教学课件：《工业微生物实验技术》

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1、微生物实验技术微生物实验技术陈剑虹陈剑虹 主主编 微微 生生 物物 实实 验验 技技 术术前言前言第一章第一章 实验室建设及设备仪器实验室建设及设备仪器 第二章第二章 微生物的纯种分离与培养技术微生物的纯种分离与培养技术第三章第三章 微生物的鉴定微生物的鉴定 第四章第四章 微生物菌种的筛选、诱变与保存技术微生物菌种的筛选、诱变与保存技术第五章第五章 微生物在各行业生产中的应用微生物在各行业生产中的应用第六章第六章 微生物控制技术微生物控制技术第七章第七章 微生物的检验技术微生物的检验技术 前言前言 工业微生物实验技术是高等职业学校生物技术类专业的专业基础课工业微生物的配套教材, 其指导思想是贯

2、彻理论联系实际的原则，着力体现实用性和实践性，突出高职特色，重在培养学生的应用能力。本书在内容上以“实用”为目标介绍技术方法，力求创新，努力反映新知识、新技术和新的科研成果，尽量与生产应用实践保持同步。本书在内容上结合当前工业微生物发展的现状，介绍了微生物在食品、医药、能源、化工、环保、农业等方面的应用技术。在形式上尽力做到图文并茂，以便于学生更好地学习和掌握有关实验技能。 微生物实验技术微生物实验技术第一章第一章实验室建设及设备仪器实验室建设及设备仪器 实验室建设及设备仪器实验室建设及设备仪器实验室建设及设备仪器实验室建设及设备仪器 1.1 1.1 实验室建设实验室建设 1.2 1.2 实验

3、环境控制实验环境控制1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.4 1.4 常用器皿常用器皿1.5 1.5 型微生物厂主要仪器及设备型微生物厂主要仪器及设备 1.1 1.1 实验室建设实验室建设1.1.1 1.1.1 微生物实验室设计微生物实验室设计 微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设1.1.2 1.1.2 微生物实验室基本要求微生物实验室基本要求（一）准备室 准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存

4、放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。（二）洗涤室 洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设（三）灭菌室 灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。（四）无菌室 无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般

5、环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设1. 无菌室的设置 无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：（1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。内间面积22.55m2，外间面积122m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。（2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物

6、品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设2. 无菌室内设备和用具（1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。（2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，

7、外室的紫外线灯可安装在外室中央。（3）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。（4）内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设3. 无菌室的灭菌消毒（1）薰蒸：这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行薰蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。（2）喷雾：在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞场，并有杀菌作用。可用5%石炭酸喷雾。（3）紫外线照

8、射：在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外线灯照射3060min。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设4. 无菌室工作规程（1）无菌室灭菌。每次使用前开启紫外线灯照射30min以上，或在使用前30min，对内外室用5%石炭酸喷雾。（2）用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室换上已灭菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟。（3）将各种需用物品搬进内室清点、就位，用5%石炭酸在工作台面上方和操作员站位空间喷雾，返回外室，510min后再进内室工作。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设（4）接种操作前，用70%酒精棉球擦手；进行无菌操作时

9、，动作要轻缓，尽量减少空气波动和地面扬尘。（5）工作中应注意安全。如遇棉塞着火，用手紧握或用湿布包裹熄灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用浸润5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸润5%石炭酸的抹布擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。（6）工作结束，立即将台面收拾干净，将不应在无菌室存放的物品和废弃物全部拿出无菌室后，对无菌室用5%石炭酸喷雾，或开紫外线灯照射30min。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设（五）恒温培养室1. 培养室的设置（1）培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.24.414m2左

10、右，外室面积在3.21.86m2左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。（2）分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。（3）为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。（4）内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。 1.1 1.1 实验室建设实验室建设2. 培养室内设备及用具（1）内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。（2）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。3. 培养室的灭菌、消毒 同无菌室的灭菌、消毒措施。 小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。 1.1 1.1 实验室建设实验室

11、建设（六）普通实验室 进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。（七）实验室其他要求 水、电、气等的容量、布设、性能均应满足实验室工作的需要。返回 1.2 1.2 实验环境控制实验环境控制 1.2.1 1.2.1 检验的方法检验的方法（一）平板检验法 用培养微生物主要类群的常规培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基，分别倒成平板，每种两个，都放入无菌室内。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过

12、预定时间后再行盖好；另外一个不开盖子的作为对照，一起放入30环境培养，48小时后检验有无菌落生长。 1.2 1.2 实验环境控制实验环境控制 （二）斜面检验法 将常用的牛肉膏蛋白胨培养基斜面(与上相同)各取2管，放入无菌室。按无菌操作各将其中的一管打开棉塞，将棉塞放入灭菌的培养皿内。经过预定时间后，再将棉塞通过火焰塞好试管。连同对照一起培养，48小时后检验有无杂菌生长。 1.2 1.2 实验环境控制实验环境控制 1.2.2 1.2.2 检验时间检验时间（一）空气灭菌后的检验 无菌室用甲醛或其它药剂熏蒸后，在开始使用前30min或1小时打开培养皿盖子，至使用无菌室时盖好，其目的是为了检验无菌室内

13、空气灭菌的效果。（二）紫外线灭菌效果的检验 无菌室用紫外线灯照射后，可在不同高度和不同位置用琼脂平板检验空气中的杂菌，以判断紫外线的灭菌效果。必要时应调整照射时间或紫外线灯的高度。 1.2 1.2 实验环境控制实验环境控制 （三）操作过程中空气污染情况的检验 为了检验在使用无菌室的过程中，由于人员的进出、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成的空气污染的情况，可在准备工作结束后接种操作开始时打开盖子，经5min、30min或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内空气污染的程度。 1.2 1.2 实验环境控制实验环境控制 1.2.3 1.2.3 检验结果分析检验结果分析 检验用的平板或斜面

14、，在30培养48小时后，检验是否长有菌落、菌落的数量，并由菌落形态判断杂菌的种类。一般要求平板开盖5min者应不超过3个菌落；斜面开塞30min者应不长菌落为合格。从空气中杂菌的种类可以考虑采取有效措施，增进灭菌效果。如霉菌较多，可先用5%石炭酸灭菌后，再用甲醛熏蒸；如细菌较多时，可采用乳酸与甲醛交替熏蒸的办法。 返回 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.1 1.3.1 显微镜显微镜（一）显微镜的基本结构 普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成。机械部分包括镜座、镜臂、载物台、物镜转换器、镜筒和调节器等；光学部分包括目镜、物镜、聚光器、虹彩光圈及反光镜。显微镜结构

15、的各部分见图1-1。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-1 显微镜构造示意图 1.物镜转换器；2.物镜；3.游标卡尺；4.载物台；5.聚光器；6.虹彩光圈7.光源；8.镜座；9.点源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋； 12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1. 镜筒 镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式和后倾式两种。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。

16、2. 物镜转换器 转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔，用于安装不同规格的物镜。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 3. 载物台 又称镜台，是放置标本的地方，多数为方形和圆形的平台，中央有一通光孔；载物台上有移动器，作用是夹住和移动标本，转动螺旋可使标本前后和左右移动，其上的刻度标尺可指明标本所在位置。4. 镜臂 镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度）两种。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 5. 镜座 镜座连接镜臂，支撑整台显微镜，其上有反光镜。6. 调焦装置 调节物镜和被观察物体之间距离的

17、机件。有镜臂调节器和镜台调节器两种，前者通过升降镜臂来调焦距，后者通过升降载物台来调焦距。包括大、小螺旋调节器各一个，前者又称粗调节器，后者也叫微调节器，通过调节器调焦，可清晰地观察到标本。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 7. 物镜 是接近被观察物品（标本）的镜头，亦称接物镜。根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，低倍物镜有4、10、20；高倍物镜有40和45；油镜有90、95和100等。数字越大，放大倍数越高。8. 目镜 是接近观察者的眼睛的镜头，亦称接目镜。把经物镜放大的实像再放大一次，并映入观察者的眼中。通常有5、10、16等规

18、格。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 9. 聚光器 安装在载物台下，能将平行的光线聚焦于标本，增强照明度。聚光器可以升降。10. 反光镜 是普通光学显微镜的取光设备，使光线射向聚光镜，分平、凹两面。11. 内光源 是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强光灯泡发出光线，通过安装在镜座的集光镜射入聚光镜。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 （二） 显微镜的使用方法1. 显微镜的放置 从显微镜箱或柜内取出或放入显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落。显微镜应直立放置在桌上。离桌缘3cm，检查各部件

19、是否完好，镜身、镜头必须清洁。 2 .标本放置 下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台，将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 3 .低倍镜观察 将低倍镜对正下方，侧面注视，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，距离约0.5cm处，开放光圈，下降聚光器。如有内置光源灯可通过调节电压以获取适当的照明亮度；如使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数，选用凹面或平面反光镜并调节其角度。 再由目镜观察，同时转动粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜缓缓远离玻

20、片，标本在视野中显现后，再使用微调节器调节至图像清晰。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 4 .高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的目标并将其移至视野中心后，侧面注视，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至正下方。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后，用微调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦状态，这种现象称为物镜的同焦。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 5 .油镜观察 使用同焦显微镜时，在高倍镜或低倍镜下找到要观察

21、的区域后，移开镜头，在待观察的区域滴加12镜油，将油镜转至油中，调节光强，使视野的亮度合适，用微调节器调节物像清晰为止。 对于不等焦的显微镜，用粗调节器下降载物台或升高镜筒使物镜逐渐远离玻片，在标本观察区滴加镜油，然后将油镜转至镜筒下方，须在侧面注视下，用粗调节器调节上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片接近，将油镜前端浸入镜油中，并几乎与标本相接 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 6 .显微镜用毕后的处理 用粗调节器使物镜远离玻片，取下载玻片。 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许镜头清洗液擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的镜头清洗液。 切忌用手

22、或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。 用擦镜纸清洁其它物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 （三）显微镜的维护和保养 显微镜是贵重精密的光学仪器，正确的使用、维护与保养，不但观察物体清晰，而且延长显微镜的使用寿命。1 .显微镜应放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方。不使用时，用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内放置干燥剂。2 .显微镜要避免与酸、碱及易挥发具腐蚀性的化学物品放在一起，以免显微镜受损。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用

23、要领 3 .显微镜应防止震动和暴力。粗、微调节螺旋、聚光器螺旋和标本移动器等机械部分要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油。4 .透镜表面有污垢时，可用清洁的脱脂纱布或擦镜纸，沾上少许镜头清洗液（二甲苯或石油精）揩拭，切忌用酒精，否则透镜上的胶将被溶解，而使透镜脱落。5 .用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许镜头清洗液擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 6 .当显微镜以灯泡为光源，且需要更换时，可将仪器底部翻转，抓住灯座反时针转90取下灯座，拔下灯泡换上新的灯泡，然后把接插件卡脚对准底座上两槽口，顺时针转9

24、0即可。7.换保险丝时，握住保险丝座，反时针旋下保险丝座，换上好的保险丝，顺时针旋上保险丝座即可。8.仪器长期使用后应注意在各转动部分加些润滑脂，所用油脂宜应黏度适当，避免酸性。9.显微镜结构精密，零件不宜随意拆卸。遇故障可送厂家或有关仪器厂修理。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.2 1.3.2 恒温培养箱恒温培养箱 恒温培养箱可分为两大类：即直热式恒温培养箱和隔水式恒温培养箱。（一）直热式恒温培养箱 为直接加热空气方式的培养箱，采用“继电器控温电加热空气”技术，结构为：保温板材箱内装继电器控温电加热器。这种培养箱造价低，制造工艺简单，但恒温效果较差，温度波动

25、大。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 （二）隔水式恒温培养箱 为间接加热空气方式的培养箱，采用“继电器控温电加热水控制空气温度”技术，结构为：簿钢板外壳内衬玻璃棉，内置紫铜板水箱，水箱内装继电器控温电加热器，设双层门。这种培养箱制造工艺复杂，造价高，但由于先用电加热水层，再由水传热至箱内空气，因而温度上升和下降缓慢，加之可通过双层门的玻璃内门观察，对箱内温度影响小，故恒温效果好，调温为20600.5，很适于微生物培养之用。见图1-2。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-2 培养箱 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领

26、使用注意事项： 1. 箱内不应放入过热过冷的东西，以免箱内温度急剧变化，阻碍培养物的生长。2. 箱内应放入水容器一只，以维持培养箱内湿度或减少培养物中水分的大量蒸发。3. 培养箱底部因接近电源，温度较高，故培养物不宜放在底层。4. 箱内培养物不宜太挤，以免温空气不能流通，而使箱内温度不匀。5. 箱内要保持清洁，并经常用3%来苏儿液消毒，再用清洁抹布擦净。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.3 1.3.3 灭菌器灭菌器（一）干热灭菌箱 灭菌箱正面的侧边，装有温度指针，用于定温；温度指针下面有指示灯，用于指示是否达到定温；箱内有感温探头，用于探测温度。指针、指示灯、

27、探头、电加热器均连接于“温度调节器”，通过温度调节器使箱内保持一定温度。如温度未达定温，电加热器工作，箱内温度上升，如温度超过定温，“温度调节器”自动切断电加热器的电源，停止加热，箱内温度即可下降。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-3 干热灭菌箱 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 使用方法：1. 适宜用干热灭菌箱灭菌的物品是玻璃器皿和金属器皿，而塑料制品、橡皮制品、天然和化学纤维制品、培养基等，均不适用干热灭菌。2进箱，物品放在干热灭菌箱中的铁搁板上，关箱门。3. 定温，常用灭菌温度为160或170。4. 灭菌，接通电源，干热灭菌箱升温至

28、定温灭菌，160维持2h，170维持11.5h。5. 出箱，关断电源，待温度下降至50左右，开箱门取出被灭菌的物品。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 注意：1、灭菌时，温度不宜超过170，以免易燃物，如棉塞、包扎纸等被烧焦。2、高温时，切勿开箱门，以免冷空气骤然进入使灭菌的玻璃器皿炸裂。3、绝不允许先将温度上升到100以上再放器皿，以免玻璃器皿骤然在高温下炸裂。 干热灭菌箱用于烘干玻璃器皿时，定温120，持续30min即可。须打开顶部气孔，以利水蒸气散出。可启动箱内鼓风设备，加速干燥。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 （二）高压蒸汽灭菌器 高

29、压蒸汽灭菌器的灭菌效果比干热灭菌箱好，适用所有物品灭菌，通常用于培养基、生理盐水、废弃培养物、耐高热高压的药品、纱布等灭菌。高压蒸汽灭菌器有手提式、直立式和横卧式几种，它们的构造和灭菌原理是一样的，仅是容量不同而已。手提式高压蒸汽灭菌器容积最小，业务小的实验室大多使用它；横卧式高压蒸汽灭菌器容积大，只有大型实验室或生产上使用。一般实验室常使用直立式高压蒸汽灭菌器。直立式高压蒸汽灭菌器见图1-4。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-4 高压蒸汽灭菌器 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 使用方法：1. 加水 立式锅可直接加水至锅内底部隔板以下2

30、/3高处；有加水口和水位窗者，由加水口加水至止水线处。2. 装锅 把需灭菌的器物放入锅内（器物不要装得太满，以免影响灭菌效果），盖好锅盖，将螺旋柄拧紧（对角式均匀拧紧），打开排气阀。3. 点火 启动开关，电加热器工作。4. 排放冷空气 锅内水沸腾后，蒸汽逐渐驱赶锅内冷空气，当温度计指针指向100时，证明锅内已充满蒸汽，冷空气被驱尽，关闭排气阀。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 5. 升压、保压与灭菌 关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到0.1MPa，温度为121时，开始灭菌计时；控制热源，维持0.1Mpa、12130mi

31、n即完成灭菌。6. 降压与排气 完成灭菌后停止加热，任灭菌锅自然冷却降压。当压力降至0.025MPa以下后，可打开排气阀排除余汽。7. 出锅 待锅内压力降至大气压时揭开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.4 1.3.4 冰箱冰箱 用于储存培养基和培养物的设备，储存病毒必须使用低温冰箱，储存一般培养基和培养物用普通冰箱即可。 低温冰箱整个箱壁内侧围绕冷却管，可保持2070左右的低温。 使用冰箱时，必须注意以下事项：1.冰箱适用电压与所供电压一致。如所供电压为220V，而冰箱适用110V电压时，必须用变压器调压。2.供电线路和保险丝满

32、足冰箱的工作电流要求。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 3.使用时，应将温度调节至所需要的温度。一般应使水在冷却室中结冰，使储藏箱下部温度为510左右。 4.当冰箱冷却室结冰太厚时，会导致温度调节器的不灵敏，此时，必须停电融冰后，再投入使用。 5.冰箱门打开时间愈短愈好，打开次数越少越好。6. 不宜将温度过高的物品放入冰箱内，以免消耗电能过大、机件工作时间过长，缩短冰箱使用寿命。7. 冰箱内应保持整洁，如箱内有霉菌生长，应清洗并用福尔马林熏蒸消毒。8. 保存烈性病菌、病毒的冰箱，要专人保管，并要加锁。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.

