细菌感染实验室诊断

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1、第三章第三章 细菌感染的病原学诊断细菌感染的病原学诊断第一节第一节 标本的采集和处理原则标本的采集和处理原则一、标本采集的一般原则一、标本采集的一般原则1.早期采集早期采集2.无菌采集无菌采集 n无菌部位无菌部位:严格无菌操作严格无菌操作n有正常菌群部位：明确目的菌；选择合适的有正常菌群部位：明确目的菌；选择合适的选择培养基选择培养基3.采用不同方法采集采用不同方法采集n需氧菌或兼性厌氧菌需氧菌或兼性厌氧菌n厌氧菌：穿刺法采集厌氧菌：穿刺法采集4.采集适量标本和适当标本采集适量标本和适当标本n采集有明显病变的标本采集有明显病变的标本n根据病程采集不同的临床标本根据病程采集不同的临床标本5.安全

2、采集安全采集二、标本的处理二、标本的处理1.及时送检及时送检2.运送与保存运送与保存 1）根据待检菌特点对标本进行冷藏、保）根据待检菌特点对标本进行冷藏、保 温或保持厌氧状态温或保持厌氧状态 2）注意安全防护）注意安全防护第二节第二节 细菌形态学检查细菌形态学检查显微镜种类显微镜种类1.普通光学显微镜（普通光学显微镜（light microscope） 光源：可见光光源：可见光2. 暗视野显微镜（暗视野显微镜（ darkfield microscope ） 暗背景，菌体发光暗背景，菌体发光n用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察动观察3. 相差显

3、微镜相差显微镜 n检查不染色活细菌的形态及某些内部结构检查不染色活细菌的形态及某些内部结构4. 荧光显微镜荧光显微镜 光源：光源：100W200W的高压汞灯的高压汞灯5. 电子显微镜电子显微镜 光源：电子流光源：电子流n透射电镜透射电镜：观察细菌内部超微结构：观察细菌内部超微结构n扫描电镜扫描电镜：对细菌表面结构及附件观察：对细菌表面结构及附件观察 一、一、 不染色标本的检查不染色标本的检查n常用方法常用方法n压滴法压滴法n悬滴法悬滴法n毛吸管法毛吸管法 用于检查厌氧菌动力用于检查厌氧菌动力n用途用途n动力试验动力试验检查细菌有无动力检查细菌有无动力n制动试验制动试验鉴定血清型鉴定血清型三、三

4、、 染色标本的检查染色标本的检查（一）常用染料（一）常用染料色基：决定染料的颜色色基：决定染料的颜色助色基：决定染料的酸碱性助色基：决定染料的酸碱性1. 碱性染料碱性染料n电离后色基带正电荷电离后色基带正电荷n细菌染色常用，如美蓝、结晶紫、碱性复红等细菌染色常用，如美蓝、结晶紫、碱性复红等2. 酸性染料酸性染料n用于细胞浆染色，如伊红、酸性复红、刚果红用于细胞浆染色，如伊红、酸性复红、刚果红3. 复合染料（中性染料）复合染料（中性染料）n碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、姬姆萨染料等姬姆萨染料等4. 单纯染料单纯染料n如苏丹染料，溶于脂肪溶剂，不溶

5、于水，化如苏丹染料，溶于脂肪溶剂，不溶于水，化学亲和力低学亲和力低（二）常用的细菌染色法（二）常用的细菌染色法n单染色法单染色法只用一种染料，如吕氏美蓝只用一种染料，如吕氏美蓝n复染色法复染色法用两种或两种以上不同颜色的染料用两种或两种以上不同颜色的染料 细菌染色的一般程序细菌染色的一般程序1. 涂片涂片2. 干燥干燥：自然干燥为好：自然干燥为好3. 固定固定4. 初染初染5. 媒染媒染 媒染剂媒染剂6. 脱色脱色 脱色剂脱色剂7. 复染复染1. 革兰染色法（革兰染色法（Gram stainGram stain）（1 1）原理原理1 1）细胞壁学说：两种细菌细胞壁通透性不同）细胞壁学说：两种细

