶液中，溶液中，涡旋混匀。加入新配制的溶菌酶溶液涡旋混匀。加入新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml10mg/ml），涡旋震荡），涡旋震荡5 5秒钟。将秒钟。将eppendorfeppendorf管放入沸水浴中，管放入沸水浴中，5050秒后立即取出。秒后立即取出。12000g12000g离离心心1010分钟。用灭菌牙签剔除分钟。用灭菌牙签剔除eppendorfeppendorf管中的管中的细菌碎片。取细菌碎片。取20u

26、l20ul进行电泳检查。进行电泳检查。 基因工程10DNA重组技术课件第二节 DNA酶切及凝胶电泳（1 1）酶切和酶切图谱）酶切和酶切图谱（2 2）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳（A A）电泳所用试剂）电泳所用试剂（B B）电泳步骤）电泳步骤基因工程10DNA重组技术课件（1）酶切和酶切图谱）酶切和酶切图谱DNA或RNA.测其浓度缓冲液（含Mg2+)10双蒸水酶（含甘油）37水浴保温2-3小时DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都影响限制性内切酶的活性。基因工程10DNA重组技术课件ManipulatingGenes- Cutting up the DNAG A A T T CSec

27、tion of DNA moleculeRestriction EndonucleaseC T T A A GC T T A AGGA A T T C基因工程10DNA重组技术课件ManipulatingGenes- Digesting the Plasmid DNACTTAAGGAATTCDigest with EcoR1GAATTCAA TTCG基因工程10DNA重组技术课件ManipulatingGenes- The Resulting Recombinant DNAGGCTTAAAATTCCGTTAAGAATTCDonor Gene InsertedDonor Gene Inserte

28、d基因工程10DNA重组技术课件n 限制性内切酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶基因工程10DNA重组技术课件酶切图谱DNA限制性内切酶酶切图谱限制性内切酶酶切图谱又称又称DNA的的物理图谱，它由一系列限制性内切酶酶物理图谱，它由一系列限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。切位点组成，以直线或环状图式表示。通过综合分析多种酶单切、双切所得到通过综合分析多种酶单切、双切所得到的限制性片段来确定各种酶的酶切位点的限制性片段来确定各种酶的酶切位点及相对位置。及相对位置。基因工程10DNA重组技术课件Restrictionf

29、ragmentanalysisindirectlydetectscertaindifferencesinDNAnucleotidesequences.AftertreatinglongDNAmoleculeswitharestrictionenzyme,thefragmentscanbeseparatedbysizeviagelelectrophoresis.Thisproducesaseriesofbandsthatarecharacteristicofthestartingmoleculeandthatrestrictionenzyme.Restriction fragment analy

30、sis detects DNA differences that affect restriction sites基因工程10DNA重组技术课件WecanuserestrictionfragmentanalysistocomparetwodifferentDNAmoleculesrepresenting,forexample,differentalleles.BecausethetwoallelesmustdifferslightlyinDNAsequence,theymaydifferinoneormorerestrictionsites.Iftheydodifferinrestrictio

31、nsites,eachwillproducedifferent-sizedfragmentswhendigestedbythesamerestrictionenzyme.Ingelelectrophoresis,therestrictionfragmentsfromthetwoalleleswillproducedifferentbandpatterns,allowingustodistinguishthetwoalleles.Copyright2002PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings基因工程10DNA重组技术课件Restri

32、ctionfragmentanalysisissensitiveenoughtodistinguishbetweentwoallelesofagenethatdifferbyonlybasepairinarestrictionsite.Fig. 20.9基因工程10DNA重组技术课件已知序列酶切图谱制作根据多个酶切片段的长度，推导酶切位点DNAstar等软件基因工程10DNA重组技术课件基因工程10DNA重组技术课件基因工程10DNA重组技术课件（2）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离DNA长度从长度从200bp至近至近50kb片段。实验室多用琼脂糖水平平板片段。实验室