33、5 1.3.5 水浴锅水浴锅 水浴箱也叫水温箱，用于融化培养基和各种保温操作。该设备是金属制成的长方形箱，箱内盛水，箱底装有电热丝，并有自动调节温度装置控制温度恒定。如图1-5所示。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-5 水浴箱 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.6 1.3.6 细菌过滤器细菌过滤器 目前常用的滤器有混合材质和全玻材质。如图1-6所示。（一）蔡氏滤器 蔡氏滤器为金属制成的杯状漏斗，在杯的底部夹一层石棉滤板，滤板下有一块金属筛板，防止抽气时石棉滤板下陷。按滤孔的大小，石棉板分为三种：1. K号，滤孔最大，可滤除一般颗粒

34、物。2. KK号，滤孔较小，为滤除大多数细菌。3. EKS号，滤孔更小，可滤除较大病毒。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-6 细菌过滤器 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 （二）玻璃滤器 该器组件全部为玻璃质，其中，滤板由玻璃细纱加热压成，分1、2、3、4、5、6共六级。号码愈大，孔径愈小，孔径0.152.0m不等，5和6级可阻止细菌通过。 玻璃滤器用后要立即处理。过滤病原微生物后的滤器，要先用不凝固蛋白质的消毒药剂浸泡3天，以免堵塞滤孔；消毒后的滤器，用蒸馏水倒抽；再在滤器内加入三分之二洗涤液，自然流出氧化残留物；再先后用自来水、蒸馏水

35、抽吸过滤至滤液呈中性为止。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 如果滤器的滤孔被凝固的蛋白质颗粒堵塞，可将滤器浸泡于37的1%胰蛋白酶溶液（pH7.47.6）中消化24h，再按上法抽洗清洁。 滤器为负压过滤，需要连接一抽滤瓶，将滤瓶嘴用橡皮管连接于抽气机上抽气过滤。过滤负压不宜低于（46.666.6）KPa（350500mmHg），可用水银真空计指示，也可观察滤瓶内滤出液情况判断。如滤液出现大量气泡，说明负压过高，宜关闭抽气机，停止抽气，待气泡消逝后再抽。抽滤瓶的嘴应塞入少量棉花，以防放气时空气中细菌冲入瓶内。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1

36、.3.7 1.3.7 超净工作台超净工作台 用于创造局部无菌环境的设备。超净工作台是一个由预过滤器、高效过滤器、空气幕风机有效排除空气中的悬浮灰尘、微生物，由紫外灯或喷雾灭菌，装有照明灯、操作台面板、配电装置，并有消音、减震设备的箱体，如图1-7所示。超净工作台是没有建设无菌室的微生物实验室的必备设备，也可用于有更严格无菌要求或其他小环境条件要求的微生物接种、分离和鉴定等操作。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-7 超净工作台 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 使用超净工作台应注意以下几点：1清除工作台内的灰尘、杂物。2在使用超净工作台进行

37、无菌操作前30min启动过滤、通风装置，检测操作区气流速度、洁净度，并灭菌。3穿紧口工作服，戴紧口帽。4. 严禁在超净工作台前做任何可能增加空气灰尘量的动作。5. 必须在超净工作台内使用的物品要放在下风侧。6. 在超净工作台内使用的物品必须是不易起纤尘的。 7. 在全部无菌操作结束后，才能停止工作台运转。8. 定期进行性能检测。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.8 1.3.8 电动抽气机电动抽气机 电动抽气机又叫真空泵，由电动机转轮、轮带和偏心轮等组成。通电后，电动机带动偏心轮，即可将与其相关的容器内的空气抽出。如图1-8所示。 电动抽气机主要供细菌过滤器、厌

38、氧培养、培养基过滤和真空干燥时抽气用。使用抽气机时，应注意以下事项：1. 抽气机的适用电压要与所供电压一致，否则，要经变压器变压后才能使用。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 2. 要保持机油箱内的油量，防止机器损坏。3. 必须使用硬质的连接管，保证气路畅通以确保器皿内抽真空效果。4被抽气的器皿，必须有良好的抗压性能，以防内部真空后被外部空气破碎。5如果在抽滤过程中滤液出现大量气泡，可以暂时停机，待气泡消失后，再开机继续抽气。6如果要作冷冻干燥，则需用精密度高、功率大的抽气机。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-8 电动抽气机 1.3 1.

39、3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.9 1.3.9 电动离心机电动离心机 离心机为进行病菌病毒检验鉴定中不可缺少的工具。离心机的种类很多，实验室常用小型倾斜电动离心机。小型倾斜电动离心机机顶正中有孔盖，以便放入和取出离心试管，内有离心管座四或六个，均匀地绕离心轴排列，底座上装有开关和调速器。如图1-9所示。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 图1-9 小型倾斜电动离心器A-离心机断面1.转速调节器 2.电动机 3.金属套管 4.护盖 5.玻管； B-离心器全形 6.盖 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 使用离心机时应注意：1.

40、应放在平稳的地方，并保持水平。2将装有标本的离心试管放入离心管座的金属套管内，两两成对，每个重量基本平衡。3放好试管后，盖上孔盖。4开启电源开关，先用最低转速，逐渐调节到最高转速。5. 达到离心时间后，逐步降低转速，待降到最低转速后，关闭电源开关。6待离心机自然停止转动，打开孔盖，取出离心试管。7. 离心试管须加棉塞时，离心前应将棉塞上端用橡皮圈扎紧在试管外或用大头针别住，以免离心时棉塞沉入管内。8. 应经常保持转轴润滑。 1.3 1.3 常用仪器及其使用要领常用仪器及其使用要领 1.3.10 1.3.10 天平天平(一)粗天平 粗天平又称工业天平或药物天平，是用于粗略称量的仪器。常用的有10

41、0g、200g、500g、1000g四种，感量为千分之一，供配制普通试剂和粗略称量之用。(二)电子天平 这类天平只有一个盘，构造比一般天平复杂，但使用起来却十分方便。 返回 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 1.4.1 1.4.1 常用的玻璃器皿常用的玻璃器皿 微生物实验室常用的玻璃器皿见表1-1所示。 表1-1 常用的玻璃器皿 名称规 格试 管18180mm，15150mm，10100mm，还有反应管(杜氏小管)，以厚管壁为宜培养皿常用的培养皿直径为900mm，高为15mm吸 管0.1mL，0.2mL，0.5mL，1.0mL，5.0mL，10.0mL的刻度吸管量 筒10.0mL，50.0mL

42、，100mL，500mL，1000mL漏 斗直径3.0cm，6.0cm，10.0cm烧 杯50 mL，100mL，250 mL，500 mL，800 mL，1000 mL容量瓶各种容量试剂瓶各种容量(白色和棕色)滴 瓶一般用125mL(白色和棕色)载玻片2.5cm7.5cm，厚0.010.13cm盖玻片1.8cm1.8cm，厚0.17cm干燥器不同直径的普通干燥器 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 1.4.2 1.4.2 常用的玻璃器皿的洗涤与消毒常用的玻璃器皿的洗涤与消毒 微生物学实验中常用的培养皿、试管和三角瓶等的洗涤、消毒质量，直接影响实验结果，因此，这项工作不容忽视。（一）新玻璃器皿的

43、洗涤法新购置的玻璃器皿含有游离碱，应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，再用水充分冲洗干净。 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 （二）含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤法 先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮下。如果琼脂培养基已经干燥，可将器皿放在水中蒸煮，使琼脂熔化后趁热倒出，用水洗涤，并用刷子沾肥皂擦洗内壁，然后用自来水洗去肥皂。是否已将油垢完全除去，可以这样检查：即将瓶子或试管的外壁擦干，如果水在内壁是均匀地分布一薄层，可以认为是将油垢除去了。如果经过这样洗涤的器皿，油垢还未洗净，就需用洗涤液来清洗。 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 （三）载玻片及盖玻片的洗涤法 新载玻片和盖玻片先在2%的盐酸溶液

44、中浸1h，以后用自来水冲洗23次，最后用蒸馏水换洗23次。也可用1%的洗衣粉洗涤，新载玻片用洗衣粉洗涤时，先将洗衣粉液煮沸，然后将要洗的新载玻片散入煮沸液中，持续煮沸1520min(注意煮沸液一定要浸没玻片，否则会使玻片钙化变质)，待冷后用自来水冲洗至中性。新盖玻片用洗衣粉洗涤时，将盖玻片散入1%的洗衣粉液中，煮沸lmin，待沸点泡平下后，再煮沸1min，。 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 1.4.3 1.4.3 常用的玻璃器皿的包装常用的玻璃器皿的包装 玻璃器皿使用前必须经过灭菌，而灭菌前应预先将玻璃器皿包装好。（一）棉塞的制作常见的做法有：将棉花铺成方形，对角方向不完全对折，垂直于对折线

45、方向卷起来，如图1-10所示；或将棉花铺成方形，于其中央衬以小块棉花，再将四边棉花包拢。制作好的棉塞最好用纱布包好，以利于使用和保存。另外，也可根据需要，购买市售的泡沫塑料塞。 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 图1-10 棉塞的制作过程 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 制作质量好的棉塞的形状、大小、松紧，应与试管口(或三角瓶口)完全适合。过紧会妨碍空气流通，不便塞拔，过松则达不到滤菌的目的。棉塞过大，塞不进试管口(或三角瓶口)，过小则容易掉进试管内。正确的棉塞，塞头较大，约占棉塞总长的1/3，留在管外，塞体约占棉塞总长的2/3，塞在管内，如图1-11所示。 棉塞应塞在试管内，用报纸或牛皮纸

46、包装后一道灭菌。 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 图1-11 试管帽和棉塞 1.试管帽；2.正确的棉塞；3.4.不正确的棉塞 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 （二）吸管的包扎 将非脱脂棉塞入管尾，长度约2cm，后端距尾口1.5cm，松紧要适当，以吹气时通气流畅而不滑动为度。将吸管尖端以30角放在宽45cm、长55cm的纸条(报纸或牛皮纸)的一端，折返纸头包住管尖后，以螺旋形式包裹吸管，将包裹卷紧的纸棒在管尾端打一个结，以防吸管脱出。如图1-12所示，包好后等待灭菌。 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 图1-12 单支刻度吸管的包扎 1.4 1.4 常用器皿常用器皿 （三）培养皿的包扎 培养

47、皿可按4套或8套为一叠，用纸包扎好，如图1-13所示，待灭菌。或直接将培养皿装入金属筒内进行干热杀菌。 图1-13 培养皿的包扎 返回 1.5 1.5 小型微生物厂主要仪器及设备小型微生物厂主要仪器及设备 小型微生物厂的主要仪器及设备见表1-2。表1-2 小型微生物厂的主要仪器及设备一览表名称数量规模制造材料备注无菌柜1长110120厘米，宽80厘米，高70厘米摇瓶机1往复式或旋转式，能放500mL三角瓶20个钢木须放在恒温室内显微镜1放大10001500倍须带血球计数板，载玻片和盖玻片分析天平11/1000恒温箱110013080cm可自制电冰箱1恒温干燥箱1鼓风机种子罐2立式圆筒形蝶底盖具

48、夹套及搅拌发酵罐3立式圆筒形蝶底盖具夹套及搅拌 1.5 1.5 小型微生物厂主要仪器及设备小型微生物厂主要仪器及设备 表1-2(续)小型微生物厂的主要仪器及设备一览表空压机2固定水冷式压力23kg/cm2，风量0.4m3/min两台轮换使用总空气过滤器2立式圆筒形3601200钢锅炉1蒸发量0.3吨时，压力4公斤厘米2消毒柜1柜式容积1米3钢每4小时消一柜，每柜400斤，每日两班其他温度表、酒精灯、小天平、试管、试管架(自制)、漏斗架、吸管(毫升)、三角瓶、培养皿、烧杯、量筒、玻璃棒、牛皮纸、夹子、小骨勺，橡皮管，紫外线、钟表，石棉网、洗瓶刷等。微生物实验技术微生物实验技术第二章第二章微生物的

49、纯种分离及培养技术微生物的纯种分离及培养技术 微生物的纯种分离及培养技术微生物的纯种分离及培养技术微生物的纯种分离及培养技术微生物的纯种分离及培养技术 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母土壤中细菌、放线菌、酵母 菌及霉菌的分离与纯化菌及霉菌的分离与纯化 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 实验实验2-3 2-3 从沼液中分离产甲烷细菌从沼液中分离产甲烷细菌 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。2

50、. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。

51、实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨303712土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号2857土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂283035面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖283023细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2牛肉膏蛋白胨303712实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌

52、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。4.5 mL无菌水试管(每人57支)。 4. 其他物品 无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（一）系列稀释平板法1. 取土样 选定取样点

53、，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取1015g，称重后经105烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡

54、，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，稀释过程见图2-1。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-1 稀释分离过程示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化3. 接种 分离不同的微生物类群采用不同的稀释度，参考表2-1进行选择。 从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中（每个

55、稀释度每种做2-3个培养皿，并注意做好浓度及培养基种类标记），同时做空白对照，倒入熔化后冷却至4550左右的相应培养基，见图2-2，轻轻地摇动并旋转平皿，使菌悬液与培养基混合均匀，水平静置待凝，倒置于相应温度的培养箱中培养，25天后，观察菌落情况及计数。实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-2 稀释分离无菌操作图 1.包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管；3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从

56、最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至4550培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化4. 培养 冷凝后，将平板倒置于在各自适宜的温度下培养，培养一定时间后观察。5. 计数 选菌落单个分散、菌落数适量且各平行皿数量接近的稀释度的平皿计数。通常细菌和放线菌选取菌落数在30300之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数，记录于表2-2。实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵

57、母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-2 样品中四大类微生物的菌落数 稀释度菌落数类别采样日期采样地点10-210-310-410-510-6平均每克样品所含微生物数细 菌放线菌酵母菌霉 菌实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（二）涂布法分离（酵母菌定量分离用） 依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至4550的马铃薯葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度菌悬液0.1mL，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰

58、旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破(图2-3)。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-3 涂布操作示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（三）平板划线法 取各平板一只做好标记，将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸一环10-2土壤稀释液，按图2-4和图2-5的方式在培养基表面轻轻划线，注意勿划破琼脂。划线完毕，将培养基倒置培养，25天后，挑取单个菌落，并移植于

59、斜面上培养。如果只有一种菌生长，即得纯培养菌种。如有杂菌，可取培养物少许，制成悬液，再做划线分离，有时要反复几次，才能得到纯种。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-4 划线分离图 图2-5 划线分离示意图 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化（四）平板菌落形态及个体形态观察 从不同平板上选择不同类型菌落观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。再用接种环挑取不同菌落，在显微镜下进行个体形态观察。将所分离的各类菌株的主要菌落特征

