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1、实验实验(shyn)(shyn)三三考马斯亮蓝法测定蛋白质含量考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一一. .目的目的: : 掌握考马斯亮蓝掌握考马斯亮蓝G G250250染色法测定蛋白质的染色法测定蛋白质的原理和操作；了解原理和操作；了解(lioji)(lioji)分光光度法测定蛋白质的分光光度法测定蛋白质的几种方法；进一步熟悉分光光度计的使用。几种方法；进一步熟悉分光光度计的使用。第一页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量二、原理二、原理分光光度法测定蛋白质的几种分光光度法测定蛋白质的几种(j zhn)(j zhn)方法方法1、双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合、双缩脲法：在碱
2、性条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物，物，540nm，1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快速，不受硫酸铵干扰。灵敏度低，需要样品速，不受硫酸铵干扰。灵敏度低，需要样品(yngpn)量大；量大；2、Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）：在碱性条件下，蛋白质首先与铜离子形成法）：在碱性条件下，蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物，该络合物以及紫红色络合物，该络合物以及Tyr，Trp残基还原残基还原Folin试剂，产生深蓝色。试剂，产生深蓝色。750nm，0.03-3g/L或或500nm，0.05-0.5g/L。灵敏度高
3、，需要样品量。灵敏度高，需要样品量少；但干扰因素多，操作试剂配制麻烦，不同蛋白质之间差异大。少；但干扰因素多，操作试剂配制麻烦，不同蛋白质之间差异大。3、考马斯亮蓝染色法：在酸性环境下，棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质考马斯亮蓝染色法：在酸性环境下，棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质通过疏水力相结合，蓝色化合物，通过疏水力相结合，蓝色化合物，595nm，颜色深浅与蛋白质含量，颜色深浅与蛋白质含量成正比。成正比。 0.01-1g/L，灵敏度高，需要样品量少，不同蛋白质之间，灵敏度高，需要样品量少，不同蛋白质之间差异大。差异大。4、紫外分光光度法：、紫外分光光度法：280nm，不同蛋白质之间差异大，不同蛋白质之
4、间差异大第二页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量三、仪器三、仪器(yq)721分光光度计（使用分光光度计（使用(shyng)前预热前预热20min）；）；移液管：移液管：第三页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量四、实验(shyn)试剂标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质0.1mg/mL的标准蛋白溶液；的标准蛋白溶液；染色染色(rns)液（考马斯亮蓝液（考马斯亮蓝G250溶液）：称取溶液）：称取0.1mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250，溶于溶于50 mL 90乙乙醇中，加入醇中，加入85的磷酸的磷酸100 mL ，蒸馏水定容到蒸馏水定容到1000
5、 mL ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置放置1个月。个月。待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液第四页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量五五. 实验实验(shyn)操作操作1、标准曲线标准曲线(蛋白质含量为蛋白质含量为00.1mg/mL)的绘制的绘制: 利用利用1，2，3，4，5，6号试管数据绘制。号试管数据绘制。1号试管调零。号试管调零。2 、样品、样品(yngpn)提取液中蛋白质浓度的测定提取液中蛋白质浓度的测定 7，8好试管数据取平均值。好试管数据取平均值。试管号管号12345678蛋白蛋白质标准溶液（准溶液（ml）0 00.20.20.40.40.60.6
6、0.80.81.01.00 00 0蒸蒸馏水（水（ml）1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 00 00 0待待测蛋白蛋白质溶液（溶液（ml）0 00 00 00 00 00 01.01.01.01.0蛋白蛋白质含量含量( g)0 02020404060608080100100未知未知未知未知考考马斯亮斯亮蓝溶液（溶液（ml）55555555混合，放置混合，放置5min后，用后，用1cm光径比色杯在光径比色杯在595nm下比色，下比色，测得得A 595nm 。以蛋白以蛋白质浓度度为横坐横坐标，以吸光，以吸光值为纵坐坐标绘制制标准曲准曲线。调调0第五页，共八页。考马斯亮
7、蓝法测定蛋白质含量注意事项:如果测定要求(yoqi)很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为这段时间内颜色最稳定。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。第六页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量思考题思考题比较该法与其他几种(j zhn)常用蛋白质的定量测定方法。第七页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量内容(nirng)总结实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。1、双缩脲法：在碱性(jin xn)条件下，蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物，540nm，1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关，快速，不受硫酸铵干扰。2、Folin-酚试剂法（Lowry法）：在碱性(jin xn)条件下，蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物，该络合物以及Tyr，Trp残基还原Folin试剂，产生深蓝色第八页，共八页。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