33、多用琼脂糖水平平板凝胶电泳进行凝胶电泳进行DNA电泳。电泳。聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)可分离较小片可分离较小片段，多采用垂直装置进行蛋白质或段，多采用垂直装置进行蛋白质或DNA电泳。电泳。基因工程10DNA重组技术课件迁移速率由下列因素决定DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA分子的构象电源电压嵌入染料的存在离子强度影响基因工程10DNA重组技术课件（A）琼脂糖电泳所用试剂）琼脂糖电泳所用试剂TBE缓冲液(5)：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定容至1000ml。TAE缓冲液上样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝(指示剂)，40%(w/v

34、)蔗糖水溶液（增加比重）。基因工程10DNA重组技术课件溴化乙锭(EB)插入DNA双链之间，在紫外照射下呈现亮色溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。使用时溴化乙锭(EB)直接加入琼脂糖凝胶或稀释后染色。基因工程10DNA重组技术课件电泳设备电泳设备琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统水平凝胶电泳系统水平凝胶电泳系统紫外分析仪紫外分析仪凝胶成像系统凝胶成像系统基因工程10DNA重组技术课件（B）电泳步骤制胶：0.71.0琼脂糖加双蒸水，微波炉中加热融化，冷却至60度，加EB,倒平板加样打开电源进行电泳拍照Photoshop处理图片pBS(-)

35、5kb2kb1.5kb1kb0.75kb基因工程10DNA重组技术课件琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动 酶切和电泳方法基因工程10DNA重组技术课件ForlinearDNAmolecules,separationdependsmainlyonsize(lengthoffragment)withlongerfragmentsmigratinglessalongthegel.基因工程10DNA重组技术课件思考题思考题 1.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因？2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？基因工程1

36、0DNA重组技术课件第三节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化受体细胞经处理后(如电击法,CaCl2等法),细胞膜通透性发生暂时性改变,成为允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Componentcells)。转化(Transformation)是将外源DNA引入受体细胞,使之获得新的遗传性状。基因工程10DNA重组技术课件一、感受态细胞的制备一、感受态细胞的制备( CaCl2 法法) 受体菌的培养受体菌的培养 挑取新活化的E. coliDH5单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,

37、37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右。基因工程10DNA重组技术课件1、菌液、菌液冰浴冰浴10分钟分钟,4下下3000g离心离心10分钟。分钟。2、 弃上清弃上清,用用预冷预冷的的0.05mol/L的的CaCl2 溶液溶液10ml轻轻悬浮细胞轻轻悬浮细胞,冰置冰置20分钟分钟,4下下3000g离离心心10分钟。分钟。 3、弃上清、弃上清,加入加入4ml预冷预冷含含15%甘油的甘油的0.05mol/L的的CaCl2 溶液溶液,轻悬细胞轻悬细胞,冰置冰置5分钟分钟,即成感受态细胞悬液。即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞分装成感受态细胞分装成50100l的小份的小份,-70可保存半年。可保

38、存半年。 感受态细胞的制备关键是什么？感受态细胞的制备关键是什么？基因工程10DNA重组技术课件二、转化(Transformation)将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状基因工程10DNA重组技术课件TransfectionMethods转染转染基因工程10DNA重组技术课件电脉冲穿孔法不需要预先诱导感受态细胞,操作简单转化效率高109转化子/微克闭环DNA而氯化钙为106108细胞死亡率增高需要成套的设备基因工程10DNA重组技术课件转化(Transformation)步骤（热击法）1、从-70冰箱中取100l感受态细胞悬液,冰上解冻。2、加入质粒DNA溶液(含量不超过50n

39、g,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰置30分钟。3、42水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却5分钟。基因工程10DNA重组技术课件4、向管中加入、向管中加入1ml LB液体培养基液体培养基(不含不含Amp),混匀后混匀后37培养培养1小时小时,使细菌恢复使细菌恢复正常生长状态正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素并表达质粒编码的抗生素抗性基因抗性基因(Ampr )。5、将上述菌液、将上述菌液4000g离心，弃上清，留离心，弃上清，留200l 涂布于涂布于Amp筛选筛选LB平板上平板上,正面向正面向上放置半小时上放置半小时,待菌液被培养基吸收后倒待菌液被培养基吸收后倒置培养皿置培养皿,37培养