60、和细胞形态记录于表2-3。（五）分离纯化菌株转接斜面（斜面接种） 在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好的菌落各挑选一个用接种环接种斜面，见图2-6。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-3 各类菌株的主要菌落特征和细胞形态 菌株编号分离培养基菌落特征细胞形态细 菌12放线菌12酵母菌12霉 菌12实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化图2-6 斜面接种技术 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌

61、、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化 将细菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，霉菌接种于马丁氏培养基，酵母菌接种于马铃薯葡萄糖斜面上。 贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征于表2-4。置冰箱保藏。 实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉菌的分离与纯化表2-4 四大类微生物斜面培养条件及菌苔特征 微生物培养基名称培养温度培养时间菌苔特征纯化程度细菌放线菌酵母菌霉菌实验实验2-1 2-1 土壤中细菌、放线菌、酵母菌土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化及霉

62、菌的分离与纯化五、实验报告1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。2. 将所检测样品中四大类微生物的菌落数填入表2-2。 3. 将所检测样品中各类菌株的主要菌落特征和细胞形态填入表2-3。 4. 记录斜面培养条件及菌苔特征（包括纯化结果）于表2-4。 返回实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 一、实验目的1. 学习土壤中采样、富集培养、分离纯化硝化细菌。2. 学习硅胶平板制备，了解培养硝化细菌的培养基制备和培养方法。二、实验原理 硝化细菌是化能自养菌类群中主要类群之一。包括亚硝化细菌和硝化细菌(或称亚硝酸氧化细菌)两个亚群。

63、培养硝化菌的温度，因菌源而异，从中温环境下分离的菌株，最适生长温度为2628，从高温环境下分离的菌株，40下生长良好。实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 三、实验材料 1. 菌源土样 合成氨车间周围和堆放合成氨场地周围土样。 2. 培养基 硝化细菌增殖培养基，硝化细菌分离培养基（见附录），牛肉膏蛋白胨培养基，马丁培养基，马铃薯葡萄糖培养基。3. 试剂 格里斯氏试剂（亚硝酸盐试剂），二苯胺硫酸试剂（硝酸盐试剂），见附录。4. 其他物品 无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，无菌微口滴管，无菌玻璃涂棒，透析袋，比色板，培养箱等。 实验实验2-2 2-2 化能自养

64、微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 四、实验内容1. 采样 采集土样，选合成氨车间和堆放合成氨场地周围土样。2. 富集培养 称取土样1 g，接入到盛有20 mL硝化细菌增殖培养液的250 mL锥形瓶中，28振荡培养1014d，每隔几天在白磁板上分别加23滴格里斯氏试剂及二苯胺-硫酸试剂，然后用无菌滴管取出1滴增殖培养液的培养物加于上面两试剂中，搅和均匀。检查增殖培养液中NO2-的减少（溶液由红色、粉红色变为无色）和NO3-的形成（NO3-氧化二苯胺的特有反应，溶液由无色变为深蓝色）。实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 3. 分离纯化 取富集培

65、养液，通CO2气体30 min，然后静置30 min，再通过硅胶平板分离法进行分离纯化。 制取硅胶平板 取等体积的盐酸(HCl比重1.09)和硅酸钠(比重1.10)溶液，徐徐加入，缓慢混合，均匀搅拌，分装于100200mL透析袋中，蒸馏水中透析48 h，其间换蒸馏水68次，待透析袋内的硅酸钠溶液无色透明后，高压蒸汽灭菌或过滤除菌。吸取预先配制并已灭菌的硝化细菌分离培养基1mL、硅酸钠溶液10mL于无菌培养皿内，静置片刻，待凝固后即可使用。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 硅胶平板分离 采用涂布分离法。取0.10.2mL富集培养液滴于510个硝化细菌

66、分离培养基硅胶平板上，涂布分离。然后将硅胶平板放在盛有少量水的干燥器里(防止水分蒸发，避免硅胶平板干裂)，于28恒温下培养34周，当硅胶平板上出现硝化细菌极小的菌落后(多数菌落小于100m)，挑取1020个单菌落，分别接种到硝化细菌增殖培养液中，28恒温下培养34周，依前述方法检验NO2-及NO3-。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 4. 纯度检查 硝化细菌培养过程常会有异养型细菌伴生，所以必须用多种有机营养培养基检查培养物是否有异养菌污染。常用的有机营养培养基是：牛肉膏蛋白胨培养基检查异养型细菌，马丁氏琼脂培养基检查霉菌，马铃薯葡萄糖培养基检查酵

67、母菌。5. 镜检 对分离纯化的硝化细菌进行镜检及革兰氏染色。常见的硝化细菌特征见表2-5所示。 实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 表2-5 常见的硝化细菌 属细胞形态鞭毛革兰氏染色结果硝化杆菌属短杆状、梨形或球形单鞭毛，通常不运动G-硝化球菌属球形偏端鞭毛，运动G-硝化刺细菌属细长直感状、球形不运动G-实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 五、实验报告1. 记录硝化细菌的分离方法及培养条件于下表2-6。 2 .分离、纯化硝化细菌菌株的记录于表2-7。 表2-6硝化细菌分离方法及培养条件 样品来源分离方法稀释度培

68、养基名称培养温度培养条件实验实验2-2 2-2 化能自养微生物的分离与纯化化能自养微生物的分离与纯化 表2-7分离、纯化硝化细菌菌株的记录 菌株编号分离培养基菌落特征镜检结果返回实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 一、实验目的1.了解厌氧微生物的生长特性；2.观察厌氧微生物（产甲烷菌）的形态特征；3.掌握亨氏厌氧技术分离产甲烷细菌的方法。二、实验原理 本实验所使用的亨盖特滚管技术，就是把适当稀释度的产甲烷细菌富集培养物，在无氧条件下接入含灭菌琼脂培养基的厌氧试管中，然后将它在滚管机上或者冰盘中均匀滚动，使含菌培养基均匀地凝固在试管内壁上。实验实验2-3 2-3 厌氧菌

69、的分离与培养厌氧菌的分离与培养 三、实验材料1. 菌源样品 沼液。2. 培养基 产甲烷菌分离培养基（固体和液体）若干试管，培养基的配方见附录。3. 灭菌的厌氧试剂 硫化钠(1%)+碳酸氢钠(5%)混合试剂，20.5乙酸钠，25%甲酸钠，50%甲醇。4. 器材 高纯度的氮气，氢气和二氧化碳，氧装置一套，水浴锅，无菌毛细管，试管架，滚管机，冰块，lmL灭菌注射器若干，旋涡混合器l台。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 四、实验方法1. 富集培养 在已灭菌的液体培养管中用lmL灭菌注射器加入1%硫化钠和碳酸氢钠混合试剂0.1mL，加入青霉素液0.1mL，加入乙酸钠、甲酸钠

70、、甲醇各0.lmL，然后接入分离物lg。置35下振荡培养1015d。2. 熔化好装有固体培养基的培养管，排列在水温为5060的水浴锅中的试管架上，每一分离对象排列6支，每列前放一支同样组分、仅缺少琼脂的液体培养基。实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 3. 在每支琼脂培养管中，用lmL注射器分别加入硫化钠(1%)和碳酸氢钠(5%)混合试剂0.1mL、青霉素液0.1mL、乙酸钠0.lmL、甲酸钠0.1mL、甲醇0.1mL。4. 把加富培养物在旋涡混合器上将絮状物打散。5. 用lmL灭菌注射器以氮气流洗去氧后，吸取0.1mL样品，迅速注入第一支液体培养基中，此管立即在旋涡混

71、合器上混匀，然后换1支注射器取0.5mL注入第二支琼脂培养管中，依此稀释。每次稀释后均应混匀。一般稀释至10-6。稀释时，每做一个稀释度都要更换1支注射器。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 6. 在滚管机水槽中加入冰块，并加入冷水。水位加至滚轴下线浸没冰块约23mm，使在滚轴转动时冰水在滚轴上形成一层均匀水膜。冰块加入量使滚管过程中水温保持在较低温度，能使培养管中琼脂培养基迅速凝固。7. 启动滚管机，调节滚轴转速(6080r/min)，将上述稀释的琼脂培养管平稳放在滚轴与支托点之间，任意均匀转动。待琼脂培养基在培养管内壁凝固成均匀透明的琼脂薄膜为止。若无滚管机，可

72、在一瓷盘中加水和冰块(为降低温度还可加少量食盐)，用手滚管。 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 8. 如以二氧化碳为基质，滚管后用氢气置换氮气。再注入二氧化碳。30mL的厌氧培养管中注入6mL二氧化碳，或直接以氢和二氧化碳混合气体(5l体积比)进行换气。9. 滚管后放置于3537培养，约l015d后可见细小菌落出现。但以乙酸盐为基质的产甲烷菌菌落出现所需时间较长。10. 按亨氏厌氧操作法，用无菌毛细管挑取单菌落转液体培养基进行厌氧培养。在荧光显微镜下镜检单菌落培养物。产甲烷菌菌体有自发荧光，在荧光显微下菌体呈现黄绿色。如不纯，应做进一步的滚管分离，直至获得纯培养体。

73、 实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 五、实验报告 .记录产甲烷菌的分离方法及培养条件于下表2-8。2 .荧光显微镜下镜检单菌落培养物的记录于表2-9。表2-8 产甲烷菌分离方法及培养条件 样品来源分离方法培养基名称培养温度培养条件实验实验2-3 2-3 厌氧菌的分离与培养厌氧菌的分离与培养 表2-9 荧光显微镜下镜检单菌落培养物的记录 菌落编号自发荧光有无菌落特征镜检菌体颜色微生物实验技术微生物实验技术第三章第三章微生物的鉴定微生物的鉴定 微生物的鉴定微生物的鉴定微生物的鉴定微生物的鉴定 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的形态观察实验实验3-2 3-2

74、 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法实验实验3-4 3-4 微生物大小测定与计数微生物大小测定与计数实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的形态观察一、实验目的1. 学习微生物涂片、染色的基本技术。2. 掌握微生物的简单染色法。3. 熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区别。二、实验原理 微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助于染色，使菌体着色以增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的

75、形态观察 在微生物形态观察中，根据不同的种类，需采用不同的染液和染色方法。 染色前必须固定微生物，其目的有二：一是杀死微生物并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法，固定时应尽量维持细胞的原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的形态观察三、实验材料1. 菌种与染料 根据不同的菌种采用不同的染液，见表3-1和附录。 2. 仪器和其他用品 显微镜，接种环，解剖刀，镊子，酒精灯，载玻片，盖玻片，石蜡油，吸水纸，擦镜纸。 表3-1 不同微生物种类所使用的染液 微生物类群细菌放线菌酵母菌霉菌菌种大肠杆菌细黄链霉菌米酒酵母根霉

76、染液番红石炭酸复红吕氏美兰乳酸石炭酸棉蓝 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的形态观察四、实验方法（一）细菌、酵母菌的染色 染色操作程序为： 涂片干燥固定染色水洗干燥油镜观察。1. 涂片 取干净载玻片，于中央加蒸馏水一小滴，将接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后，取试管斜面一支，按无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不要挑破培养基)，涂在载玻片水滴中，涂面约为1cm2的均匀薄膜。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液12环涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过程见图3-1。 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的形态观察图3-1 无菌操作及做涂片的过程

77、 实验实验3-1 3-1 微生物的形态观察微生物的形态观察2.干燥 将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。 3.固定 手执涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通过火焰23次，使菌体固定于载玻片上，待载玻片冷却后，再加染料。4.染色 将涂片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位，染色12分钟。5.水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。6.干燥和镜检 让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。 实验实验3-1 3-1 微生物的

78、形态观察微生物的形态观察（二）放线菌、霉菌的染色1.制片及染色 用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一起挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层，然后将载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热，使培养基融化，冷却后，在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸石炭酸棉蓝染液，再轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。2. 镜检 先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。五、实验报告 绘出所观察到的各种微生物的形态。 返回 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 一、实验目的1.掌握芽孢染色的方法；2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；

79、3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。二、实验原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 细菌的鞭毛极细，其直径通常为1020nm，只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。 荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染

80、料之间的亲和力弱，不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 三、实验材料1.菌种 根据观察目的的不同，选用不同的实验菌种，见表3-2。 2.染料及试剂 孔雀绿染色液，硝酸银鞭毛染色液，黑色素水溶液（见附录），番红溶液，甲醇。3.仪器和用品 显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯等。 表3-2 细菌特殊结构观察所选用的菌种 观察目的芽孢鞭毛荚

81、膜实验菌种枯草芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌褐球固氮菌 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 四、实验方法（一）芽孢的染色1.涂片 取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固定。2.初染 加35滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上，用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本干涸。3.水洗 待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为止。4.复染 加番红液1滴，染色1min，水洗。5.镜检 干燥后用油镜观察。 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 （二）鞭毛染色1.菌种的准备 冰箱保存的菌种要连续移种1

82、2次，取新配制的营养琼脂斜面接种，2832培养1014h。2.载玻片的准备 玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 3.菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有12 mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 4.制片 取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37温箱)自然干燥。5.染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖35 min，

83、用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。6.镜检 干后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 （三）荚膜染色1.制片 在载玻片一端加一滴无菌水溶液，取少许培养72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌悬液，取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片，将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，风干。 2.固定 用纯甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇，文火干燥，勿使玻片发热。3.染色 滴加番红溶液

84、，染色12min，细水流适当冲洗，自然干燥。4.镜检 背景黑灰色，荚膜呈一清晰透明圈，菌体红色。 实验实验3-2 3-2 细菌特殊结构的观察细菌特殊结构的观察 五、实验报告1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。 返回 实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法 一、实验目的1.了解革兰氏染色的原理。2.掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理 革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可

85、将细菌分为两大类，菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。 实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法 其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙酮）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔径缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色。 实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法 三、实验

86、材料1.菌种 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。2.染料和器材 显微镜，载玻片，草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液（见附录），95%乙醇，番红染液，香柏油，二甲苯，擦镜纸。 实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法 四、实验方法 1.涂片 挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三区”涂片法：在玻片中央偏左和偏右方各加一滴无菌水，先挑取少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左右一方分别涂片后，再将左右方的菌液延伸于中间区，使大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相互混合。2.干燥 室温自然干燥。3.固定 涂面朝上，在火焰上过23次。 实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法

87、4.染色(图3-3)(1)初染 加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色12 min，水洗。(2)媒染 滴加卢戈氏碘液冲去残水，覆盖约1min，水洗。(3)脱色 斜置玻片于一烧杯上方，并在载玻片背面衬一白纸，滴加95%乙醇脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5 min)。立即用水洗净乙醇，并轻轻吸干。(4)复染 加番红染液一滴染色2min，水洗。 实验实验3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法 实验图3-3 革兰氏染色程序 1.加草酸铵结晶紫染12分钟；2.水洗；3.加碘液媒染1分钟；4.水洗；5.乙醇脱色约30s；6.水洗；7.番红复染约2分钟；8.水洗。 实验实验

88、3-3 3-3 革兰氏染色法革兰氏染色法 5.干燥 先用吸水纸轻轻吸干，再晾干。6.镜检 先用低倍镜找到物像后，用油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。五、实验报告 简述观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘图（说明各菌的形态、颜色和革兰氏染色反应）。 返回 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 一、实验目的1 .了解用测微尺测定微生物大小的方法；2 .了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。二、实验原理 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是

89、一块圆形的玻片，在载玻片中央有一条把5mm长度刻成50等分或把10mm长度刻成100等分的线(图3-2)。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 测量时，将其放在接目镜隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物像。目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数的不同而异。即目镜测微尺上的刻度只是代表相对长度，所以在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的长度。镜台测微尺是一个中央部分刻有一条长为lmm刻度的载玻片(比一般载玻片厚)，其上镶有一圆形玻片，其中lmm的刻度被精确等分为100小格，每格长0.01mm(图3-3)。因此长度固定不变，所以用镜台测

