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1、专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题2 2多聚酶链式反应多聚酶链式反应扩增扩增DNADNA片断片断.DNA.DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位: :一一. .基础知识基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团上的上的上的上的“O
2、HOHOHOH”和和和和另一个核另一个核另一个核另一个核苷酸分子的第苷酸分子的第苷酸分子的第苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的羟基上的羟基上的羟基上的羟基之间失去一分子之间失去一分子之间失去一分子之间失去一分子水，形成水，形成水，形成水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，即即即即在在在在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3 3 3 3和和和和5 5 5 5碳原子碳原子碳原子碳原子之间形之间形之间形之间形成磷酸二酯键。数量庞大成磷酸二酯键。数量庞大成磷酸二酯键。数量庞大成磷酸二酯键。数量庞大的四种
3、脱氧核苷酸通过的四种脱氧核苷酸通过的四种脱氧核苷酸通过的四种脱氧核苷酸通过3 3 3 3、5 5 5 5、磷酸二酯键彼、磷酸二酯键彼、磷酸二酯键彼、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷此连接起来形成脱氧核苷此连接起来形成脱氧核苷此连接起来形成脱氧核苷酸链。酸链。酸链。酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNADNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OHOHOHOH”末端称为末端称为末端称为末端称为3 3 3 3端，端，端，端，而磷酸基团的末端称为而磷酸基团的末端称为而磷酸基团的末端称为而磷酸基团的末端称为5 5 5 5端。端。端。端。3.3.多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链多
4、脱氧核苷酸链结构简图结构简图OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基5335碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图4.4.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的（即一条的（即一条链为链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱氧）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。. 与与 交替连结，排列在外侧，交替连结，排列在外侧，
5、构成基本骨架；构成基本骨架； 排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来，形连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与腺嘌呤一定与 配对，配对， 一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤.DNA.DNA的复制的复制2.2.时期时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。3.3.场所场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。1.1.概念概念由一个
6、由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程。的过程。4.4.基本条件基本条件酶酶: :解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶能量能量:ATP:ATP原料原料: :四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链.边解旋边复制边解旋边复制( (过程）过程）5.5.复制特点复制特点.半保留复制（结果）半保留复制（结果）6.6.遵循原则：遵循原则：碱基互补配对原则碱基互补配对原则7.7.精确复制的原因精确复制的原因8.8.复制的意义复制的意义DNADNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的
7、连续性代，从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结：胞内总结：胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNADNADN
8、A双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3 3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸（三）（三） PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）1 1、 DNADNA聚合酶聚合酶特性特性 不不能从头合成能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的3
9、3端开端开始延伸始延伸DNADNA链，因此，链，因此， DNADNA复制需要引复制需要引物物. .2 2、 DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程 当当引物与引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合母链通过碱基互补配对结合后，后， DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链， DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端端向向33端延端延伸伸. .3 3、 PCRPCR原理原理在在8080100100C C的温度范围内，的温度范围内， DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性构将解体，双链分开，这
10、个过程称为变性当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链又链又会重新结合成双链会重新结合成双链 PCR PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器质上也是一台能够自动调控温度的仪器 高高温解决了打开双链的问题，但是，又温解决了打开双链的问题，但是，又导致导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的Taq Taq DNADNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNA
11、聚合酶失活的聚合酶失活的问题，促成了问题，促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。4 4、 Taq DNATaq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、 缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质 DNADNA模板，分别与两条模板链相结合的两种模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚合酶，同聚合酶，同时通过控制温度使时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复进行。复制在体外反复进行。 PCR PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合，而是人工合成的成的DNADNA单链，其长度通
12、常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核个脱氧核苷酸苷酸6 6、细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的过对反应温度的控制来实现的7 7.PCR.PCR的重要应用：的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。1 1、PCRPCR仪仪. .设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。二二.PCR.PCR的实验操作
13、的实验操作2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。上的一次性吸液枪头用一次更换一次。1.1.准备准备2.2.移液移液. .实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子
14、，用手混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。指轻轻弹击管壁。3.3.混合混合过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心约离心约10s10s。4.4.离心离心离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。高反应效果。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环程序。仪的循环程序。5.5.反应反应循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94949494，10min10min10min10min30303030次次次次949
15、49494，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次94949494，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min PCR PCR一般经历三十多次循环，每次循环可一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤以分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸. .变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋） 模模板板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，以上。一定时间后，使模板
16、使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。轮反应作准备。.复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左左右，引物与模板右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合。单链的互补序列配对结合。.延伸延伸 DNA DNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补
17、配对的原则与半保留复制的原理，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的合成一条新的DNADNA链。链。靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步：高温变性循环第一步：高温变性靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 53 3 3 35
18、5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个PCRPCR循环完成后循环完成后 ：得到两个靶序列：得到两个靶序列循环循环次数次数DNADNA数量数量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量 PCR PCR 循
19、环的结果循环的结果 DNA DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的之间的DNADNA序列，使这段固定长度的序列呈指序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增数扩增从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物为模板参与反应，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸的延伸PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污等因素的污染而造成干扰实验，染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意
20、做到：6 6、注意事项、注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头理论上理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三三. .课题成果评价课题成果评价1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2n n2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a a2 2n n实验中实验中DNADNA含量的测定含量的测定1.1.原理原理可以通过计算可以通过计算
21、DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与收峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关。的含量有关。2.2.过程过程.稀释稀释2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即蒸馏水，即将样品进行将样品进行5050倍稀释倍稀释. .对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的读数调节至零。紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比
22、色杯中，测定260nm260nm处处的光吸收值的光吸收值.计算计算.计算计算DNADNA含量含量( ( g g) )5050(260nm(260nm的读数的读数) )稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g /ml /ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的吸比色杯中的吸光值为光值为0.020.02光光吸吸收收波长波长nmnm2602602402402202202802800.10.10.20.2四、四、 课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷
23、贝）PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。增技术。 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、 快快速、速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点简便、重复性好、易自动化等突出特点五、实验小结五、实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（ ）变变性性, , 复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（ ）, ,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温( ( ),),在在（ ）的的作作用用下下, ,以以 （ ）为为原原料料, ,以以（ ）为为复复制制的的起起点点, ,合合成成新新链链。 如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度, ,经经（ ）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环, ,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍, ,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环, ,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍; ; 将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳, ,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色, ,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能能见到扩增特异区段的见到扩增特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272