40、过夜。培养过夜。 基因工程10DNA重组技术课件Thanks for your patience!基因工程10DNA重组技术课件第四节重组质粒的连接、转化及筛选北京化工大学生命科学与技术学院北京化工大学生命科学与技术学院 田平芳田平芳基因工程10DNA重组技术课件一、连接是一、连接是DNA重组的关键重组的关键基因工程10DNA重组技术课件（一）、（一）、 连接反应连接反应1、将、将已经酶切线性化的载体已经酶切线性化的载体DNA与等摩尔与等摩尔(可稍可稍多多)的外源的外源DNA片段（片段（相同酶消化相同酶消化）混匀，加）混匀，加适量双蒸水。适量双蒸水。 2、65保温保温15分钟。分钟。3 、室温

41、、室温3分钟。分钟。4、加入、加入T4 DNA ligase buffer, T4 DNA ligase , 混混匀匀,16保温过夜。保温过夜。 基因工程10DNA重组技术课件载体自连怎么办？-去磷酸化去磷酸化AlkalinePhosphataseAction基因工程10DNA重组技术课件OAOCH2OPO-OHOOGOCH2OPOHOOCOCH2OPOHOOTO-CH2OPOHO35OOOOHOPH2CTOOOOHOPH2CCOOOOHOPH2CGOO-OOOHOPH2CA53基因工程10DNA重组技术课件AlkalinePhosphataseActionTwo nicks remainWi

42、ll be repaired inbacterial cell follow-ing transformation基因工程10DNA重组技术课件（二）（二） 载体和目的基因连接方式按照切口形状划分：按照切口形状划分：1)平末端连接平末端连接2)粘末端连接粘末端连接按照限制酶数目划分：按照限制酶数目划分：1)单切点单切点2)双酶切双酶切基因工程10DNA重组技术课件限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式平末端连接难于粘末端连接平末端连接难于粘末端连接基因工程10DNA重组技术课件单酶切载体和目的基因多用于筛选文库筛选文库的流程造成双向插入，故不适合基因表达基因工程10DNA重组技术课件定向

43、克隆（DirectionalCloning）H BH BHBH: Hind III B: BamH I基因工程10DNA重组技术课件定向克隆（DirectionalCloning）DigestplasmidandtargetDNAwithtwodifferentrestrictionenzymesHindIIIandBamHIEndsarenotcompatible（末端不匹配）Plasmidwontre-circularizeunlesstargetDNAhasinserted(质粒不会自连）双酶切应当注意的问题？基因工程10DNA重组技术课件二、转化基因工程10DNA重组技术课件基因工程1

44、0DNA重组技术课件三、筛选本课介绍载体质粒pBS,转化受体菌为E. coliDH5菌株。由于pBS上带有Amp抗性基因和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。基因工程10DNA重组技术课件蓝白筛选的原理：-互补lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。由-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白

45、失活,产生的氨基酸片段失去-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。基因工程10DNA重组技术课件互补载体载体 Plac 受受IPTG诱导诱导 半乳糖苷酶氨基端片段半乳糖苷酶氨基端片段 宿主细胞宿主细胞 互补互补 缺陷型缺陷型 半乳糖苷酶半乳糖苷酶 geo+ X-gal 蓝色菌落蓝色菌落 插入片段插入片段 使载体不能表达使载体不能表达 半乳糖苷酶氨基端片段半乳糖苷酶氨基端片段 白色菌落白色菌落基因工程10DNA重组技术课件 质质粒粒的的多多克克隆隆位位点点整整合合在在lacZlacZ基基因因中中，该该位位点点如如果果没没有有插插入入外外源源目目的的基基因

