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1、第十七章第十七章 流式细胞仪分析技术及运用流式细胞仪分析技术及运用第一节第一节 概述概述 一、任务原理一、任务原理 二、散射光的测定二、散射光的测定 三、荧光丈量三、荧光丈量 四、细胞分选原理四、细胞分选原理第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析 一、参数一、参数 二、数据显示方式二、数据显示方式 三、设门分析技术三、设门分析技术第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标志染色二、免疫分析中常用的荧光染料与标志染色三、免疫胶乳颗粒的运用三、免疫胶乳颗粒的运用四、流式细胞免疫学技术的质量控
2、制四、流式细胞免疫学技术的质量控制第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中的运用流式细胞术在免疫学检查中的运用 一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、五、AIDSAIDS病检测中的运用病检测中的运用 六、本身免疫性疾病相关六、本身免疫性疾病相关HLAHLA抗原分析抗原分析 七、移植免疫中的运用七、移植免疫中的运用思索题思索题小结小结流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM)(flow
3、cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、准确的对单个细胞理化特性进是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、准确的对单个细胞理化特性进展多参数定量分析和分选的新技术。展多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞术最大的特点是能在坚持细胞及流式细胞术最大的特点是能在坚持细胞及细胞器或微粒的构造及功能不被破坏的形状下，细胞器或微粒的构造及功能不被破坏的形状下，经过荧光探针的协助，从分子程度上获取多种经过荧光探针的协助，从分子程度上获取多种信号对细胞进展定量分析或纯化分选。信号对细胞进展定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，丈量快速、大量、准确、灵敏、定量胞不被破坏，丈量快速、大
4、量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞术的特点 流式细胞仪是丈量染色细胞标志物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选根底上开展起来的对细胞的物理或化学性质如大小、内部构造、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进展快速丈量并可分类搜集的高技术。第一节第一节 概述概述细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞外表细胞外表/ /胞浆胞浆/ /核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA, RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,PH值值,膜电位膜电位 酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性采用
5、激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标志技术，保证检利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标志技术，保证检测的灵敏度和特异性；测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进展数据处置分析，保证了检测速度与统计分析准确信号进展数据处置分析，保证了检测速度与统计分析准确性。性。 一、任务原理一、任务原理 1 1 液流系统液流系统 2 2 光学系统光学系统 3 3 数据处置系统数据处置系统1.流式细胞仪的根本构造：流式细
6、胞仪的根本构造：由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标志的荧光染料标志的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进从样品管进入流动室构成样本流入流动室构成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，坚持样本流中细胞处于喷嘴中心包裹样本流的周围，坚持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其接近孔壁而阻塞喷孔。位置，防止其接近孔壁而阻塞喷孔。1液流系统液流系统喷嘴喷嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused
7、 laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系统表示图液流系统表示图FCMFCM的液流系统如的液流系统如何构成单个细胞流何构成单个细胞流样本管样本管鞘液管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/ /短波长，经过短短波长，经过短/ /长长波长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：构成平行光，除去室内光透镜组：构成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS, SSFS, SS散射光，散射光， FL1, FL2, FL3, FL4FL
8、1, FL2, FL3, FL4荧光荧光2光学系统光学系统FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统表示图光学系统表示图主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成3数据处置系统数据处置系统根本任务原理根本任务原理单细胞液柱已标志的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统搜集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交构成稳态程度激光与之根本过程根本过程区别区别流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜光源光源激光激光自然光、灯