6、菌细胞壁通透性不同 2 2）等电点学说）等电点学说3 3）化学学说：两种细菌含有）化学学说：两种细菌含有RNARNA镁盐不同镁盐不同（2 2）方法方法：制片：制片结晶紫初染结晶紫初染碘液媒染碘液媒染酒精脱色酒精脱色复红复染复红复染结果结果 革兰阳性菌革兰阳性菌GG：紫色：紫色 革兰阴性菌革兰阴性菌GG：红色：红色（3）影响染色结果的因素影响染色结果的因素1）操作技术：涂片和脱色）操作技术：涂片和脱色2）染色液：）染色液：3）细菌：）细菌：1824h培养物为好培养物为好（4）意义意义:1）鉴别细菌）鉴别细菌2）选择药物）选择药物3）与致病性有关）与致病性有关 2. 抗酸染色法抗酸染色法细菌着色后

7、不被盐酸酒精脱色的染色方法细菌着色后不被盐酸酒精脱色的染色方法染料染料：石炭酸复红、盐酸酒精、美蓝：石炭酸复红、盐酸酒精、美蓝方法方法 初染：初染：5%石炭酸复红加热染色石炭酸复红加热染色5min 脱色：脱色：3%盐酸酒精盐酸酒精 复染：吕氏美蓝复染：吕氏美蓝3.荧光染色荧光染色 金胺金胺O法法4.特殊染色法特殊染色法n细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、鞭毛染色、异染颗粒染色异染颗粒染色5.负染法负染法 背景着色背景着色 肺炎链球菌荚膜染色肺炎链球菌荚膜染色 墨汁负染法墨汁负染法芽胞染色芽胞染色第三节第三节 细菌分离培养和鉴定细菌分离培养和鉴定一、培养

8、基的种类和选择一、培养基的种类和选择培养基培养基（culture mediumculture medium） 由人工方法配制而成的，专供微生物由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。生长繁殖使用的混合营养物制品。（一）培养基的组成成分（一）培养基的组成成分1. 营养物质营养物质碳源、氮源、无机盐、水、生长因子碳源、氮源、无机盐、水、生长因子（1）蛋白胨蛋白胨 提供氮源提供氮源 植物胨植物胨: 大豆大豆 动物胨：牛肉、动物组织等动物胨：牛肉、动物组织等（2）肉浸液肉浸液 碳源、氮源碳源、氮源（3）牛肉膏牛肉膏 氮源氮源（4）糖（醇）类糖（醇）类 碳源和能源碳源和能源（5）血

9、液血液 提供特殊生长因子、观察溶血提供特殊生长因子、观察溶血（6）无机盐类无机盐类常用元素常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等等微量元素微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等等（7）鸡蛋与动物血清鸡蛋与动物血清用于某些特殊培养基用于某些特殊培养基（8）生长因子生长因子维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等2.凝固物质凝固物质 即赋形剂即赋形剂（1）琼脂琼脂（2）明胶明胶 动物胶原组织熬制而成动物胶原组织熬制而成3. 抑制剂和指示剂抑制剂和指示剂（1）抑制剂：胆盐、煌绿、染料、抗生素等）抑制剂：胆盐、煌绿、染料、抗生素等选择培养基选择培养基：加入一定种类的抑制剂，以

10、抑：加入一定种类的抑制剂，以抑制杂菌生长或减少生长，有利于检出菌生长制杂菌生长或减少生长，有利于检出菌生长的培养基。的培养基。（2）指示剂：）指示剂： 酚红、中性红、中国蓝等酚红、中性红、中国蓝等 鉴别培养基鉴别培养基：加入特定底物和指示剂：加入特定底物和指示剂（二）培养基的种类（二）培养基的种类1.按培养基的物理性状按培养基的物理性状（1）液体培养基：液体培养基：增菌增菌（2）固体培养基：固体培养基：纯化，增菌纯化，增菌（3） 半固体培养基：半固体培养基：动力检测，保种动力检测，保种 液体培养基液体培养基 固体斜面培养基固体斜面培养基 半固体培养基半固体培养基2. 按营养成分和用途分类按营养