46、因，lacZlacZ基基因因便便可可表表达达出出半半乳乳糖糖苷苷酶酶，如如果果平平板板培培养养基基中中含含有有IPTGIPTG和和X-galX-gal，X-galX-gal便便会会被被半半乳乳糖糖苷苷酶酶水水解解成成兰兰色色，大肠杆菌形成蓝色克隆。大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了目的基因，破坏了lacZlacZ基因基因的结构，大肠杆菌形成白色的结构，大肠杆菌形成白色的克隆的克隆 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒质质粒粒还还携携带带了了氨氨卞卞青青霉霉素素抗抗性性基因，可筛选重组质粒。基因，可筛选重组质粒。基因工程10DNA重组技术课件Blu

47、e-WhiteScreeningX-GalBlue productand colonyb-galactosidase (lacZ)(colorless)White colonyno cleavage of X-galnon-functional b-galX-Gal = 5-bromo-4-chloro3-indolyl-b-D-galactopyranoside基因工程10DNA重组技术课件重组质粒筛选实验步骤重组质粒筛选实验步骤1、取转化原液100l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上。 2、倒置平板37培养,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。 3、放于4数小时,使显色完全。 不带有

48、pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在Amp平板上成活。带有pBS载体的转化子由于具有-半乳糖苷酶活性, 在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。 基因工程10DNA重组技术课件基因工程10DNA重组技术课件附：含附：含AmpAmp、X-galX-gal和和IPTGIPTG的的LBLB平板制备平板制备用微波炉溶化100mlLB固体培养基,待温度降至50时,分别加入50ul,100ul,20ul的Amp、X-gal和IPTG，旋转混匀，倒平板凝固后待用。从-70低温冰箱中取出感受态细胞DH5，室

49、温下稍稍解冻,向其中加入连接混合液，混匀后冰浴30分；42热击90秒或375分钟，取出,立即置冰上5分钟；加入不含氨苄（Amp）的LB培养基，混匀后37培养45分钟，使细菌恢复正常生长状态；取出后每分3000转离心5分钟，涂板后37培养过夜。基因工程10DNA重组技术课件思考题思考题 1. 在用质粒载体进行外源在用质粒载体进行外源DNA片段片段克隆时主要应考虑哪些因素？克隆时主要应考虑哪些因素？ 2. 利用利用互补现象筛选带有插入片互补现象筛选带有插入片段的重组克隆的原理是什么？段的重组克隆的原理是什么？ 基因工程10DNA重组技术课件粘性末端粘性末端质粒质粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端匹

50、配的粘性末端匹配的粘性末端基因工程10DNA重组技术课件酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接(连接连接)连接后的重组连接后的重组质粒质粒DNA分子分子基因工程10DNA重组技术课件重组质粒重组质粒目的基因目的基因大肠杆菌大肠杆菌转转(转化转化)染色体染色体真好玩!基因工程10DNA重组技术课件(筛选筛选)分解抗生分解抗生素的酶素的酶含抗生素的培养基含抗生素的培养基还活着还活着!玩完啦玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌基因工程10DNA重组技术课件大量扩增大量扩增提取大量提取大量质粒质粒酶酶切切鉴定鉴定基因工程10DNA重组技术课件Outline of DNA recombinat

51、ion techniques基因工程10DNA重组技术课件您已掌握您已掌握DNA重组的主要步骤重组的主要步骤1)获得获得目的基因和载体目的基因和载体2)用合适的用合适的酶切酶切割上述割上述两者，产生匹配的末两者，产生匹配的末端端3)连连接接酶将目的基因装酶将目的基因装与载体与载体4)转化转化细菌细菌5)筛选筛选具有抗药性克隆具有抗药性克隆基因工程10DNA重组技术课件第五节基因组DNA的提取和酶切基因组基因组DNA的制备的制备基因组基因组DNA的检测的检测北京化工大学生命科学与技术学院北京化工大学生命科学与技术学院 田平芳田平芳基因工程10DNA重组技术课件 细胞内总DNA的提取 细胞内总DN

52、A的提取分离程序基因工程10DNA重组技术课件问题：DNA操作中离心的转速如何确定？30005000？分离菌体10000？分离核酸基因工程10DNA重组技术课件（一）基因组（一）基因组DNA的提取的提取利用基因组利用基因组DNADNA较长的特性较长的特性, ,可以将其与细可以将其与细胞器或质粒等小分子胞器或质粒等小分子DNADNA分离。加入一定分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组大分子量的异丙醇或乙醇，基因组大分子DNADNA沉沉淀形成纤维状絮团飘浮其中淀形成纤维状絮团飘浮其中, , 可用玻棒可用玻棒将其取出，而小分子将其取出，而小分子DNADNA则只形成颗粒状则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底