90、微尺的已知长度，在一定放大倍数下，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度(图3-4)。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 图3-2目镜测微尺 图3-3镜台测微尺 图3-4镜台测微尺校准目镜测微尺情况 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 血球计数板可用于计数一定体积内的微生物个体数量。血球计数板是一块特制的载玻片，玻片上有4条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央lmm2面积上刻有400个小方格(见图3-5)。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数

91、微生物的大小测定与计数 图3-5 血球计数板的构造 1-盖玻片 2-计数室 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 血球计数板有两种规格，一种是将lmm2面积分为25个大格，每个大格再分为16个小格(2516)。如在血球计数板上刻有一些符号和数字(见图3-5a)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格：即0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；(1/400)mm2表示计数室面积是lmm2，分400个小格，每小格面积是(1/400)mm2。另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(1625)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于

92、两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3(10-4mL)的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出lmL菌液所含的菌体数(见图3-6)。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 图3-6 两种不同刻度血球计数板的构造 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 三、实验材料1.标本 酿酒酵母，枯草杆菌染色标本片。2.仪器和用品 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，移液管，香柏油，二甲苯，盖玻片，擦镜纸等。四、实验方法（一）微生物大小的测定1.目镜测微尺的校正 （1）将目测微

93、尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；（2）把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，对准聚光器。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 （3）先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后转换高倍镜，再次调焦看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。（4）记录两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有若干格。各种放大倍数各测量3次，取其平均值。（5）因为镜台测微尺的刻度每格10m，所以由下式计算出用低倍镜、高倍镜和油镜观察物体时，目镜测微尺每格的实际长度。 实验实验3-4 3-4

94、 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 （6）移去镜台测微尺，并将其洗净、晾干，放回盒内。 例如，目镜测微尺5小格等于镜台测微尺2小格，则目镜测微尺上每小格长度为：2105=4m 用同法校正在油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度)进行，而且只能在特定的情况下重复使用。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 2.菌体细胞大小测定(1)取一张干净的载玻片，滴上一滴棉兰染色液或路戈氏碘液。(2)用接种环无菌操作取酵母菌少许制成水浸标本片。(3)取下镜台

95、测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格(不足1格的部分估计到小数点后l位数)。测出的格数乘上目镜测微尺每格代表的长度即等于该菌的大小。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 一般测量菌体的大小要在同一涂片上测定1015个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且是用对数生长期的菌体进行测定。 3.用同法在油镜下测定枯草杆菌染色标本的长和宽。 4.用毕后，取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，用擦镜纸擦去目镜测尺的油腻和手印，擦好油镜头。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定

96、与计数 （二）微生物的计数1. 稀释样品，为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含45 个细胞。2.取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5 10min 即可计数。3.将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动微调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 现以1625 规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下）的四中格（即100 小格）的酵母菌数。如果是2516 规格的计数板，除取四个角上四

97、中格外，还取正中的一个中格（即80 小格），对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌，或只计下方及右方线上的酵母菌。 每个样品重复计数3 次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母菌数。酵母菌细胞数/mL= 每个小格内细胞数400104稀释倍数 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 五、实验报告1.将实验结果填入下列空格目镜_倍，低倍镜_倍，高倍镜_ _，油镜 倍。高倍镜下，目镜测微尺_格：镜台测微尺_格。目镜测微尺每格=_m。油镜下，目镜测微尺_格镜台测微尺_格。目镜测微尺每格=_m。2.将测得的菌体大小记录于下表3-3中3. 将计数得的菌

98、体数量记录于下表3-4中 实验实验3-4 3-4 微生物的大小测定与计数微生物的大小测定与计数 菌号12345678910平均值 （m）长(格）宽(格）表3-3 菌体大小测量结果 表3-4 菌液中所含的酵母菌数 计数次数左上角方格左下角方格（中央方格）右上角方格右下角方格合计平均每个小格内细胞数123稀释倍数酵母菌细胞数mL返回 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 一、实验目的1. 了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。2. 了解不同种类的细菌对碳水化合物及含氮化合物的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性。3. 学习平板接种法及穿刺接种法。二、实验原理 由

99、于各种微生物的新陈代谢不同，因此对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，故可利用化学反应来测定微生物的代谢物（这种反应称为生化反应），并以此作为鉴定微生物的依据。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 三、实验材料1. 菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，普通变形杆菌。2. 培养基 淀粉培养基，葡萄糖蛋白胨培养基，蛋白胨水培养基，柠檬酸铁铵固体培养基等，见附录。3.试剂 卢戈氏碘液，40%NaOH溶液，5%-萘酚溶液（乙醇配制），甲基红试剂，吲哚试剂（见附录），乙醚等。4. 其他物品 无菌培养皿，无菌试管，接种环，酒精灯，接种针等。 实验实验3-5 3-5 微生

100、物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 四、实验方法(一) 淀粉水解试验 某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。操作步骤如下：1. 将盛有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水俗中融化，然后取出冷却至50左右，以无菌操作倾入培养皿中约1520mL，待凝固后制成平板。2. 翻转平皿使皿底朝上，用记号笔在其背面做好标记，以免菌种混淆。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 3. 用接种环取少量枯草芽孢杆菌在平板的一边划“+”字作为阳性对照菌；另取少量大肠杆菌或产气杆菌在平板的另一边划“+”字（图3-7），然后将培养皿

101、倒置于37恒温箱中培养24h。 4. 观察结果 打开培养皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 12图3-7 淀粉水解试验接种示意图 1.枯草芽孢杆菌； 2.大肠杆菌 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 (二) 乙酰甲基甲醇(V.P.) 试验 某些细菌在糖代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，二个分子丙酮酸经缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨

102、中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。此为V.P.试验的阳性反应。在试管中加入少量的-萘酚为颜色增强剂可使反应加快。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 操作步骤如下： 1. 分别接种大肠杆菌和产气杆菌于装有葡萄糖蛋白胨培养基的试管中，置于37恒温箱内培养2448h，有时需延长培养到10天。2. 在已培养两天的试管内，先加入40%KOH溶液1020滴，然后再加入等量的-萘酚溶液，拔去棉塞用力振荡，再放入37恒温箱中保温1530min(或在沸水浴中加热12min)。如培养液出现红色为V.P.阳性反应。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定

103、 (三) 甲基红(M.R.)试验 有些细菌在糖代谢过程中，可把培养基中的糖分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示。甲基红的变色范围pH4.2(红色)pH6.3(黄色)。操作步骤如下：1. 取葡萄糖蛋白胨培养液两支，一支接入大肠杆菌，另一支接入产气杆菌，置37恒温箱内培养48h。2. 观察结果时，沿管壁加入甲基红指示剂34滴，若培养液变红色即为阳性，变黄色则为阴性。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 (四) 吲哚试验 有些细菌能氧化分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚无色，可与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色的玫

104、瑰吲哚。操作步骤如下：1. 以无菌操作分别将产气杆菌和大肠杆菌接种在蛋白胨水培养中，置37恒温箱内培养48h。2. 观察结果时，在培养液中加入乙醚12mL（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚被溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上层，然后沿试管壁加入10滴吲哚试剂，如果有吲哚产生，则乙醚层呈现玫瑰红色。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 (五) H2S产生试验 某些细菌能分解含硫有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，会形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。操作步骤如下：1. 取2支柠檬酸铁铵固体培养基，分别用穿刺接种大

105、肠杆菌和普通变形杆菌，置37恒温箱内培养48h。2. 观察结果，如培养基中出现黑色沉淀线者为阳性反应，同时注意观察接种线周围有无向外扩展情况，如有表示该菌具有运动能力。 实验实验3-5 3-5 微生物的理化性能鉴定微生物的理化性能鉴定 五、实验报告 将实验结果填入下表3-5。“”表示阳性反应，“”表示阴性反应。 表3-5 微生物的理化性能鉴定结果 试验名称 菌 种淀粉水解试验VP试验MR试验吲哚试验硫化氢产生试验大肠杆菌产气杆菌普通变形杆菌枯草芽孢杆菌微生物实验技术微生物实验技术第四章第四章微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术 微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术微生物

106、菌种的保藏、筛选及诱变技术微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术微生物菌种的保藏、筛选及诱变技术 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育实验实验4-2 4-2 紫外线诱变育种紫外线诱变育种实验实验4-3 4-3 微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法实验实验4-44-4苏云金杆菌的虫体复壮苏云金杆菌的虫体复壮 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育一、实验目的 1. 学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。 2. 学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。二、实验原理 酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒

107、死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。 含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育三、实验材料 1.菌源 含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。2.培养基 耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ，碳源对照培养液a，苯酚培养液b，见附录。3.试剂 2% 4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液, 1%淀粉溶液，（见附录）。4.其他

108、 稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育四、实验方法 1.采样 自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌瓶中，带回实验室，记录采样日期、地点，曝气池的水质分析包括：挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。采集的样品应迅速稀释分离。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育2.分离纯化 梯度平板制备：在无菌培养皿中，先倾倒7l0m

109、L不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基，将培养皿一侧置于木条上，使皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入无菌7l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基，刚好完全盖住下层斜面，放置过夜。由于苯酚的扩散作用，造成上层培养基由厚到薄的药物浓度递减的梯度(图4-1)。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育图4-1 梯度平板 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育 涂布法分离：将采集的样品按涂布法分离，30培养2天后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，苯酚低

110、浓度区形成菌苔，苯酚高浓度区出现稀少菌落，将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，30培养2天。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育3.耐酚菌驯化 先将从含酚废水采集的活性污泥放入含酚量小于l00mg/L含酚废水中，添加0.3%MgSO47H2O、0.3%KH2PO4，30振荡培养67天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再流加含酚废水，使苯酚浓度增加至200mg/L，30振荡培养46天；再提高到流加250mg/L含酚废水，30培养4天，从中选出对酚耐受力强的菌株。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生

111、物的选育降解苯酚微生物的选育4.性能测定。 初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度为0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，将选出的耐酚力强的的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为酚降解力高的菌株。 复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯酚培养液b中， 30振荡培养48h，0、12、24、36、48h取样测A600光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源(葡萄糖)培养液为对照。若与对照相比，在250mg/L苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显，同时，用4-氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若苯酚

112、降解率达80%，表明确系分离到有效苯酚降解菌。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育五、实验报告1记录分离得到的苯酚降解菌情况于表4-1。 2根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长曲线。3记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的菌落特征和镜检特征。 实验实验4-1 4-1 降解苯酚微生物的选育降解苯酚微生物的选育表4-1 苯酚降解菌株的降解率 菌源菌株不同酚浓度平板生长状况0.025%0.045%0.060%0.075%菌源菌株苯酚降解率70%71%80%81%90%91%100%返回实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养

113、缺陷型突变株 一、实验目的1掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理。2学习筛选、检出和鉴定营养缺陷型突变株的方法。二、实验原理 本实验以紫外线作为诱变因素，照射时间为60s，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。再根据营养缺陷型在基本培养基上不能生长，只能在完全培养基或基本培养基中加有它所缺陷的那种物质才能生长的原理，采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，然后用生长谱法将缺陷型加以鉴定。 实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 三、实验材料1.菌种 野生型大肠杆菌（E.coli）。2.培养基 肉汤液体培养基，加倍肉汤液体培养基(2E)，固体完全培养基，基本培

114、养基(固体)，无N基本液体培养基，2N基本液体培养基，见附录。3.生长因子类别混合氨基酸和混合维生素的配制（若所用氨基酸为DL型，量需加倍），共分八组（见表4-2）.器材 培养皿(9cm、6cm)，三角瓶(150mL)，lmL吸管，10mL吸管，离心管(10mL)，带15 W紫外灯管照射装置，离心机等。 实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 表4-2 混合氨基酸和混合维生素的配制 I赖精甲硫半胱胱嘌II组精苏谷天冬嘧丙甲硫苏羟脯甘丝亮半胱价羟脯异亮缬苯丙胱天冬甘异亮酪色嘌嘧缬酪脯混合维生素（含多种常用维生素）实验实验4-2 4-2 利用紫

115、外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 四、实验方法1.诱变处理 （1）实验前1416h挑取野生型大肠杆菌1环于盛有5mL肉汤的三角瓶中，置37培养过夜。（2）第2天添加5mL新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，继续培养5h。（3）取5mL培养好的溶液倒入离心管中，离心(3500r/min，10min)。（4）倒去上清液，打匀沉淀，吸入5mL生理盐水，制成菌悬液。实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 （5）吸上述菌液3mL于直径为6cm的小培养皿内(皿内放一搅拌子，下为磁力搅拌器)，将培养皿放在15W的紫外光灯下，距离2

116、8.5cm。（6）处理前先开紫外灯稳定10min以上，将待处理的培养皿连盖放入灯下灭菌lmin，然后开盖在搅拌条件下处理lmin，照射后盖上皿盖，再关紫外灯。（7）吸3mL加倍肉汤培养液倒入处理后的培养皿中，放置在37温箱内，避光培养12h以上。 实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 2.用青霉素法淘汰野生型 （1）吸5mL处理过的菌液于已灭菌的离心管，离心10min(3500r/min)。（2）倒去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，离心洗涤3次，吸生理盐水到原体积。（3）吸取经离心洗涤的菌液0.1mL于5mL无N基本培养液，37培养12h

117、。（4）培养12h后，按11加入2N基本培养液5mL，称取青霉素钠盐，使青霉素在菌液中的最终浓度约为500u/mL，再放入37温箱中培养。（5）从培养12，16，24h的菌液中，各取0.1mL菌液到预先倒好的基本培养基和完全培养基的平板中涂皿。放入37温箱中培养。 实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 3.缺陷型的检出 （1）以上平板培养3648h后，进行菌落计算，选用完全培养基上长出的菌落数大大超过基本培养的那一组，用无菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个，分别点种于基本与完全培养基平板上，先基本后完全，于37温箱培养。（2）培养1

118、2h后，选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落，在基本培养基的平板上划线复证。37温箱培养，24h后不生长的可能是营养缺陷型，便可用于鉴定。 实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 4.生长谱鉴定（1）将可能是缺陷型的菌落接种于盛有5mL肉汤培养液的离心管中，37培养1416h。（2）培养16h后，以3500r/min离心l0min，倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加生理盐水到原体积。（3）吸取经离心洗涤的菌液lmL于灭菌的培养皿中，然后倒入熔化后冷至4050的基本培养基，摇匀放平，待凝，共做两皿。实验实验4-2 4-2

119、利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 （4）将两只培养皿的皿底，等分8格，依次放入混合氨基酸，混合维生素和核酸碱基混合物，然后放入37温箱培养2428h。 整个实验过程参见图4-2。 五、实验报告 观察生长圈，确定是哪种营养缺陷型。 实验实验4-2 4-2 利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株利用紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 图4-2紫外线诱变筛选大肠杆菌营养缺陷型突变株流程图 返回 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 一、实验目的了解并掌握菌种保藏的常用方法、基本原理及其应用。二、实验原理 菌种保藏的原理是微生物在低温、干燥、缺氧的条件下会

120、降低代谢活动，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而能够较长期地保藏菌种，并能推迟细胞退化，降低菌种的变异率。 常用的保藏方法包括斜面传代保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法等。这些方法操作简便易行，不需要特殊设备，为一般实验室及生产单位广泛采用。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 三、实验材料1. 菌种 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌斜面菌种。2. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马丁氏培养基，马铃薯葡萄糖培养基。3. 试剂 10%HCl，筛子，无水氯化钙，医用液体石蜡（比重0.830.89），河沙，瘦黄土（含有机物少的黄土）。4. 器材 干燥器，40目

121、及100目无菌筛子，无菌试管，无菌移液管（1mL及5mL），接种环，接种针，无菌滴管，超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 四、实验方法1. 砂土管保藏法 此法仅适用于保藏产生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌或霉菌等。(1)无菌砂土管制备 河砂处理 取河砂10001500g，用40目筛子过筛，除去大的颗粒。再用10%HCl溶液浸泡，除去有机杂质，盐酸用量应浸没砂面，约浸泡24 h，倒出盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。用磁铁石除去黄砂中的铁质。筛土 取30cm以下的较贫瘠非耕作层的黄土若干，自来水冲洗至中性，烘干磨细