11、成分和用途分类（1）基础基础培养基：只有基本营养成分培养基：只有基本营养成分（2）营养营养培养基：加有血液培养基：加有血液 、血清等、血清等（3）鉴别鉴别培养基：含有特定底物和指示剂培养基：含有特定底物和指示剂（4）选择选择培养基：含有抑制剂培养基：含有抑制剂（5）特殊特殊培养基：厌氧、细菌培养基：厌氧、细菌L型型（三）培养基的选择（三）培养基的选择1.血平板血平板 最常用最常用2.巧克力血平板巧克力血平板 奈瑟菌属、流感嗜血杆菌奈瑟菌属、流感嗜血杆菌3.肠道选择培养基肠道选择培养基 分离肠道细菌分离肠道细菌 常用中国蓝、常用中国蓝、EMB、MAC、SS4.碱性琼脂或碱性琼脂或TCBS 分离霍

12、乱弧菌分离霍乱弧菌5.血液增菌培养基血液增菌培养基 血液、骨髓增菌用血液、骨髓增菌用6.营养肉汤营养肉汤 增菌用增菌用（四）培养基的制备（四）培养基的制备1. 常用各种器具灭菌前的准备常用各种器具灭菌前的准备（1）培养皿：用纸包裹）培养皿：用纸包裹（2）试管：加塞后用纸包好）试管：加塞后用纸包好（3）吸管和毛细管）吸管和毛细管（4）烧瓶）烧瓶2. 培养基制备的一般程序培养基制备的一般程序（1）调配调配 根据培养基组成，准确称取各组分，先加需要蒸根据培养基组成，准确称取各组分，先加需要蒸馏水的一部分，再加培养基干粉，最后补足水量。馏水的一部分，再加培养基干粉，最后补足水量。（2）溶化溶化 液体培

13、养基不需加热液体培养基不需加热 （3）调整调整pH值值 一般一般7.27.6（4）过滤澄清过滤澄清（一般可以省略）（一般可以省略）n液体培养基：液体培养基： 滤纸滤纸n固体培养基：固体培养基： 纱布纱布 （5）分装分装 n平板：灭菌后冷却至平板：灭菌后冷却至50 60时倾倒时倾倒 90mm 2530ml（4mm）：）：药敏用药敏用 90mm 1315ml( (3mm) )：培养用培养用n琼脂斜面：分装量为试管的琼脂斜面：分装量为试管的1/41/3，灭菌后，灭菌后趁热制成斜面，斜面长度趁热制成斜面，斜面长度2/3n高层、半固体、液体：分装量为试管长度高层、半固体、液体：分装量为试管长度1/42/

14、3 （ 6）灭菌灭菌n高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 n无糖：无糖：103.4kPa 121.31530minn含糖：含糖： 68.4kPa 115 15minn流动蒸汽灭菌法流动蒸汽灭菌法 血清、牛乳、鸡蛋血清、牛乳、鸡蛋n间歇蒸汽灭菌法间歇蒸汽灭菌法（7）鉴定鉴定n无菌试验无菌试验：将制好的培养基在：将制好的培养基在35孵育过孵育过夜，判定是否灭菌合格。夜，判定是否灭菌合格。n效果检查效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的生长状况，判断培养基是否种，观察细菌的生长状况，判断培养基是否符合要求。符合要求。（8）保存保存 4 冰箱保存，一周左右冰箱保存，一

15、周左右 注意事项注意事项1. 器皿器皿 中性硬质玻璃器皿中性硬质玻璃器皿2. 化学药品化学药品 化学纯以上化学纯以上3. 准确称量，正确溶解准确称量，正确溶解4. 准确测定培养基酸碱度准确测定培养基酸碱度5. 保持澄清保持澄清6. 灭菌时间不宜过长，不宜反复灭菌灭菌时间不宜过长，不宜反复灭菌二、二、分离培养分离培养（一）细菌的分离（一）细菌的分离1.无菌技术无菌技术是防止微生物进入物品和机体，同时防止是防止微生物进入物品和机体，同时防止被检物中可能存在的病原微生物污染周围被检物中可能存在的病原微生物污染周围环境及工作人员的规范化操作技术。环境及工作人员的规范化操作技术。2.操作要点操作要点左手