53、部沉淀附于壁上及底部, , 从而达到提取的从而达到提取的目的。目的。基因工程10DNA重组技术课件细菌基因组DNA的制备培养细菌培养细菌, 5000rpm离心离心10分钟分钟, 去上清液。去上清液。加加9.5ml TE悬浮沉淀悬浮沉淀, 并加并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或或1mg干粉干粉)蛋白酶蛋白酶 K, 混匀混匀, 37保温保温1小时。小时。加加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。混匀。加加1.5ml CTAB/NaCl溶液溶液, 混匀混匀, 65保温保温20分。分。用等体积酚用等体积酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇(25:24:1)抽提抽提, 5000rp

54、m离离心心10分钟分钟, 上清液移至离心管。上清液移至离心管。用等体积氯仿用等体积氯仿:异戊醇异戊醇(24:1)抽提抽提, 取上清液移至干净取上清液移至干净管中。管中。加加1倍体积异丙醇倍体积异丙醇, 颠倒混合颠倒混合, 室温下静止室温下静止10分钟，沉分钟，沉淀淀DNA。用玻棒捞出用玻棒捞出DNA, 70%乙醇漂洗乙醇漂洗, 吸干吸干,溶解于溶解于1ml TE, -20保存。保存。基因工程10DNA重组技术课件（二）基因组DNA的检测有时有时DNA中含有酚类和多糖类物质中含有酚类和多糖类物质,会影响酶会影响酶切和切和PCR的效果。所以获得基因组的效果。所以获得基因组DNA后后,均均需检测需检

55、测DNA的产量和质量。的产量和质量。 1. DNA溶液稀释溶液稀释20-30倍后倍后,测定测定OD260 /OD280 比值比值, 明确明确DNA的含量和质量。的含量和质量。 2. 取取2-5l 在在0.7% agarose胶上电泳胶上电泳, 检测检测DNA的分子大小。的分子大小。 3. 取取2g DNA, 用用10单位单位(U)Hind酶切过夜酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳胶上电泳, 检测能否完全酶解检测能否完全酶解(做做RFLP, DNA必须完全酶解必须完全酶解)。基因工程10DNA重组技术课件如果如果DNA中所含杂质多中所含杂质多, 不能完全酶切不能完全酶切, 或小或小分子

56、分子DNA多多, 影响接续的分析和操作影响接续的分析和操作,可以用可以用下列方法处理：下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。的含量。 （2） 酚酚:氯仿抽提氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤柱过滤, 去除酚类、多糖去除酚类、多糖和小分子和小分子DNA。 （4）CsCl梯度离心梯度离心, 去除杂质去除杂质, 分离大片分离大片段段DNA(可用作文库构建可用作文库构建)。 基因工程10DNA重组技术课件 紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度基因工程10DNA重组技术课件基因组完全酶切基因工程10DNA重

57、组技术课件基因组酶切不彻底基因工程10DNA重组技术课件思考题思考题 1. 提取基因组提取基因组DNA的目的之一是构的目的之一是构建文库，为什么构建建文库，为什么构建DNA文库时文库时,一定要一定要用大分子用大分子DNA？ 2. 如何检测和保证如何检测和保证DNA的质量？的质量？ 基因工程10DNA重组技术课件第六节第六节 RNA提取和提取和cDNA合成合成北京化工大学生命科学与技术学院北京化工大学生命科学与技术学院 田平芳田平芳基因工程10DNA重组技术课件一、一、RNA提取提取细胞内总细胞内总RNA制备方法很多制备方法很多,如如异硫氰酸胍异硫氰酸胍、热苯酚法热苯酚法等。等。许多公司有许多公

