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1、全内反射全内反射荧光成像荧光成像基本基本原理原理 Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)(TIRF)全内反射荧光显微镜全内反射荧光显微镜(TIRFM)(TIRFM) 目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描探针显微技术（SPM）和光学技术。其中： SPM原子力显微技术（AFM）扫描离子电导显微技术（ SICM）扫描隧道显微技术（ STM）光学技术光学技术光学显微镜光学显微镜成像成像光学操纵共聚焦荧光显微技术（LSCM）扫描近场光学显微技术（SNOM）全内反射荧光全内反射荧光显微技术显微技术（TIRFM） 上世纪80 年代，Axelrod
2、 等生物物理学家对 TIRFM 技术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。发展历程发展历程发展历程发展历程Axelrod,Julius阿克塞尔罗德（Axelrod,Julius) 美国生物化学家及药理学家。 1970年他与卡茨冯奥伊勒共享了诺贝尔生理学和医学奖。于美国卫生研究院度过其大部职业生涯。他研究药物及激素的作用、神经冲动传播的化学方面，并特别研究松果体的功能。光光光光反射和折射示意图反射和折射示意图反射和折射示意图反射和折射示意图全内反射示意图全内反射示意图全内反射示意图全内反射示意图12n1n2RefractedTIRn1 n2光的反射和折射光的反射和折射光的反射和折射光的
3、反射和折射Snell定律：定律： 当入射角不断增大，透射角为增大 90时，入射角达到临界角 c。依据 Snell 定律得出： 当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发生了全内反射。90n1n2TIR 实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一部分透过的能量场则称之为“隐失波隐失波” 或或“隐失场隐失场”。隐失波隐失波隐失波隐失波90n1n2TIR隐失波隐失波 隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减： 其中：Z是离开分界面的距离，I(z)表示距离界面Z处的强度；I(0)表示临界面处的强度。 由于隐失波仅在
4、界面上极薄的一层极薄的一层范围内传播，所以利用隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约大约 100nm 内的荧光团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了显微成像的对比度和信噪比。 d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的距离。 隐失波的渗透深度d12是入射角及相对折射率的函数。 d12是渗透深度,它等于从分界面处到光强衰减到分界面处数值l/ e的处的距离。对于可见光波长而言，浸透深度约为100 nm。隐失隐失隐失隐失波波波波强度成指数衰减曲线强度成指数衰减曲线强度成指数衰减曲线强度成指数衰减曲线 隐失波存在的实验证明隐失波存在的实验证明隐失波存在的实验证明隐失波存在
5、的实验证明 两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒质)。 如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射波,这透射波进人第二块棱镜。光学隧道效应光学隧道效应光学隧道效应光学隧道效应 光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。当光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波不仅穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的电子作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生了显著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学隧道效应的产生。全内反射荧光显微技术，是利用光发生全全内反射内反射时产生的隐失波隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。 与传统的荧光显微镜相比，
6、使显微成像在Z轴上的空间分辨率分辨率得到了显著改善，大大提高了图像的信噪比和对信噪比和对比度比度。全内反射全内反射全内反射全内反射荧光显微荧光显微荧光显微荧光显微成像系统成像系统成像系统成像系统分子荧光的产生分子荧光的产生 当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的：吸吸收收hv放放热热H放放热热H* *荧荧光光hvS2S0S1放出热量放出热量H*激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。荧光：荧光：1010-7-7-10-10-9-9s s磷光：磷光：1010-4-4-100s-100s分子荧光的产
7、生分子荧光的产生电子跃迁的单重电子跃迁的单重电子跃迁的单重电子跃迁的单重态态态态（单线态）单线态）单线态）单线态）与与与与三重态三重态三重态三重态（三线态）三线态）三线态）三线态） 在在光光致致激激发发和和去去激激发发光光的的过过程程中中，分分子子中中的的价价电电子子（n, ）处于不同的自旋状态，通常用多重态）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：来描述： M2S11 电电子子自自旋旋的的大大小小用用自自旋旋量量子子数数S表表示示，S可可为为+1/2或或1/2，这这里里的的正正负负号号取取决决于于自自旋旋的的方方向向。基基态态中中每每个个能能级级通通常常被被两两个个自自旋旋相相反反的的即即
8、自自旋旋配配对对的的电电子子占占据据，M=1，成为单重态。成为单重态。 当当成成对对电电子子中中的的一一个个被被激激发发到到S1、S2等等电电子子能能级级激激发发态态时时，其其自自旋旋不不变变，即即仍仍和和处处于于基基态态的的另另一一电电子子成成对对。这这些些能能态态都都被被称称为为单单线线态态或或单单重重态态(singlet state)。 但但如如果果处处于于第第一一电电子子激激发发态态最最低低振振动动能能级级的的电电子子通通 过过 无无 辐辐 射射 跃跃 迁迁 （ 系系 间间 跨跨 越越 ， intersystem intersystem crossing)crossing)改改变变自自
9、旋旋方方向向，则则因因消消耗耗部部分分能能量量而而降降至至另另一一种种激激发发态态：S S1/21/21/21/21 1，多多重重度度 M M2S2S1 12 2 1 11 13 3，这这种种电电子子激激发发态态称称为为三三重重态态(triplet (triplet state)state)。 * * * *能能量量S0单重基态单重基态S1单重激发态单重激发态T1三三重激发态重激发态分子荧光的产生分子荧光的产生（雅布隆斯基分子能级图） 荧光发射：荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特
10、征波长比入射波长要长。 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：10-910-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射，荧光马上会消失。 磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（10-410s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。分子荧光的产生分子荧光的产生 目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类型：棱镜型和物镜棱镜型和物镜型型(或无棱镜型)。棱镜型全内反射全内反射全内反射全内反射荧光显微镜结构荧光显微镜结构荧光显微镜结构荧光显微镜结构全内反射全内反射全内反射全内反射荧光显微镜结构荧光显微镜结构荧光显微镜结构荧光显微镜结构 物镜型使用高数值孔径(NA14)的物镜作为荧光信号的接受器，同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并且可与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等。 该系统的关键是高数值孔径物镜的使用。由于细胞的典型折射率为133138，因此要实现全内反射，物镜的NA必须大于138，表达式为：NA=nsinnsin nsinc 其中，NA为物镜的数值孔径 ，n， 分别为物镜的折射率(浸没油)和孔径角。c为发生全内反射时的临界角。物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且容易校准光束。物镜型全内反射荧光显微镜示意图物镜型全内反射荧光显微镜示意图物镜型全内反射荧光显微镜示意图物镜型全内反射荧光显微镜示意图