122、，用100目筛子过筛。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 砂和土混合 砂和土以11或32混合均匀，装入100mm10mm小试管中。装量约1 cm高即可，塞上棉塞，包上牛皮纸。 灭菌 高压蒸汽灭菌，121灭菌11.5 h。每天一次，连续灭3 d。在50以下烘干。无菌检查 取灭菌后的砂土少许，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，37培养12 d，观察有无杂菌生长。如有，则需重新灭菌。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 （2）制备菌悬液 首先使斜面菌体生长健壮，孢子饱满，吸取35 mL无菌水至1支已培养待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下孢子或菌苔（注意不要带入菌丝

123、和培养基），使成菌悬液，细胞浓度为1081010mL-1。 （3）加样 用无菌吸管吸取菌悬液，在每支砂土管中滴加45滴菌悬液，用接种环拌匀，塞上砂土管棉塞。 （4）干燥 将已滴加菌悬液的砂土管置于干燥器内。干燥器内应预先放置无水氯化钙用于吸水。当无水氯化钙因吸水变成糊状时则应进行更换。如此数次，砂土管即可干燥。有条件时，也可用真空泵连续抽气约4 h，即可达到干燥效果。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 （5）抽样检查 从抽干水分的砂土管中，每10支抽取1支进行检查。用接种环取少许砂土，接种到适合于所保藏菌种生长的斜面上，并进行培养。检查有无杂菌生长及所保藏菌种的生长情况。

124、 （6）保藏 若经检查没有发现问题，可将砂土管继续放在干燥器内（干燥器底部盛有硅胶、石灰或五氧化二磷等物），用橡皮塞或棉塞塞住试管口，并置于室温或4冰箱保存。也可用真空泵抽干水分后火焰封口。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 2.斜面保藏方法（1）贴标签 在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期，贴在试管斜面正上方距离试管口23cm处。（2）斜面接种 将待保藏的菌种用斜面接种法接种在已注明菌名的试管斜面上。（3）培养 细菌置37恒温箱中培养1824 h，酵母菌置2830恒温箱中培养2660 h，放线菌和丝状真菌置28培养47天。（4）保藏 斜面长好后，直接放入4

125、的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏三个月至半年。 实验实验- -微生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 3. 液体石蜡保藏法（1）液体石蜡灭菌 将液体石蜡置于100 mL的小锥形瓶内，每瓶装10 mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌，121灭菌30 min。灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于105110的烘箱内约1 h，以 除去液体石蜡中的水分。（2）接种 将菌种接种至适宜的斜面培养基上。 （3）培养 在适宜温度条件下培养，使其充分生长。 （4）加液体石蜡 用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡的用量以高出斜面顶端12 cm左右为宜，使菌种与空气隔绝 实验实验- -微

126、生物菌种的保藏方法微生物菌种的保藏方法 （5）保藏 将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于45冰箱或室温下保存。 （6）转接 到保藏期后，需将菌种转接至新的斜面培养基上，培养后再加入适量灭菌液体石蜡，进行保藏。注意：注意：从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅。五、实验报告记录各种菌种保藏的方法和结果。 返回 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 一、实验目的 学习从病虫体内复壮病原菌的一般方法。二、实验原理 苏云金杆菌及其变种杀螟杆菌、青虫菌和松毛虫杆菌等都是昆虫的致病细菌。将它们经过固体或液体培养基大量培养后，可收集其菌体并添

127、加适量的填充料如碳酸钙等，以制成杀虫菌粉。它对玉米螟、稻苞虫、粘虫、松毛虫、棉铃虫和菜青虫等几十种鳞翅目昆虫的幼虫均具有很强的感染力。 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 生产菌种经过若干代之后往往会出现菌种衰退，表现为产芽孢或伴孢晶体的数量越来越少，体积变小，毒力下降等。为了保证生产菌种能保持较强的毒力和原有的性状，就要进行经常性的菌种复壮工作。对于杀虫菌来讲，复壮就是用原来生产菌种制成悬浮液，然后将它拌到饲料中饲养昆虫(选健壮的3龄幼虫)，待昆虫死后再从虫体内重新分离出苏云金杆菌。如此重复48次即可得到毒力强的菌种。另外，也可从自然界死亡虫体中分离菌种。 实验实验4-4

128、4-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 三、实验材料1. 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基。2. 器材 显微镜，无菌培养皿，无菌三角瓶(内装玻璃珠)，镊子，解剖针，无菌滴管等。 3. 试剂75%乙醇，5.25%次氯酸钠(即漂白粉)，10%硫代硫酸钠。四、实验方法1. 制备菌液将菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，置30恒温培养24h后，用无菌水洗下菌苔制成孢子悬液。 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 2. 感染昆虫将上述菌液滴加在喂饲昆虫的叶片上，晾干后任昆虫(挑选健壮的3龄幼虫)取食，然后将虫子放25恒温条件下饲养，待昆虫死亡后采集死虫。3. 采集死虫濒于死亡的昆虫幼虫停止取

129、食后，口吐褐色体液，排泄稀粪于叶片或其他附着物上，部分或大部分的虫体开始变为褐色。由于细菌在虫体内大量繁殖，结果使幼虫的体壁变得薄而易破，因此采集时要特别小心。将采集来的昆虫放在无菌培养皿或无菌小瓶中。如果死虫紧贴在粘附物上可连同基物一起采集。 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 4. 虫体表面消毒为防止消毒溶液渗入体腔，应用棉线结扎虫体的口腔和肛门。将虫体浸入75%乙醇中，浸数秒钟后即移入含5.25%漂白粉的溶液中，浸35 min，再将虫体转入10%硫代硫酸钠溶液内浸35min，以除去游离的氯，最后用无菌水冲洗虫体5次，供分离菌种用。 5. 分离细菌把消毒好的幼虫置无菌培

130、养皿中，在无菌条件下，用手术小剪刀沿虫体的背线或侧线剖开，即可流出褐色的体液，或用小剪将肛门端剪掉，轻压另一端，也可挤出褐色的体液。然后，用无菌滴管吸取褐色体液于盛有50mL无菌水的三角瓶内(瓶内装有玻璃珠)，充分振荡三角瓶，以分散菌体。然后用平板划线法或稀释涂布法进行分离纯化。 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 6. 挑单菌落 苏云金杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基中，于30培养24h后即可形成灰黄色、不透明、有皱纹、边缘不规则的菌落，然后用接种环挑若干个单菌落分别接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，置30培养48h后，再用显微镜观察细菌形态。 7. 镜检制备苏云金杆菌的涂片，经染

131、色后置油镜下观察；苏云金杆菌菌体呈杆状，两端钝圆。8. 保藏将检查合格的菌株直接放入4冰箱保藏或将斜面菌苔用生理盐水洗下制成高浓度的孢子悬液，然后取0.2 mL菌液于无菌的砂土管中，置真空干燥器内(装有CaCl2或P2O5)，用真空泵抽干后放4冰箱保藏。 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 五、实验报告 将分离苏云金杆菌的结果记录于表4-2中。 注意事项：1. 不要采集死亡时间较长的虫体。因死亡时间太长，昆虫肠道内的微生物及外界其他微生物可能同时侵入组织中进行繁殖，从而会增加分离的困难。2. 注意辨别所挑的菌落是昆虫体内的病原菌还是由于消毒不严或操作不慎而带入的杂菌。除了观

132、察其菌落形态外还可从以下两方面进行判断：进行释稀涂布分离时，在不同稀释度平板上具有苏云金杆菌特征的菌落数是否按比例递减；将分离前的菌液与分离得到的单菌落各做一张涂片，观察两者细胞形态是否相同。 实验实验4-44-4 苏云金杆菌的复壮苏云金杆菌的复壮 表4-2 苏云金杆菌的分离结果 挑选的单菌落菌落特征芽孢形状有无伴孢晶体菌种保藏方式12345微生物实验技术微生物实验技术第五章第五章 微生物在各行业生产中的应用微生物在各行业生产中的应用 微生物在各行业生产中的应用微生物在各行业生产中的应用微生物在各行业生产中的应用微生物在各行业生产中的应用 实验实验5-1 5-1 酸乳的制作酸乳的制作实验实验5

133、-2 5-2 甜酒酿的酿制甜酒酿的酿制实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵实验实验5-4 5-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验实验实验5-5 5-5 阿维菌素发酵阿维菌素发酵实验实验5-6 5-6 单细胞蛋白生产单细胞蛋白生产实验实验5-7 5-7 纤维素分解纤维素分解实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 实验实验5-1 5-1 酸乳的制作酸乳的制作一、实验目的学习酸乳的制作方法。二、实验原理 酸乳是以牛乳为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后而制成的一种乳制品饮料。当乳酸菌在牛

134、乳中生长繁殖和产酸至一定程度时，牛乳中的蛋白质就凝结成块状。它具有清新爽口的味觉。由于酸乳中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，它对肠道内的致病菌有一定的抑制作用，故对人体的肠胃消化道疾病也有良好的治疗效果。通过本实验学习制作酸乳和成品质量的评定。 实验实验5-1 5-1 酸乳的制作酸乳的制作三、实验材料1.酸乳菌种 市场销售的各种酸乳。2.培养基 酸乳发酵培养基（市场销售的牛乳）。3.其他 无菌血浆瓶(250mL)，恒温水浴锅，培养箱，冰箱等。四、实验方法1.配复原牛奶：用市售鲜牛奶加入56%蔗糖调匀即可。2.装瓶：在250mL的血浆瓶中装入牛乳200mL。3.消毒：将装有牛乳的血浆瓶置于80恒温水

135、浴锅中用巴氏消毒法消毒15min，或者置于90水浴中消毒5min即可。 实验实验5-1 5-1 酸乳的制作酸乳的制作4.冷却：将已消毒过的牛奶冷却至45。5.接种：以510%接种量将市售酸乳接种入冷却至45的牛奶中，并充分摇匀。6.培养：把接种后的血浆瓶置于4042温箱中培养34h(培养时间视凝乳情况而定)。 7.冷藏：酸乳在形成凝块后应在47的低温下保持24h以上(称后熟阶段)，以获得酸乳的特有风味和较好的口感。 8.品味：酸乳质量评定以品尝为标准，通常有凝块状态、表层光洁度、酸度及香味等数项指标，品尝时若有异味就可判定酸乳污染了杂菌。 实验实验5-1 5-1 酸乳的制作酸乳的制作五、实验报

136、告 记录各批混菌发酵的酸乳品评结果，包括凝乳情况、口感、香味、异味、pH。注意事项： 在酸乳发酵及传代中应避免杂菌污染，特别是芽孢杆菌的污染，否则可导致酸乳产生异味。 返回 实验实验5-2 5-2 甜酒酿的酿制甜酒酿的酿制 一、实验目的学习甜酒酿的酿制方法。二、实验原理 酿制甜酒酿的原理十分简单，即将煮熟的米饭经接种酒酿种曲后，在适宜的培养条件下让种曲中的根霉孢子萌发成菌丝体；经大量繁殖后通过淀粉酶的作用将淀粉转化为葡萄糖，此为根霉的糖化阶段。然后，再由根霉或种曲中所含的酵母菌或野生酵母菌继续将糖化后的部分葡萄糖转化为乙醇，经后熟使甜酒酿具有独特的甜醇口味。 实验实验5-2 5-2 甜酒酿的酿

137、制甜酒酿的酿制 三、实验材料1.菌种来源 “浓缩甜酒药”(沪产)或苏州等地产“甜酒药”、“幽白药”或小曲。2.培养基 糯米饭，马铃薯葡萄糖培养基。3.其他 研钵，培养皿，试管，移液管，接种环等。四、实验方法1 .选择原料：酿制甜酒酿的原料常用糯米，选择时，力求用品质好、米质新鲜的糯米。2 .淘洗和浸泡：将米淘洗干净后浸泡过夜，使米粒充分吸水，以利蒸煮时米粒分散和熟透均匀。 实验实验5-2 5-2 甜酒酿的酿制甜酒酿的酿制 3 .蒸煮米饭：将浸泡吸足水分的糯米捞起，放在蒸锅内搁架的纱布上隔水蒸煮，至米饭完全熟透时为止。4 .米饭降温：将蒸熟的米饭从锅内取出，在室温下摊开冷却至80左右待接种。5

138、.接入种曲：按干糯米重量换算接种量。市售“甜酒药”每包能酿制3 kg糯米；而沪产“浓缩甜酒药”每包可接1.52 kg糯米。为使接种时种曲与米饭拌匀，可先将酒药块在研钵中捣碎，或再拌入一定数量的炒熟面粉后再与大量米饭混匀。 实验实验5-2 5-2 甜酒酿的酿制甜酒酿的酿制 6 .装坛发酵：接种拌匀后的米饭可装坛子发酵（通常应在坛子的中轴留一散热孔道）。所用的容器都应预先洗净，并用开水浇淋浸泡过，以杀死大部分杂菌。7 .保温发酵：温度可控制在30左右，发酵初期可见米饭表面产生大量纵横交错的菌丝体，同时糯米饭的粘度逐渐下降，糖化液渐渐溢出和增多。若在发酵中米饭出现干燥时，可在培养1824h补加一些凉

139、开水。8 .后熟发酵：酿制48h后的甜酒酿已初步成熟，但往往略带酸味。如在810条件下将它放置23天或更长一段时间进行后发酵，则可去尽酸味。9 .质量评估：酿成的甜酒酿应是酒香浓郁、醪液充沛、清澈半透明和甜醇爽口的。 实验实验5-2 5-2 甜酒酿的酿制甜酒酿的酿制 五、实验报告 从甜酒酿的外观（酒酿醅团块、醪液量及色泽和粘稠度等）和香味、口感等方面记录和评估自己实验的质量。注意事项注意事项 淘洗的糯米要待充分吸水后隔水蒸煮熟透，使饭粒饱满分散，利于接种后的根霉孢子能在疏松通气的条件下良好地生长繁殖，使淀粉充分糖化。 返回 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 一、实验目的 1.了解谷

140、氨酸发酵的工艺过程。 2.学习用纸上层析法与比色法对谷氨酸进行定性与定量测定。二、实验原理 利用细菌生产谷氨酸是微生物好氧发酵的一个很典型的代表，谷氨酸发酵主要采用糖质原料，也可以用乙酸或乙醇等作原料。在使用糖质作原料时，葡萄糖在谷氨酸产生菌的各种酶系作用下，经己糖酵解、单磷酸己糖、三羧酸循环、乙醛酸循环等途径生成谷氨酸、CO2和水。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 谷氨酸生产菌主要是棒杆菌属、短杆菌属、微杆菌属和节杆菌属的细菌。目前生产上用得较多的是优良菌株黄色短杆菌T6-13。 由斜面试管保藏的原菌出发，要繁殖成能够供大规模生产所需的数百以至数千升种子的数量，必须经过若干次扩

141、大培养后才能达到。一般的扩大培养工艺流程为：试管斜面原菌试管斜面活化培养三角瓶摇床培养(一级种子)种子罐培养(二级种子)。本实验中使用一级种子。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 三、实验材料 1. 菌种 黄色短杆菌T6-13。2. 培养用原材料 葡萄糖，玉米浆，尿素，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸锰，硫酸亚铁，琼脂。3. 仪器和试剂 接种环，酒精灯，试管，三角瓶，烧杯，恒温培养箱，恒温培养室，摇床，分光光度计，层析缸，新华一号滤纸，标准谷氨酸，0.5%茚三酮，正丁醇，甲酸，氨水，乙醇，硫酸钠。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 四、实验方法1. T6-13菌种的扩大培养 (

142、1)培养基的制备试管斜面培养基 葡萄糖0.1%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH6.87.2。 除琼脂外，先将其余各成分溶解于水，调整pH后加入琼脂并使之融化，分装试管，一般培养基的装量是试管容量的1/5。以111蒸汽灭菌10min，取出后趁热制成斜面，放冷，斜面的长度为试管长度的1/23/5。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 三角瓶扩大培养基 葡萄糖2.5%，玉米浆2.5%，尿素0.5%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.04%，硫酸锰2mg/kg， 硫酸亚铁2mg/kg ，pH 7.0。(2)接种与扩大培养将试管斜面T6-13菌种接种于试管活化斜面培养基上