58、司有现成的总现成的总RNA提取试剂盒提取试剂盒,可快可快速提取高质量的总速提取高质量的总RNA。基因工程10DNA重组技术课件异硫氰酸胍异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法1. 1. 取取100mg100mg细胞组织细胞组织. .2. 2. 加加入入500ul500ul变变性性裂裂解解液液（异异硫硫氰氰酸酸胍胍、柠柠檬檬酸酸钠钠、十十二二烷烷基基肌肌氨氨酸酸钠钠、-巯巯基乙醇基乙醇），冰浴匀浆，充分裂解细胞），冰浴匀浆，充分裂解细胞. .3. 3. 依依次次加加入入50ul 50ul 乙乙酸酸钠钠（pH4.0pH4.0）、500ul500ul水水饱饱和和酚酚、100ul100ul氯氯

59、仿仿：异异戊戊醇醇(49(49：1)1)，用力振荡，用力振荡1515秒，冰浴秒，冰浴1515分分. .4. 44. 4，12000r/min12000r/min，离心，离心20min.20min.5. 5. 上清加等体积异丙醇，上清加等体积异丙醇，-20-20过夜过夜. .6. 46. 4，12000r/min12000r/min，离心，离心20min.20min.7. 7. 沉淀溶于沉淀溶于300ul300ul变性裂解液中，加入等体积异丙醇，混匀，变性裂解液中，加入等体积异丙醇，混匀，-20-20放置放置2h2h以上。以上。8. 48. 4，12000r/min12000r/min，离心，离

60、心20min.20min.9. 9. 沉淀用沉淀用75%75%乙醇，乙醇，44，12000r/min12000r/min，离心，离心20min20min洗盐洗盐10. 410. 4干燥，溶于干燥，溶于20ul20ul三蒸水中。三蒸水中。基因工程10DNA重组技术课件动植物总动植物总RNA提取提取-Trizol法法 用用TrizolTrizol法提取的总法提取的总RNARNA无蛋白和无蛋白和DNADNA污染。污染。1 1、将组织在液氮中磨成粉末后，再以、将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-50-100mg100mg组织加入组织加入1ml Trizol1ml Trizol液研磨，注意样品液研磨，注

61、意样品总体积不能超过所用总体积不能超过所用TrizolTrizol体积的体积的10%10%。 2 2、研磨液室温放置、研磨液室温放置5 5分钟，然后以每分钟，然后以每1mlTrizol1mlTrizol液加入液加入0.2ml0.2ml的比例加入氯仿，盖紧的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管离心管，用手剧烈摇荡离心管1515秒。秒。 3 3、取上层水相于一新的离心管，按每、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizolmlTrizol液加液加0.5ml0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置室温放置1010分钟，分钟，12000g12000g离心离心1010分

62、钟。分钟。 基因工程10DNA重组技术课件 4 4、弃上清，按每、弃上清，按每ml Trizolml Trizol液加入至少液加入至少1ml1ml的比的比例加例加75%75%乙醇，混匀，乙醇，混匀，44下下7500g7500g离心离心5 5分钟。分钟。 5 5、小心弃去上清，室温或真空干燥、小心弃去上清，室温或真空干燥5-105-10分钟，分钟，不要干燥过分，否则会降低不要干燥过分，否则会降低RNARNA的溶解度。然后将的溶解度。然后将RNARNA溶于水中，必要时可溶于水中，必要时可55-6055-60水溶水溶 10 10分钟。分钟。RNARNA可进行可进行mRNAmRNA分离，或贮存于分离，

63、或贮存于70%70%乙醇并保存于乙醇并保存于- -7070注意事项注意事项：1 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。低温下操作。 2 2、加氯仿前的匀浆液可在、加氯仿前的匀浆液可在-70-70保存一个月以上，保存一个月以上，RNARNA沉淀在沉淀在70%70%乙醇中可在乙醇中可在44保存一周，保存一周，-20-20保保存一年。存一年。基因工程10DNA重组技术课件RNA制备注意事项制备注意事项:防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,是实验成败的关键全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用玻璃器皿需在烘箱180烘

64、烤6小时以上。凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC，PC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。基因工程10DNA重组技术课件纯mRNA制备：分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年。 基因工程1