9、光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形状及染色形状及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机，计算机，5000人工，人工，200结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别流式细胞仪与显微镜的区别 细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光线立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、信号，它的强弱与细胞的大小、外形、胞
10、内颗粒折射等有关，主外形、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。要分为前向散射光和侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定前向散射光forward scatter, FS：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的外表属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光表示图前向散射光表示图侧向散射光向散射光side scatter, SSside scatter, SS：激光束照射：激光束照射细胞胞时，光以，光以9090角散射的角散射的讯号，用于号，用于检测细胞内部胞内部构造属性。构造属性。FALS Se
11、nsor90LS SensorLaser侧向散射光表示图侧向散射光表示图 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号经过计算机处置，号经过计算机处置，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进展分析或分选。展分析或分选。 此为血细胞分类此为血细胞分类的根本原理，但不能的根本原理，但不能分析外表分子。分析外表分子。淋巴淋巴细胞胞单核核细胞胞中性粒中性粒细胞胞光散射丈量最有成效途：从非均一群体中光散射丈量最有成效途：从非均一群体中鉴别出某些出某些亚群群 荧光信号由被检细胞上标志的特异性荧光染料受激荧光信号由被检细胞上标志的特异性
12、荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，经过每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，经过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。多个不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光丈量三、荧光丈量荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXC
13、ITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)荧光补偿荧光补偿 经过流式细胞仪进展细胞分选经过流式细胞仪进展细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培育和研讨时进展的。需进一步培育和研讨时进展的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理细胞悬液构成液流柱细胞悬液构成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入搜集器偏转落入搜集器压电晶体压电晶体产活力械振动产活力械振动不充电不充电充电充电一分选根本原理一分选根本原理分选速度：单位时间内分选的细胞数量。分选速度：单位时间内分选的细胞数量
14、。与悬液中细胞的含量成正比。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占一切收获分选纯度：分选出的目的细胞占一切收获细胞的百分率。细胞的百分率。分选收获率：实践收获的分选细胞与设定分选收获率：实践收获的分选细胞与设定经过丈量点的分选细胞之间的比率。与纯经过丈量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实践得率。与分选速度成反比。的实践得率。与分选速度成反比。二分选的技术要求二分选的技术要求参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数
15、据显示方式数据显示方式 单参数直方图单参数直方图 、双、双参数散点图参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维、假三维等高图等高图 、三参数散点图、三参数散点图 设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部构造复杂程度：反映颗粒的内部构造复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、 参数参数单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图: :点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方
16、图设门分析设门分析:REGION:REGION和和GATEGATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式 由一维参数由一维参数( (散射光或荧光散射光或荧光) )与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。度的颗粒数量的多少。一单参数直方图一单参数直方图单参数直方图单参数直方图细胞胞相相对数数量量信道信道(channel (channel ) )双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被丈双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被丈量细胞的两个丈量参数，根据这两个参数量细胞的两个丈量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达
17、位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。二双参数直方图二双参数直方图1.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红色色荧光光强度度双参数直方图点图双参数直方图点图2. 二维等高图二维等高图由由类似地似地图上的等高上的等高线组成，其本成，其本质也是也是双参数直方双参数直方图。等高等高图上每一条延上每一条延续曲曲线上具有一上