143、，以3033培养24h。将培养好的斜面菌种接一环于三角瓶扩大培养基中，3234摇床振荡培养1012h。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 2. 谷氨酸发酵试验(1)培养基的制备 同种子培养基的制备。将制备好的灭菌培养基在无菌条件下分装于已经灭过菌的500mL三角瓶中，每瓶装100mL。 (2)接种与发酵 将培养好的成熟种子接种于上述发酵培养基中，接种量为1%2%。 发酵温度控制：016h为3234，16h后为3436。 发酵液pH控制：012h为7.17.4，1228h为7.17.3，28h后适当降低，一般为7.0以下，收瓶前为6.46.7。发酵时间控制：3436h。 实验实验5-

144、3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 3.谷氨酸定性鉴定 用纸上层析法定性测定发酵产物中的谷氨酸。 (1)展开剂配方 酸向展开：正丁醇88%甲酸水=1532 碱向展开：正丁醇12%氨水=132 (2)显色剂：0.5%茚三酮。 (3)以标准谷氨酸与样品相比。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 4.谷氨酸定量测定(用比色法)(1)将上述定性测定的层析斑点剪下，投入盛有6mL洗脱剂的容器中(75%乙醇39份+0.2%硫酸钠1份)，洗脱1h。将洗脱液在波长520nm处进行比色。 (2)以同一滤纸上无斑点处剪一块与层析斑同样大小的滤纸做空白对照，用同样的方法进行洗脱处理。 (3)绘制标准谷氨酸工

145、作曲线。 点样：取10cm10cm新华一号滤纸，在距底边2cm处用铅笔画一直线，在直线上每隔2cm处，分别以2、4、6、8、10L标准谷氨酸准确点样。 实验实验5-3 5-3 谷氨酸发酵谷氨酸发酵 依法进行展开、显色、洗脱、比色。以所测得的光密度为纵坐标，以谷氨酸的含量为横坐标做图，即得谷氨酸工作曲线。 五、实验报告绘制标准曲线，记录实验结果，并计算谷氨酸的产量。 返回 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 一、实验目的 1.熟识酵母菌的扩大培养技术。 2.掌握淀粉质原料发酵乙醇的技术。 3.学会测定乙醇发酵力的方法。二、实验原理 在无氧条件下，酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO2的作

146、用，称为乙醇发酵。目前乙醇发酵所采用的微生物主要是酵母菌。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种，由于其酵母数量太少，不够生产之需，所以必须将斜面菌种进行若干次的扩大培养，以获得含有足够数量酵母菌的酵母培养物，以供乙醇发酵之用，故被称为酒母。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 本实验由于所用的发酵容器是三角瓶，故采用的扩大培养流程为：固体斜面试管原菌固体斜面试管活化菌种液体试管培养小三角瓶培养大三角瓶发酵。 酵母菌的厌氧乙醇发酵是生产乙醇及各种酒类的基础，因此学会乙醇酵母的扩大培养技术及其乙醇发酵方法是发酵微生物学的一项重要任务和基本功。 另外，通过测定发酵过程中CO2生

147、成量和最终产物乙醇的生成量，可以测定酵母的发酵能力。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 三、实验材料1.菌种 K氏酵母菌或1308号酵母菌。2.试验用原材料 麦芽，甘薯粉或木薯粉，细菌淀粉酶，琼脂。3.仪器设备 接种环，酒精灯，试管，三角瓶，烧杯，水浴锅，恒温培养箱，蒸馏烧瓶，冷凝管，牛角管，容量瓶，量筒，电炉，石棉铁丝网，030%(体积分数)乙醇，050温度计，0100温度计。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 四、实验方法1. 酵母菌的扩大培养(1)培养基的制备 酵母扩大培养中的试管和三角瓶培养用的培养基通常采用麦芽汁，其制备方法如下：将干麦芽磨碎，加入3.5倍

148、量的65的热水，在5860的温度下糖化34h，以碘液检查糖化完全后，将其煮沸、过滤，将滤液浓度调整到13oBx。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 将上述制备好的麦芽汁进行分装并灭菌：固体斜面试管培养基：取100mL麦芽汁，加入2%琼脂，融化后分装试管，一般培养基的装量是试管容量的1/5。以121蒸汽灭菌20min，取出后趁热置成斜面，放冷，斜面的长度为试管长度的1/23/5。液体试管培养基：用稀硫酸将麦芽汁pH调节至44.4，分装于试管中，每支试管装5mL。以121蒸汽灭菌20min。小三角瓶培养基：将pH调节至44.4的麦芽汁分装于容量为150mL的三角瓶中，每瓶装50mL。

149、以121蒸汽灭菌20min。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 (2)接种与扩大培养将斜面试管酵母原菌移接于固体斜面试管，于2830下培养48h。将上述培养好的斜面活化酵母菌种接一环于液体试管中，以2830培养24h。将上述液体试管酵母接种于小三角瓶中(每支试管接一个三角瓶)，以2830培养至对数期末(约16h)。 (3)种子(酒母)质量要求 对培养好的三角瓶种子要进行质量检查。镜检时要求酵母形态健壮整齐，细胞内原生质稠密，无杂菌；细胞数0.81.0108个/mL，出芽率20%30%，死亡率小于1%。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 2. 淀粉原料的蒸煮与糖化(1

150、)按甘薯粉或木薯粉的3.5倍量的加水比，用5055的温水与淀粉原料搅拌混合，添加原料量0.1%的细菌淀粉酶，于电炉上加热并不断搅拌，升温至9093，保持510min，进行液化；继续加热煮沸lh，使淀粉充分糊化和液化，并适量补充水分。(2)将上述蒸煮醪冷却至6062，添加180ug原料的糖化酶，用硫酸将醪液的pH调节至44.5，在水浴锅上保温糖化30min，而后分装于1000mL的三角瓶中，每瓶装糖化醪500mL。(3)糖化醪的质量要求：糖度1517Bx，还原糖6%9%，pH44.5。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 3. 糖化醪的发酵 将培养成熟的小三角瓶酵母种子(酒母)以无菌

151、操作接入装有500mL糖化醪的大三角瓶中(每个小三角瓶中接一个大三角瓶)，在30的温度下发酵6872h。 4. CO2生成量的测定测定乙醇发酵中CO2生成量的装置如图5-1所示。其测定方法如下： (1)发酵前，将三角瓶外壁擦干，置于1/100g的天平上称重，记下质量为m1。(2)发酵完毕后，将三角瓶轻轻摇动，使CO2尽量逸出。在同一架天平上再称重，记下质量为m2。(3) CO2生成量= m1m2。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 5. 乙醇度的测定(1)按图5-2所示安装好蒸馏装置。(2)准确量取100mL发酵成熟醪倒入500mL蒸馏瓶中，并加入等量的蒸馏水。蒸馏瓶用插有温度计

152、的胶塞塞紧，连接好冷凝管，勿使漏气。用电炉加热，同时接通冷却水，馏出液收集于100mL容量瓶中(如无容量瓶亦可直接用100mL量筒收集)。待馏出液达到刻度时，立即停止收集(注意：不能超过刻度)，倒入量筒中，稍加搅动，使之均匀，将酒精计与温度计同时置入量筒，测定酒精度与温度。(3)根据测得的乙醇度与温度，查换算表，得到温度在20时的乙醇浓度。 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 图5-1 测定CO2生成量的装置 图5-2 蒸馏装置 实验实验5-45-4 乙醇发酵试验乙醇发酵试验 五、实验报告1. 记录镜检酒母时看到的酵母形态，有无杂菌污染，酵母菌的数目。2. 发酵试验中测得的 CO2

153、生成量。3. 蒸馏液的乙醇度，换算成标准温度20的乙醇度。 返回 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 一、实验目的 学习阿维菌素的发酵过程二、实验原理 阿维菌素的发酵共分三大工序：菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。 衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 三、实验材料1. 菌株 阿维菌素链霉菌斜面菌种。2. 培养基 培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发酵培养基。见附录。3. 仪器及药品

154、接种环，培养皿，三角瓶，摇床，离心管，高效液相色谱柱，漩涡振荡器，微孔滤膜，淀粉酶，丙酮，乙酸乙酯，无菌水。 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 四、实验方法1. 实验用菌种的制备（1）单孢子悬液的制备 向阿维菌素链霉菌孢子斜面中加入10mL无菌水，用接种环刮取孢子，震荡打碎，过滤得到单孢子悬液。（2）自然分离 将得到的单孢子悬液稀释，分别涂布于含有分离培养基的平皿中，在28条件下培养79天。 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 2. 发酵培养基和待检测发酵液样品的制备（1）水解淀粉的制备 称取玉米淀粉200g，先加入少量水混合均匀，加热使其糊化，降温至60

155、，然后在糊化的淀粉液中加入0.6g的淀粉酶，恒温搅拌10min，最后加热至沸腾状态，保温5min，使残留的淀粉酶失活，降温待用。（2）液体发酵 铲取面积为0.50.52大小的斜面培养物，将其接种至种子瓶的培养基中，28摇床培养22h后，按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中，28培养9天。 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 （3）检测发酵液中阿维菌素样品的制备 取5mL摇瓶发酵液于离心管中，3000r/m离心10min，弃去上清夜。在发酵液的沉淀物（菌丝体）中加入2mL丙酮，在漩涡式混合器上震荡1min，静置10min，如此重复3次。然后加入3mL乙酸乙酯，震荡1min，静

156、置10min，3000r/m离心10min，最后小心地吸取其中的上清夜作为样品，待检测。 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 3. 阿维菌素含量的测定 利用高效液相色谱法（HPLC）检测（1）HPLC条件色谱柱 ：Kromasil C18 5m 2004.6mm流动相： CH2OHH2O8812(V/V) 流速：1.0mL/min检测波长：244nm（2）标准曲线的测定 配制一系列不同浓度的阿维菌素B1标准溶液（5003000g/mL），分别取各浓度标准溶液的过滤液5L注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰值面积，然后对浓度（Y）和吸收峰面积（X）进行一元线性回归，得到一元线性回

157、归方程。 实验实验5-5 5-5 阿维菌素的发酵阿维菌素的发酵 （3）效价的计算方法 将乙酸乙酯萃取所得的上清夜用0.45m的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液5l注入HPLC中，记录色普图，将B1峰面积代入上述的回归方程中，计算得到发酵液中B1组分发酵单位（g/mL）。4. 发酵液中菌体浓度的计算 取体积为V1（mL）的发酵液，3000r/m离心10min后，得到上清夜的体积计量为，V2（mL），那么发酵液的菌体浓度为：菌体浓度（V1V2）/ V1100%五、实验报告绘制标准曲线，并记录实验结果。返回 实验实验5-65-6 单细胞蛋白的生产单细胞蛋白的生产 一、实验目的 了解单细胞蛋白的生产原理和单

158、细胞蛋白的培养方法。二、实验原理 单细胞蛋白是通过培养单细胞微生物获得的菌体蛋白质。酵母菌、丝状真菌、微型藻类及非病源细菌等单细胞微生物均可用于生产单细胞蛋白，其中酵母菌是生产单细胞蛋白的主要单细胞微生物。多种原料可用于生产单细胞蛋白，如秸秆、薯干、石油、甲烷等，特别是一些工业废水、废渣可用来生产单细胞蛋白饲料，废物利用有利于环保。 实验实验5-65-6 单细胞蛋白的生产单细胞蛋白的生产 三、实验材料1.菌种 啤酒酵母。2.菌种活化培养基 黄豆芽 10g，100mL水，煮沸30min,过滤，滤液加5g蔗糖，加水至100mL。3.试剂 废水，琼脂，蔗糖，尿素，磷酸二氢钾。4.器材 接种环，无菌吸

159、管，电磁搅拌器，离心机，摇床，超净工作台，高压灭菌锅。 实验实验5-65-6 单细胞蛋白的生产单细胞蛋白的生产 四、实验方法1.菌种活化 用接种环将啤酒酵母菌种接入盛有35mL菌种活化培养基的三角瓶中，30摇床培养1719h。2.大量培养 量取废水加入锥形瓶中，加入0 .5%的尿素和磷酸二氢钾，调节pH6。用无菌吸管将活化的菌种0.51mL接入10mL上述废水溶液，30摇床培养24h。3.集单细胞蛋白 将培养后的啤酒酵母悬液在3000r/min条件下离心8min，所得沉淀在95105条件下烘干2h，即得产品。称重。五、实验报告 记录单细胞蛋白的产量。 返回 实验实验5-7 5-7 纤维素的分解

160、纤维素的分解 一、实验目的1. 了解能分解纤维素的微生物种类。2. 了解环境中纤维素分解菌的种类及其降解能力。二、实验原理 每年均有大量纤维素物质作为废弃物进入环境。纤维素的分解是自然界碳素转化的重要环节。分解纤维素的微生物种类甚多，本实验是主要培养并观察在中温有氧与缺氧条件下分解纤维素的微生物以及滤纸纤维素被分解的现象。 实验实验5-7 5-7 纤维素的分解纤维素的分解 三、实验材料1. 培养基 赫氏噬纤维菌基础培养基，厌氧性分解纤维素细菌培养液。（见附录III）2. 菌源 菜园土、河沟底泥或水稻土。3. 其他 液体石蜡，直径9cm的无菌圆形滤纸。四、实验方法1. 接种(1) 取无菌圆滤纸二

161、张，分别置于二个赫氏纤维菌基础培养基平板上，贴紧。(2) 取厌氧性分解纤维素细菌培养液二管。一管不接种，一管接入少许河底泥或水稻土。 实验实验5-7 5-7 纤维素的分解纤维素的分解 2. 培养 将上述培养皿置2830，培养710天；上述试管置3337，培养1015天。3. 观察(1) 滤纸被分解的情况：注意滤纸出现斑点或变薄，分解旺盛时可见到滤纸彻底溃烂状。 制片染色观察：土粒周围常长出深黄、金黄或黄绿色菌落，取带黄色粘液的纤维少许于载玻片上，加无菌水一滴，将纤维散开，干燥固定，用齐氏石炭酸复红染色。 实验实验5-7 5-7 纤维素的分解纤维素的分解 (2) 试管滤纸条上常可见灰色半透明或黄

162、色斑块的纤维溶解区，即为厌氧性分解纤维素细菌菌落，同上述制片染色。油镜下观察，常可见一种长杆菌，形成芽孢时，细胞末端膨大成鼓锤状，此即分解纤维素能力很强的奥氏梭菌。五、实验报告1. 描述(接种与不接种)培养皿及试管中滤纸的分解情况。2. 绘图并记录需氧及厌氧分解纤维的微生物的形态。 返回 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 一、实验目的1. 掌握微生物的驯育技术。2. 了解微生物对有机磷农药降解速率测定方法。二、实验原理对硝基酚在碱性条件下以盐的形式存在，在波长410nm处有强烈吸收峰，能够通过分光光度计定量检测。本实验是以对硝基酚的生成量为指标，测定微生物对该有

163、机磷农药的降解速率。 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 三、实验材料1. 菌种 sp. CTP01(可由中国科学院水生生物研究所提供)。2. 培养基 Burk无机盐培养液3. 试剂 5%对硫磷溶液，0.29%对硫磷溶液（对硫磷用丙酮配制），对硝基酚标准液(贮液)，对硝基酚工作液（见附录），14%NaOH溶液。4. 仪器 分光光度计，离心机，电动搅拌器，恒温水浴，通气泵，摇床等。5.其他 2000mL玻璃缸，250mL三角瓶，试管，吸管等。 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 四、实验方法1. 菌体的驯育与收集(1) 将Ps.CTP0

164、1的斜面菌种接入装有100mLBurk培养液的三角瓶中，加入0.01mL5%对硫磷溶液。置摇床上30培养5天。(2) 将培养5天的菌液全部接种于装有2000mL Burk培养液的玻璃缸中，加入0.5mL对硫磷溶液。在通气、搅拌条件下，30保温培养。(3) 细菌生长过程中，由于对硫磷被细菌利用，使培养液颜色变黄，待黄色消失，再补加lmL 5%对硫磷溶液。严格控制培养液的pH值，使其保持在7.5左右。 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 (4) 如果培养物生长迅速，可以观察到培养液的颜色变化很快，就必须适当增加对硫磷补加量，一次可加入对硫磷原油13滴。按(3)的步骤反

165、复补加与培养。直到培养液的混浊度在分光光度计波长500nm时，光密度达到0.2左右。(5) 离心收集菌体，转速为4000r/min，离心20分钟，收集菌体称其湿重，并重新悬浮于50mL新鲜Burk无机盐培养液中，定容至50mL，于4保存备用。 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 2. 对硫磷降解速率的测定(1) 取试管4支，分别加入l0mLBurk培养液及0.1mL0.29%对硫磷溶液，将试管于30恒温水浴上保温10分钟。(2) 将其中3支试管分别加入0.2mL菌液，另1支加0.2mLBurk培养液，在加入菌液的同时开始计算反应时间，反应20分钟。(3) 反应过程

166、中经常摇动试管。(4) 反应结束应立即在分光光度计波长410nm时读其光密度值。以未加菌液的试管为空白对照。(5) 结果取三个平行试验的平均值。 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 3. 对硝基酚：标准曲线的制备：将对硝基酚工作液稀释至8.3410-4、6.9510-4、5.5610-4、4.1710-4、2.7810-4、1.3910-4mg/L的浓度，注意凋节pH至7.5。以蒸馏水为对照，在分光光度针波长410nm时测各稀释液的光密度值(OD)。将测定结果绘制标准曲线，并求出曲线的斜率K。 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 4.