65、0DNA重组技术课件 二、二、 cDNAcDNA合成合成 从真核生物组织或细胞中提取从真核生物组织或细胞中提取mRNA, mRNA, 通过通过酶促反应逆转录合成酶促反应逆转录合成cDNAcDNA的第一链和第二链的第一链和第二链, ,将双链将双链cDNAcDNA和载体连接和载体连接, ,然后转化扩增然后转化扩增, , 即可即可获得获得cDNAcDNA文库文库, ,构建的构建的cDNAcDNA文库可用于真核生文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析物基因的结构、表达和调控的分析; ;比较比较cDNAcDNA和相应基因组和相应基因组DNADNA序列差异可确定内含子存在序列差异可确定内含子存在和

66、了解转录后加工等一系列问题和了解转录后加工等一系列问题基因工程10DNA重组技术课件纯纯mRNA制备制备 分离的总分离的总RNA可利用可利用mRNA 3末端含有多聚末端含有多聚(A)+ 的特点的特点,当当RNA流经流经oligo (dT)纤维素柱时纤维素柱时,在在高盐缓冲液作用下高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上纤维素柱上, 然后逐渐降低盐浓度洗脱然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶在低盐溶液或蒸馏水中液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次被洗下。经过两次oligo(dT)纤纤维素柱维素柱,可得到较纯的可得到较纯的mRNA。纯化的。纯化的mRNA在在

67、70%乙醇中乙醇中-70可保存一年以上。可保存一年以上。 基因工程10DNA重组技术课件Complementary DNA is DNA made in vitro using mRNA as a template and the enzyme reverse transcriptase.基因工程10DNA重组技术课件 基因文库构建基因文库构建将将总总DNADNA包包含含的的基基因因组组各各片片段段分分别别克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。基因工程10DNA重组技术课件n 反转录人工合成互补DNA 构建基因文库获取目的基因存

68、在问题费时费事 内含子序列 以以 mRNAmRNA为为 模模 板板 ， 以以 短短 的的 寡寡 核核 苷苷 酸酸（oligo(dT)oligo(dT)）分分子子作作引引物物，加加入入dATP, dATP, dTTP, dTTP, dGTPdGTP和和dCTP, dCTP, oligo(dT)oligo(dT)与与mRNAmRNA分分子子的的多多聚聚A A（polyApolyA）尾尾巴巴碱碱基基配配对对，在在逆逆转转录录酶酶作作用用下下，根根据据碱碱基基互互补补原原则则人人工工合合成成一一段段与与之之互互补补的的DNADNA片片段段，这这一一过过程程称称为为反反转转录录。接接着着，在在大大肠肠杆

69、杆菌菌DNADNA聚聚合合酶酶I I的的KlenowKlenow片片段段的的作作用用下下，再再以以第第一一条条DNADNA为为模模板板，人人工工合合成成另另一一条条互互补补的的DNADNA子子链链。这这种种经经过过mRNAmRNA反反转转录录人人工工合合成成的双链的双链DNADNA被称为互补被称为互补DNADNA（cDNAcDNA）。）。基因工程10DNA重组技术课件cDNA合成合成mRNAmRNA提取，先合成第一链再合成第二链提取，先合成第一链再合成第二链生物公司提供各种各样的生物公司提供各种各样的cDNAcDNA合成试剂盒。合成试剂盒。 cDNA文库文库 在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应

70、的在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的mRNAmRNAmRNAmRNA。因此，用。因此，用。因此，用。因此，用cDNAcDNAcDNAcDNA方法获取的方法获取的方法获取的方法获取的DNADNADNADNA片段往往片段往往片段往往片段往往是具有特定功能的目的基因。是具有特定功能的目的基因。是具有特定功能的目的基因。是具有特定功能的目的基因。基因工程10DNA重组技术课件基因组与基因组学基因组与基因组学基因组研究基因组研究 功能基因组学功能基因组学发现新基因发现新基因定位克隆定位克隆RNA转录分析转录分析基因工程10DNA重组技术课件