18、具有一样的的细胞相胞相对或或绝对数，即数，即“等高。等高。曲曲线层次越高次越高( (越里面的越里面的线) ) 所代表的所代表的细胞胞数愈多。数愈多。等高等高线越密集那么表示越密集那么表示细胞数胞数变化率越大。化率越大。二维等高图二维等高图3. 假三维等高图假三维等高图三三参数直方图三三参数直方图 多参数分析：当细胞标志了多色荧光，被激多参数分析：当细胞标志了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需求进展组合分析。号可根据需求进展组合分析。四流式细胞仪的多参数分析四流式细胞仪的多参数分析 Gate Gate设置：指在某一张选定参数的直设置：
19、指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本一切其他参数组合的直方图只该样本一切其他参数组合的直方图只表达这群细胞的分布情况。表达这群细胞的分布情况。根据门的外形又分为了线性门、矩形门、圆根据门的外形又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任不测形门和十字门。形门、多边形门、任不测形门和十字门。 三、设门分析技术三、设门分析技术A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性粒细胞中性粒细胞A A、B B、C C均均为恣意门为恣意门线性门线性门Region设置设置: 区
20、阈区阈region, R与门与门(gate, G ) 是是两个相关的概念，区阈可与门对应，两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。但是也可以包含于门。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字门分析时，起如十字门分析时，起就可以由四个区域构就可以由四个区域构成，即成，即G=D1+D2+D3+D4G=D1+D2+D3+D4。 样本制备样本制备标志染色标志染色液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 第四节第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分
21、别单个核细胞分别单个核细胞培育细胞的样品制备培育细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞使贴壁细胞零落零落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备新颖实体组织单细胞悬液的制备新颖实体组织单细胞悬液的制备机械法机械法酶处置法酶处置法化学试剂处置法化学试剂处置法外表活性剂处置法外表活性剂处置法单细胞悬液的保管单细胞悬液的保管深低温保管法一年深低温保管法一年乙醇或甲醇保管法乙醇或甲醇保管法2 2周周甲醛或多聚甲醛保管法甲醛或多聚甲醛保管法2 2月月适用条件适用条件: :有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数对
22、对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长有较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长发射光波长与激发光波长间有较大的波长差差易与标志单抗结合而不影响抗体的特异性易与标志单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光染料与标志染色二、常用的荧光染料与标志染色FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传送复合染料能量传送复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类一几种常见的荧光染料一几种常见的荧光染料称号称号染料染料激发激发波长波长荧光颜
23、荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITC488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas red568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PE488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PC488别藻青蛋白别藻青蛋白APC633红红670670能量传送复能量传送复合染料合染料PEcy5488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉
24、，本钱高减少交叉，本钱高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一同，在结合在一同，在488nm488nm激发光照射下，经过激发光照射下，经过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。测到该特定荧光信号。能量传送复合染料能量传送复合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5 5藻红蛋白藻红蛋白能量传送复合染料机制能量传送复合染料机制荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料
25、与细胞成分的四种结合方式构造亲和式构造亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标志抗体特异性结合荧光标志抗体特异性结合免疫荧光标志方法免疫荧光标志方法直标直标: :干扰少干扰少, ,但需购买多种单抗但需购买多种单抗间标间标: :步骤多步骤多, ,干扰多干扰多, ,不需标志多种抗不需标志多种抗体体组合标志组合标志二免疫荧光标志二免疫荧光标志免疫胶乳免疫胶乳颗粒的运用即液相芯片技粒的运用即液相芯片技术是把微小是把微小的乳胶微球分的乳胶微球分别染成上百种不同的染成上百种不同的荧光色，把光色，把针对不同不同检测物的乳胶微球混合后再参与待物的乳胶微球混合后再参与待标本，在本，在悬液中与微粒液中与微
26、粒进展特异性地展特异性地结合，合，经激激光照射后不同待光照射后不同待测特特产生不同生不同颜色，并可色，并可进展展定量分析。因定量分析。因检测速度极快，所以又有速度极快，所以又有“液相液相芯片之称芯片之称 。三、免疫胶乳颗粒技术的运用三、免疫胶乳颗粒技术的运用微小的乳胶微球分别染成上百微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色固相芯片是种不同的荧光色固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯基因的特异性编码；而液相芯片那么是用颜色来编码片那么是用颜色来编码经过对标志不同荧光素分子的检测，实经过对标志不同荧光素分子的检测，实现现FCMFCM对可溶性物质的