167、 对硫磷降解速率计算：反应液体积：培养液+底物量+菌液量菌体量：加入菌液的mL数换算成菌体的湿重 实验实验5-8 5-8 有机磷农药的生物降解有机磷农药的生物降解 五、实验报告 将本次测试结果填入表5-1中。 表5-1 测试结果 试管编号处理步骤1234Burk培养液（mL）0.29%对硫磷（mL）菌液量（mL）反应时间（min）OD410降解速率返回实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 一、实验目的1.观察活性污泥（或生物膜）的微生物种类及性状。2.测定污泥沉降比及活性污泥（或生物膜）中动物的数目。3.初步判断污水处理的运行状况是否正常。二、实

168、验原理 活性污泥中生物相较复杂，以细菌，原生动物为主。还有真菌、后生动物等。某些细菌能分泌胶粘物质形成菌胶团，进而组成污泥絮绒体（绒粒）。实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 三、实验材料1.活性污泥（或生物膜） 取自污水处理厂曝气池2. 其他 量简（100mL），载玻片，盖玻片，滴管，镊子，计数板等。3.仪器 显微镜 采用厚玻璃割成9cm长，4cm宽的长方形，玻璃厚度以0.30.4cm为宜。利用氢氟酸腐蚀法，使玻板中央刻上1010=100个小方格，小方格的大小没有严格规定，只要一片大号盖玻片能盖格子有余和便于在显微镜下计数就可以了。用大号盖玻片

169、切成宽约0.7cm的玻条，用阿拉伯树胶粘在计数用的小方格的四周，便呈一周凸起的边框。这样，就制成了一块微型动物计数板，如图5-4、图5-5。 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 图5-4 微型动物计数板 图5-5 微型动物计数板(侧视) 1-盖玻片 2-计数室 1-盖玻片；2-计数板；3-凸起的边框；4-稀释液 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 四、实验方法1. 测污泥沉降比（SV30） 肉眼观察，取曝气池的混合液置于100mL量筒内，直接观察活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能。2.

170、观察活性污泥生物相（1）制备水浸片 取活性污泥混合液12滴于载玻片上，加盖玻片制成水浸标本片。（2）低倍镜观察 观察生物相的全貌，要注意污泥结构松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及生长状况，观察微型动物的种类及活动状况。 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 污泥絮粒 污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒，与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。絮粒中网状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构；无开放空隙的称为封闭结构。絮粒中菌胶团细菌排列致密，絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒；边

171、缘界线不清的称为疏松的絮粒。实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 丝状微生物 活性污泥中的丝状菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素。当污泥中丝状菌占优势时，可从絮粒中向外伸展，阻碍了絮粒间的浓缩，使污泥SV30值和SVI值升高，造成活性污泥膨胀，根据污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例，可将丝状菌分成如下五个等级： 0级：污泥中几乎无丝状菌存在； 级：污泥中存在少量丝状菌； 级：存在中等数量的丝状菌，总量少于菌胶团细菌； 级：存在大量丝状菌，总量与菌胶团细菌大致相等； 级：污泥絮粒以丝状菌为骨架，数量超过菌胶团而占优势。 实验实验5-9 5-9 活性污

172、泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 （3）高倍镜或油镜观察 鉴别丝状微生物的种类，常见丝状微生物的形态特征如下： 球衣菌 由许多圆柱形细胞排列成链,外面包围一层衣鞘。 贝氏硫菌 具无色而宽度均匀的丝状体，与球衣菌不同的是外面无衣鞘，各丝状体分散不相连接，丝状体由圆柱形细胞紧密排列而成，有时可见硫粒。实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 发硫菌 由细胞排列成丝状体，具薄鞘，但一般镜检时不可见，其丝状体基部有吸盘，可使菌体固着于基质上生长。 霉菌 霉菌菌丝有隔膜和直分枝，而且较丝状细菌的丝状体粗。（4）鉴定动物种类 在高倍镜下画出

173、动物种类的形态草图，同时注意观察原生动物的形态特征和运动方式，如钟虫体是否存在食物泡，纤毛环的摆动情况。 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 3.动物的计数 步骤如下：（1）取活性污泥曝气池混合液盛于烧杯内，用玻棒轻轻搅匀，如混合液较浓，可稀释一倍后观察。（2）取洁净的滴管一支（滴管每滴水的体积应预先测定），一般可选用一滴水的体积为1/20mL的滴管，吸取搅匀的混合液，加一滴（1/20mL）到计数板的中央方格内，然后加上一块洁净的大号盖玻片，使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥

174、中菌胶团及生物相的观察 （3）用低倍镜进行计数，注意所滴加的液体不一定布满整个100格小方格，计数时，只要把充有污泥混合液的小方格挨着次序一行行计算即可，若是群体，则需将群体和群体上的个体分别计数。（4）计算，假定在稀释了一倍的一滴水样中测得钟虫50只，则每毫升活性污泥混合液中含钟虫数应为：50只202=2000只实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 五、实验报告1.将镜检和计数结果填入表5-2。2.绘出所见原生动物和微型后生动物形态图。3.试对污水厂活性污泥质量作出初步评价。注意事项注意事项： 如果用油镜观察，最好将污泥絮体制成染色片。 如无计

175、数板，则可用下法进行计数：a. 取洗净的滴管一支吸取混合均匀的曝气池混合液或已稀释的混合液，滴1滴在载玻片的中央，以盖玻片轻轻盖好水滴，要避免玻片内形成气泡。 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 b. 将标本放在显微镜低倍镜下计数。计数时，先将视野放在盖玻片的右上角（可根据各人的习惯放在另一角）然后移动玻片，视野即可随之从上而下，从右到左通过。c. 生物滤池和生物转盘上的生物膜形成胶状，浓度大，一般都须稀释后计数，其适当的稀释比可在实践中摸索。d. 上述计数方法仅适用于原生动物和轮虫，对个体较大的微型动物和线虫等，则须加大计数容量，以免造成误差

176、。 实验实验5-9 5-9 活性污泥中菌胶团及生物相的观察活性污泥中菌胶团及生物相的观察 表5-2 活性污泥的镜检和计数结果 絮体形态圆形、不规则形絮体结构开放；封闭絮体紧密度紧密；疏松丝状菌数量0；+；+；+游离细菌几乎不见；少；多优势种动物名称及状态描述其它动物种名称每滴稀释液中的动物数每毫升混合液中的动物数微生物实验技术微生物实验技术第六章第六章微生物控制技术微生物控制技术 微生物控制技术微生物控制技术微生物控制技术微生物控制技术 实验实验6-1 6-1 温度对微生物的影响温度对微生物的影响实验实验6-2 6-2 紫外线对微生物的影响紫外线对微生物的影响实验实验6-3 6-3 渗透压对微

177、生物的影响渗透压对微生物的影响实验实验6-46-4氢离子浓度对微生物生长的影响氢离子浓度对微生物生长的影响实验实验6-5 6-5 化学药剂对微生物的影响化学药剂对微生物的影响 实验实验6-1 6-1 温度对微生物的影响温度对微生物的影响一、实验目的1.了解温度对不同类型微生物生长的影响；2.学习测定微生物最适生长温度的方法。二、实验原理 温度能影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢，每种微生物都有它的生长温度范围，每种微生物只能在一定的温度范围内生长，低温微生物最高生长温度不超过20，中温微生物的最高生长温度低于45，而高温微生物能在45以上的温度条件下正常生长。 实验实验6-1 6-1 温度对微生

178、物的影响温度对微生物的影响三、实验材料1.菌种 培养24小时的枯草杆菌和大肠杆菌，培养了72小时的黑曲霉或青霉。2.培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面，马铃薯葡萄糖培养基斜面。3.器材 酒精灯，接种针，冰箱，恒温箱。四、实验方法1.接菌按无菌操作方法进行（1）在5支牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上都接种上枯草杆菌，接种时划直线或曲线。 实验实验6-1 6-1 温度对微生物的影响温度对微生物的影响（2）在另5支牛肉膏蛋白胨琼脂斜面上都接种上大肠杆菌，接种时划直线或曲线。（3）在5支马铃薯葡萄糖培养基斜面上接种曲霉或青霉，接种时用点接法。2.培养与观察（1）培养将上述接种好的菌种，分别放入0、15、30、37、

179、50五种温度下培养。（2）观察48小时后观察，记录实验结果。五、实验报告记载实验结果，填入表6-1。 实验实验6-1 6-1 温度对微生物的影响温度对微生物的影响表6-1 不同类型微生物在不同温度条件下培养的生长情况 菌种015303750枯草杆菌大肠杆菌黑曲霉/青霉注：用“”表示不生长，“+”表示生长一般，“+ +”表示生长良好。返回 实验实验6-2 6-2 紫外线对微生物的影响紫外线对微生物的影响 一、实验目的1.了解紫外线的杀菌作用原理；2.学习紫外线杀菌试验方法。二、实验原理 紫外线对微生物有强烈的致死作用，波长260nm的紫外线杀菌力最强。其杀菌机制是短波的紫外线引起细胞核酸变性导致

180、微生物死亡。微生物对紫外线的吸收与剂量有关，剂量高低取决于紫外灯的功率、照射距离与照射时间。在本试验中采用15W紫外灯在距灯30cm处通过改变照射时间来处理微生物。紫外线虽有较强的杀菌力，但其穿透力很弱，普通玻璃、薄纸、水层等均能阻止其透过。 实验实验6-2 6-2 紫外线对微生物的影响紫外线对微生物的影响 三、实验材料1.菌种 培养2448h的金黄色葡萄球菌，黏质沙雷氏菌。2.培养基 牛肉膏蛋白胨培养基。3.器材 无菌水，无菌平皿，1mL无菌吸管，玻璃刮铲、灭菌五角星形图案纸(牛皮纸或黑纸)，紫外灯箱。四、实验方法1.制平板 取无菌平皿6套，将已熔化并冷却至50左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按

181、无菌操作法倒入平皿中，使其冷凝成平板。 实验实验6-2 6-2 紫外线对微生物的影响紫外线对微生物的影响 2.菌悬液制备 取试管无菌水2支，以无菌操作法分别取金黄色葡萄球菌和黏质沙雷氏菌各2环，接入无菌水中充分摇匀，制成菌悬液。3.接种 将已倒入培养基的平皿分为2组，每组3个，一组接金黄色葡萄球菌，一组接沙雷氏菌，用无菌吸管吸取已制好的菌悬液各0.1mL，分别接种于二组平板上，用无菌玻璃刮铲均匀涂布，随即用无菌镊子夹取无菌图案纸一张，小心放在接种好的平皿中央(图6-1)。 实验实验6-2 6-2 紫外线对微生物的影响紫外线对微生物的影响 图6-1 检查紫外线对微生物生长的影响试验方法 1.图案

182、纸 2.细菌生长圈 3.无菌生长区 实验实验6-2 6-2 紫外线对微生物的影响紫外线对微生物的影响 4.分组 将接种的六个平皿分为三组，每组一个金黄色葡萄球菌，一个黏质沙雷氏菌。5.紫外线处理 将紫外灯先开灯预热23min。再将上述平皿置于紫外灯下，打开皿盖，在30cm距离处照射。一组照1min，1组照5min，l组照l0min，小心地取下图案纸，盖上皿盖。用黑布或厚纸遮盖，送入培养室内。6.培养 将平皿于2830温度下培养48h。五、实验报告 取出平皿观察分析平板上细菌生长的状况，并绘图表示。返回 实验实验6-3 6-3 渗透压对微生物的影响渗透压对微生物的影响 一、实验目的了解渗透压对微

183、生物生长的影响。二、实验原理 在等渗溶液中，微生物正常生长繁殖；在高渗溶液中，细胞失水收缩，而水分为微生物生理生化反应所必需，失水会抑制其生长繁殖；在低渗溶液中，细胞吸水膨胀，大多数微生物具有较为坚韧的细胞壁，而且个体较小，因而在低渗溶液中一般不会像无细胞壁的细胞那样容易发生裂解，具有细胞壁的微生物受低渗透压的影响不大。 实验实验6-3 6-3 渗透压对微生物的影响渗透压对微生物的影响 三、实验材料1.菌种 金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，盐沼盐杆菌。2.培养基 分别含0.85、5、10、15及25NaCl的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。3.仪器或 无菌平皿，接种环等。四、实验方法1.将含不同浓度NaCl

184、的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化、倒平板。2.在已凝固的平板皿底用记号笔划成三部分，分别标记上述三种菌名。 实验实验6-3 6-3 渗透压对微生物的影响渗透压对微生物的影响 3.将上述平板置于28温室中，4 d后观察并记录含不同浓度NaCl的平板上三种菌的生长状况。五、实验报告1.结果分析将实验结果填入表6-2。 2.举例几个在日常生活中人们利用渗透压来抑制微生物生长的例子。 实验实验6-3 6-3 渗透压对微生物的影响渗透压对微生物的影响 表6-2 不同类型微生物在不同NaCl浓度中的生长情况 菌名NaCl浓度%0.855101525金黄色葡萄球菌大肠杆菌盐沼盐杆菌注：用“”表示不生长，“+”表

185、示生长一般，“”表示生长良好。返回 实验实验6-46-4氢离子浓度对微生物生长的影响氢离子浓度对微生物生长的影响 一、实验目的1.了解氢离子浓度对微生物生长发育的影响。2. 学习测定微生物生长最适pH的方法二、实验原理 微生物生长繁殖需要一定的酸碱度即pH环境，H浓度影响微生物对营养物质的吸收和生化反应。一般细菌适于中性环境，放线菌适于偏碱性环境，酵母菌和霉菌则适于在微酸性环境中生长，若超出其适应的范围，微生物生长将受到抑制或不能生长。 实验实验6-46-4氢离子浓度对微生物生长的影响氢离子浓度对微生物生长的影响 三、实验材料1. 菌种 培养24h大肠杆菌斜面菌种，培养5d的吸水链霉菌5102

186、斜面菌种，培养3d的黑曲霉斜面菌种。2.培养基和试剂 牛肉膏蛋白胨培养液，4.14% K2HP04，1.22%硼酸，0.8% NaOH，1.92%柠檬酸，见附录。3.其他材料 无菌水，无菌吸管(1mL)，接种环。 实验实验6-46-4氢离子浓度对微生物生长的影响氢离子浓度对微生物生长的影响 四、实验方法1.培养基制备 分组按表6-3配方配制不同pH的培养基，并用pH计校正pH，然后分装入试管中，每管装量56mL，0.1Mpa灭菌30min备用。 2.接种培养 取pH不同的培养基三组用接种环按无菌操作法于试管中分别接入大肠杆菌、吸水链霉菌、黑曲霉，在37下培养48h。3.检查结果 取出培养物，观

187、察并记录实验结果。 实验实验6-46-4氢离子浓度对微生物生长的影响氢离子浓度对微生物生长的影响 表6-3 不同pH培养基配制表 试管序号K2HP04(mL)柠檬酸(mL)NaOH(mL)硼酸(mL)牛肉膏蛋白胨培养液(mL)总量(mL)PH(近似值)10.31.78102.820.91.18104.431.10.98105.241.30.78106.051.50.58106.861.90.18107.670.31.78108.480.71.38109.291.01.081010.0 实验实验6-46-4氢离子浓度对微生物生长的影响氢离子浓度对微生物生长的影响 表6-4 不同类型微生物在不同p

188、H中的生长情况 pH2.84.45.26.06.87.68.49.210吸水链霉素黑曲霉大肠杆菌注：用“”表示不生长，“+”表示生长一般，“”表示生长良好。五、实验报告 将实验结果填入表6-4中。 返回 实验实验6-5 6-5 化学药剂对微生物的影响化学药剂对微生物的影响 一、实验目的 了解化学药剂的杀菌和消毒作用，掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。二、实验原理 一些化学药剂对微生物的生长有抑制或杀死作用。因此，在实验室内和生产上常利用某些化学药剂进行杀菌或消毒。不同的药剂或同一药剂对不同微生物的杀菌能力不同。此外，药剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不一样。使用前需进行试验，灵活选择。

189、实验实验6-5 6-5 化学药剂对微生物的影响化学药剂对微生物的影响 三、实验材料1.菌种 培养2448h的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌斜面菌种。2.培养基和试剂 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，1g/L HgCl2，200g/L链霉素，200g/L青霉素，50g/L石炭酸。3.器材 无菌平皿，无菌水，无菌吸管(1mL)，直径0.6cm的无菌圆形滤纸片。 实验实验6-5 6-5 化学药剂对微生物的影响化学药剂对微生物的影响 四、实验方法1.制平板：取无菌平皿三套，将已熔化并冷却至50左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。2.制备菌悬液：取无菌水3支，用接种环分别取大肠

190、杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌各12环接入无菌水中，充分混匀，制成菌悬液。3.接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1 mL接种于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。注意做好标记。4.浸药：将灭菌滤纸片分别浸入四种供试药剂中。 实验实验6-5 6-5 化学药剂对微生物的影响化学药剂对微生物的影响 5.加药剂：用无菌镊子夹取浸药滤纸片(注意把药液沥干)，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染(图6-2)。并在平皿背面做好标记。 6.培养：将平皿置于28下培养4872h后观察结果。 图6-2 药剂抑制实验 1.滤纸片 2.抑菌圈 实验实验6-5 6-5 化学药剂对微生物的影响化学药剂对微生物

191、的影响 五、实验报告 取出培养平皿，观察滤纸片周围有无抑菌圈产生，并测量抑菌圈的大小，将测量结果填入表6-5中。 表6-5 不同化学药剂对细菌的抑制效果（抑菌圈直径cm） HgCl2(1g/L) 链霉素（200） 青霉素（200细菌 消毒剂 ）石碳酸(50g/L)大肠杆菌 金黄色葡萄球菌枯草杆菌微生物实验技术微生物实验技术第七章第七章微生物检验技术微生物检验技术 微微微微 生生生生 物物物物 检检检检 验验验验 技技技技 术术术术 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定实验实验7-2 7-2 食品中大肠菌群测定食品中大肠菌群测定实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品

192、中霉菌计数法实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定一、实验目的 了解食品中细菌的检测方法。二、实验原理 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定三、实验材料1.器材 恒温培养箱，冰箱，天平，电炉，恒温水浴锅，培养皿，lmL和l0mL吸管，500mL三角瓶，玻

193、璃珠，培养皿，试管，酒精灯，试管架，灭菌刀或剪刀，灭菌镊子，酒精棉球。2.用品 市售饮料，牛肉膏蛋白胨培养基，75乙醇，生理盐水或其它稀释液定量分装于三角瓶和试管内灭菌。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定四、实验方法 菌落总数的检验程序见图7-1所示。(一)检样稀释及培养1.以无菌操作，将饮料检样25mL放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成110的均匀稀释液（如为固体检样最好用均质器，以800010000r/min的速度处理1分钟，作成110的均匀稀释液）。2.用lmL灭菌吸管吸取110稀释液lmL，

194、沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，作成1100的稀释液。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定图7-1 菌落总数检验程序 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定3.另取lmL灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管，直至稀释到所需浓度。4.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释度分别用吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌皿内，每个稀释度作两个平皿。5.稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂培养基(可放置46水浴保温)注入平皿约15

195、mL，并转动平皿混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌水(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。6.待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养242小时。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定(二)菌落计数方法 作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。(三)菌落计数的报告1.平板菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若

196、片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定 2.稀释度的选择(1)应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例1)。(2)若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比如何来决定，若比值小于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字(见表7-1中例2及例3)。(3)若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例4)。(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的

197、平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例5)。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定(5)若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表7-1中例6)。(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例7)。 3.菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示(见表7-1中“报告方式”栏)。 五、实验报告 用器皿图解的

198、形式列出食品中菌落总数检验程序图。 实验实验7-1 7-1 食品中细菌总数测定食品中细菌总数测定表7-1 稀释度选择及菌落式报告方式 例次稀释液与菌落数两稀释液之比菌落总数(个/g个/mL)报告方式(个/g或个/mL)10-110-210-31多不可计164201640016000或1.61042多不可计295461.63775038000或3.81043多不可计271602.22710027000或2.71044多不可计多不可计31331300310000或3.1105527115270270或2.71026000110107多不可计305123050031000或3.1104返回 实验实验

199、7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 一、实验目的 了解食品中大肠菌群的检测方法二、实验原理 大肠菌群系指一群在37、24小时能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群主要来自人或温血动物粪便，食品中检出大肠菌群则说明食品受到了人或动物粪便的污染，大肠菌群数量越多则表明粪便污染越严重，由此推测该食品存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁。 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 三、实验材料1.器材 温箱，天平，显微镜，平皿，试管，吸管，载玻片，接种环。2.培养基和试剂 乳糖胆盐发酵管，伊红美兰

200、琼脂，乳糖发酵管，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%酒精，番红染液。四、实验方法 大肠菌群检验程序见图7-2所示。 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 图7-2 大肠菌群检验程序 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 1.检样稀释(1)以无菌操作将饮料检样25mL放于含有225mL无菌生理盐水或其它稀释液的三角瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成110的均匀稀释液。(2)用lmL灭菌吸管吸取110稀释液lmL注入含有9m L灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1100的稀释液。(3)另取lmL灭菌

201、吸管，按上项操作，依次作10倍递增稀释，每递增一次，换1支lmL灭菌吸管。(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度每个稀释度接种3管。 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 2.乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；lmL及lmL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361温箱内培养242小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告为大肠菌群阴性，如有产气者则按下列程序进行。3.分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美兰琼脂平板上，置361温箱内培养1824小时，然后取出，

202、观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 4.证实试验 在上述平板上挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。五、实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL大肠菌群的最可能数。 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 表7-2 大肠菌群MPN检索表接种水样总量11.11mL(10、1、0.1、0.01mL各1份)接 种 水 样 量/mL

203、每升水样中大肠菌群数1010.10.0123800 实验实验7-2 7-2 饮料食品中大肠菌群测定饮料食品中大肠菌群测定 其中:“”发酵阳性；“”发酵阴性。本表采用3个稀释度1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)，每稀释度3管。表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时，表内数字应相应降低10倍1如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。返回 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 一、实验目的1.了解霍华德(H。ward)霉菌计测装置。2.初步掌握番茄酱的霉菌计测方法。二

204、、实验原理 各种加工的水果和蔬菜制品在适宜条件下霉菌不仅能生长，还能繁殖。以番茄制品为例，在加工中若原料处理不当，产品中就会有霉菌残留。因此，利用霍华德霉菌计数法，可通过在一个标准计数玻片上计数含有霉菌菌丝的显微视野，知道番茄酱中霉菌残留的多少，对番茄制品质量的评定，具有一定参考价值。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 三、实验材料1. 样品 番茄酱。2.器材 计测装置，显微镜，折光仪或糖度计，烧杯，量筒，托盘天平等；计测装置(包括载玻片、盖玻片、测微计)结构如图7-3至图7-5所示。 四、实验方法 检验程序:取样称样稀释调节视野涂片观察记录计算。 实验实验7-3 7-

205、3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 图7-3 载玻片正视图 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 图7-4 载玻片侧视图 图7-5 测微器（配片） 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 1.取样 抽样数量按每班成品5t以下取样1罐，产量每增加5t，取样量增加1罐。2.检样制备 番茄汁和调味番茄酱可直接取样；番茄酱或番茄糊需加水稀释为固形物含量相当于20下折光指数为1.344 71.3460的标准样液。（1）称样 用小烧杯在托盘天平上称取10g(约28.5)番茄酱。（2）稀释 向小烧杯中加入26 mL蒸馏水，用玻棒搅拌均匀，即为折光指数1.344 71.

206、3460的标准样液。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 3.标准视野的调节 霍德华霉菌计测用的显微镜，要求物镜放大倍数为90125倍，其视野直径的实际长度为1.382mm，则该视野为标准视野。 检查标准视野：将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382 mm的两条平行线与视野相切；配片(测微器)的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件，其中有一条不符合，需经校正后再使用。如图7-6所示。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 图7-6 标准视野状态下两条标准平行线、配片大方格与视野外切的

207、相互位置 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 4.涂片（1）检查玻片 首先用擦镜纸或绸布沾酒精将载玻片和盖玻片擦净。（2）加样 用滴管或玻棒取一大滴混合均匀的样液，均匀地涂布于载玻片中央的平坦面上，盖上盖玻片(盖玻片可直接盖上去，也可以从突肩边沿处吻合切入)。如果发现样液涂布不均匀，有气泡，或样液流人沟内、从盖玻片与突肩处流出等，应弃去不用，重新制作。 涂好的制片，在计测室内，每个标准视野的样液体积为： 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 5. 观察记录（1）观察视野数及分布 对一般样品，每个涂片均检查50个视野(每1个样品至少应测25个视野，才能代

208、表样品的各个部分。如果检查结果阳性视野低于30，则检查25个视野即可；如果在3040之间，须检查50个视野；如果在4050之间，须检查100个视野；如果在50以上或超过更多，则要继续检查，直至检查25个视野的结果与一系列计算结果无差异为止)。所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上(图7-7)，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下，或从左到右一行行有规律地进行观察。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 图7-7 计测室上50个视野的分布 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 （2）霉菌菌丝的鉴别 霉菌菌丝往往与番茄组织难以区别，但能够很有

209、把握地加以区别。在同一视野内霉菌菌丝的特征是： 霉菌菌丝一般粗细均匀。 霉菌菌丝体内含有颗粒，具有一定的透明度。 有的霉菌菌丝有横隔。 有的霉菌菌丝有分支。而番茄组织的细胞壁大多呈环状，粗细不均匀，细胞壁较厚，且透明度不一致。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 （3）记录结果 阳性视野与阴性视野的判断：在标准视野下，上下调节焦距发现有霉菌菌丝，其长度超过标准视野直径(1.382mm)的1/6(即一个小方格的边长)或3根菌丝总长度超过标准视野直径的1/6，这个视野称为阳性视野，否则称为阴性视野。有时在标准视野中出现极细的菌丝丛或小菌落，则以其直径来计算，超过视野直径1/6

210、为阳性视野，否则为阴性视野。阳性视野用“+”表示；阴性视野用“”表示。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 对初次学习霍德华霉菌计测法者，做记录前，先在记录纸上划出计测室上50个视野均匀分布的小格，观察一个标准视野，立即在相应的方格内作“+”或“”的记录，或“”以空格表示(如图7-8)。这种记录方法，在计测过程中，可减少重复或遗漏计数的现象，也可以从记录表格上“+”、“”视野的分布，了解涂片是否均匀。如果一个样品做2个片子，观察结果误差较大(超过6)，则应另取样涂片，观察测定至误差6时为止。 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 图7-8 观察结果记录

211、示意图 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 五、实验结果1. 计算 霍德华霉菌计测数值，又称霉菌数，用百分比表示。其含义如下： 将0.15mm3标准样液，均匀地摊布成厚0.1mm，直径为1.382 mm，其面积为1.5mm3的标准视野，在显微镜下检查。按100个视野数计算，其中发现有霉菌菌丝存在的视野数(即阳性视野数)。 根据霉菌数含义，其计算公式如下： 举例如图7-8：记录的阳性视野数，片1为15，片2为16，则样品的霉菌数为： 实验实验7-3 7-3 食品中霉菌计数法食品中霉菌计数法 部颁(卫生部)标准为阳性视野不超过40，在国际贸易中，合同上无要求时按部颁标准执行，

212、合同上有要求时按合同执行；每抽取1罐样品制2个片子，每片观察50个视野，如果超过标准指标，应该继续制片，但片子数量不得少于3片即150个视野，如果计测结果相近时，可取其平均值；如对抽样结果有异议，应加倍抽样；全部合格，作为合格处理，其中有1罐不合格，该批作为不合格处理。2. 报告 做好计测记录，按记录计算计测结果并写出报告。返回 实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 一、实验目的1.了解金黄色葡萄球菌检验原理；2.掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法。二、实验原理 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固。多数金黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板

213、菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 三、实验材料1.样品 奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。2.菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。3. 培养基与试剂 7.5%氯化钠肉汤，血琼脂平板，Balrd-Parker氏培养基，无菌盐水，兔血浆，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%酒精，番红染液。4.器材 显微镜，温箱，离心机，无菌吸管，无菌试管，无菌平皿，均质器，载玻片，L型涂布棒，酒精灯，接种环等。 实验实验

214、7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 四、实验方法 检验程序见图7-9。 1.一般培养 称取25g 固体样品，加入225 mL无菌生理盐水，制成混悬液（液体样品可不稀释）。吸取5mL 上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。同时将对照菌种在上述两种平板上做划线分离接种。置（361） 温箱培养24h。 实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 图7-9 金黄色葡萄球菌检验程序 实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验

215、 2.分纯培养 将上述血平板和Balrd-Parker 平板上挑取可疑菌落，先观察对照的菌落特征，再观察被检样品的菌落，并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。若无菌落生长，也可用增菌培养物在上述平板上划线分离，在（361） 温箱培养24h 后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。 实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 3.形态特征 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄状，无芽抱，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径为0.51m 。在肉汤中呈混浊生长，血平板菌落呈金黄色，也有时呈白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在B

216、aird -Parker 平板上为圆形，光滑凸起，湿润，直径23 mm ，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。 实验实验7-4 7-4 食品中金黄色葡萄球菌检验食品中金黄色葡萄球菌检验 4. 血浆凝固酶试验 挑取上述可疑菌落菌种于肉浸液肉汤，同时将金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌分别接种于肉浸液肉汤，在（361） 温箱培养24h 后进行血浆凝固酶试验。 吸取14 新鲜兔血浆0.5 mL，放人小试管中，再加人培养24h 的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养基0.5 mL，振荡摇匀，放在36 温箱或水浴内，每0.5h 观察1次，观察6h ，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为是阳性结果，同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 五、实验报告 根据形态特征，血平板情况以及血浆凝固酶试验，判别检样有否金黄色葡萄球菌。