27、定量分析对可溶性物质的定量分析适当的制适当的制备方式方式处置置红细胞胞实体体组织来源来源标本用机械法本用机械法温度温度25372537，pH7.07.2pH7.07.2四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制一单细胞悬液制备的质控一单细胞悬液制备的质控温度温度pHpH染料浓度染料浓度固定剂固定剂二免疫荧光染色的质控二免疫荧光染色的质控光路与流路校正光路与流路校正: : 确保激光光路与样品确保激光光路与样品流处于正交形状，减少变异流处于正交形状，减少变异CVCV。PMTPMT光电倍增管校准光电倍增管校准: : 保证样品检测保证样品检测时仪器处于最正确灵敏度任务形状。时仪器
28、处于最正确灵敏度任务形状。绝对计数校准绝对计数校准: : 保证计数的准确性。保证计数的准确性。Flow-checkFlow-checkFlow-checkFlow-checkFlow-setFlow-setFlow-setFlow-setFlow-countFlow-countFlow-countFlow-count三仪器操作的质控三仪器操作的质控同型对照：即免疫荧光标志中的阴性对照，同型对照：即免疫荧光标志中的阴性对照，选用一样源性的未标志单抗作为对照调整和选用一样源性的未标志单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一同标志和检测，全程质量控
29、制：与待测标本一同标志和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。结果达靶值，提示本次实验结果可靠。四免疫检测的质控四免疫检测的质控 流式细胞术目前已广泛地被运用于免疫学流式细胞术目前已广泛地被运用于免疫学根底研讨和逐渐进入临床运用各方面，用流式根底研讨和逐渐进入临床运用各方面，用流式细胞仪对细胞外表的抗原成分进展标志分析，细胞仪对细胞外表的抗原成分进展标志分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研讨添可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研讨添加了有效的手段和协助。加了有效的手段和协助。 第四节第四节 在免疫学检验中的运用在免疫学检验中的运用T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD
30、3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B B淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):B1(CD19+CD5+):产生产生IgMIgM型本身抗体型本身抗体, , 参与免疫调参与免疫调理、与本身免疫病的发生有关理、与本身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激, , 产生高亲和性特产生高亲和性特异性抗体异性抗体NKNK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞
31、及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析细胞介导细胞毒性实验细胞介导细胞毒性实验( (死细胞与活细胞比例死细胞与活细胞比例) )细胞内细胞因子测定细胞内细胞因子测定二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统及白血病免疫分型三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进展多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进展多色免疫分型用于选择化疗方案、判别预后及检出微小用于选择化疗方案、判别预后及检出微小残留病变残留病变CD4+Th细胞、细胞、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)MDR(+)表示对化疗药物耐药表示对化疗药物耐药四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、五、AIDS病检测中的运用
32、病检测中的运用HLA-B27可出如今可出如今58%97%的强直的强直性脊椎炎性脊椎炎(As) 患者患者六、本身免疫病相关六、本身免疫病相关HLA抗原分析抗原分析 FCM FCM作为一个强大的技术平台，已运用于作为一个强大的技术平台，已运用于多个领域，其在移植免疫分析中的运用多个领域，其在移植免疫分析中的运用也越来越广泛。目前移植免疫中的也越来越广泛。目前移植免疫中的FCMFCM运运用主要包括流式细胞术的交叉配型用主要包括流式细胞术的交叉配型Flow cytometry cross-matching, FCXMFlow cytometry cross-matching, FCXM和群体反响性抗体
33、和群体反响性抗体Panel reactive Panel reactive antibody, PRAantibody, PRA检测。检测。七、移植免疫中的运用七、移植免疫中的运用思索题思索题1.流式流式细胞胞仪的分析的分析检测原理是什么？原理是什么？2.流式流式细胞胞仪分析中前向散射光、分析中前向散射光、侧向散射光和向散射光和荧光的光的检测意意义。3.何何谓荧光光补偿？何？何谓“液相芯片技液相芯片技术？4.细胞分胞分选的根本原理。的根本原理。5.FCM分析中有哪些数据分析中有哪些数据显示方式，如何解示方式，如何解读结果及其果及其设门分析的意分析的意义？6.如何如何进展展FCM分析分析检测样品
34、的制品的制备？7.流式流式细胞分析前如何胞分析前如何验证仪器任器任务形状，采用何种校正物形状，采用何种校正物？8.流式流式细胞免疫分析的胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？量控制包括哪些方面？9.流式流式细胞胞术有哪些有哪些临床运用价床运用价值？10.流式流式细胞胞仪分析中常分析中常见的的荧光素有那些？他光素有那些？他们的特性如何的特性如何？小小 结结流式细胞术流式细胞术FCM是在坚持细胞及细胞器或微粒的构造是在坚持细胞及细胞器或微粒的构造及功能不被破坏的形状下，从分子程度上获取多种信号实现及功能不被破坏的形状下，从分子程度上获取多种信号实现对单个细胞进展定量分析或纯化分选。对单个细胞进展定量分
35、析或纯化分选。FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部构造复杂程度、外表的光滑程度；荧光反映颗粒被颗粒内部构造复杂程度、外表的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标志的抗原分子不同，即染上荧光部分数量的多少，根据其标志的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。反映了不同抗原分子的表达情况。同型对照为免疫荧光标志中的阴性对照，可使荧光标志单同型对照为免疫荧光标志中的阴性对照，可使荧光标志单抗的信号坚持其特异性。抗的信号坚持其特异性。对各项任务环节和仪器性能进展严厉的质量控制和规范化对各项任务环节和仪器性能进展严厉的质量控制和规范化操作，是保证操作，是保证FCM分析中各项检测数据和目的可靠性的关键。分析中各项检测数据和目的可靠性的关键。