16、左手负责持平皿、试管等物品负责持平皿、试管等物品右手右手持接种工具取菌并划种持接种工具取菌并划种3.移种或接种的基本步骤移种或接种的基本步骤（1）右手持接种工具，在火焰上烧灼灭菌。）右手持接种工具，在火焰上烧灼灭菌。（2）左手拿起标本盒或平皿、试管等。）左手拿起标本盒或平皿、试管等。（3） 用接种工具挑取适量标本或细菌。用接种工具挑取适量标本或细菌。（4）根据目的选择不同的接种方法）根据目的选择不同的接种方法（5） 接种完毕，在火焰上烧灼接种工具，放接种完毕，在火焰上烧灼接种工具，放回原处。回原处。4.常用的接种方法常用的接种方法（1）平板划线法平板划线法n分区划线法分区划线法 用用于杂菌量较

17、多的标本于杂菌量较多的标本n连续划线法连续划线法 用于杂菌不多的标本用于杂菌不多的标本（2）琼脂斜面接种法琼脂斜面接种法纯培养纯培养（3）穿刺法穿刺法观察细菌动力观察细菌动力（4）液体培养基接种法液体培养基接种法 增菌增菌（5）倾注平板法倾注平板法计数细菌数量计数细菌数量（6）涂布法涂布法 纸片法药敏试验纸片法药敏试验（二）细菌的培养方法（二）细菌的培养方法1.需氧培养法需氧培养法 普通培养普通培养2.二氧化碳培养二氧化碳培养（1）二氧化碳培养箱）二氧化碳培养箱（2）烛缸法）烛缸法（3）化学法）化学法3.厌氧培养厌氧培养（三）细菌的生长现象（三）细菌的生长现象1.固体培养基上的生长现象固体培养

18、基上的生长现象n菌落菌落：单个细菌在培养基上分裂繁殖成一堆：单个细菌在培养基上分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。肉眼可见的细菌集团。nCFU：菌落形成单位，活菌计数用菌落形成单位，活菌计数用n细菌菌落的描述细菌菌落的描述 大小、形状、突起或扁平、大小、形状、突起或扁平、边缘、颜色、表面、透明度边缘、颜色、表面、透明度（1）光滑型菌落光滑型菌落（S型菌落）型菌落）表面光滑、湿润、边缘整齐表面光滑、湿润、边缘整齐（2）粗糙型菌落粗糙型菌落（R型菌落）型菌落）表面粗糙、干燥、边缘不齐表面粗糙、干燥、边缘不齐（3）粘液型菌落粘液型菌落（M型菌落）型菌落）菌落粘稠、有光泽、似水珠样菌落粘稠、有光泽、似水

19、珠样 卷发样菌落卷发样菌落 粗糙型菌落（粗糙型菌落（L-J）粘粘液液型型菌菌落落2.液体培养基中的生长情况液体培养基中的生长情况表面生长表面生长 均匀混浊生长均匀混浊生长 沉淀生长沉淀生长 三、细菌生化反应鉴定三、细菌生化反应鉴定（一）碳水化合物的代谢试验（一）碳水化合物的代谢试验1. 糖（醇、苷）类发酵试验糖（醇、苷）类发酵试验n原理原理 各种细菌酶系不同，分解糖（醇、各种细菌酶系不同，分解糖（醇、苷）的能力各异，产物也不同。苷）的能力各异，产物也不同。n培养基培养基 单糖、双糖、三糖、多糖单糖、双糖、三糖、多糖n应用应用 肠道杆菌科细菌的鉴定肠道杆菌科细菌的鉴定 Sugar Ferment

20、ation 2. 葡萄糖氧化葡萄糖氧化/发酵试验（发酵试验（O/F）n原理原理 氧化型氧化型 专性需氧菌专性需氧菌 发酵型发酵型 产碱型产碱型 不分解葡萄糖不分解葡萄糖 n培养基培养基 Hugh-Leifson二氏培养基二氏培养基n结果结果 氧化管氧化管 发酵管发酵管 氧化型氧化型 变黄变黄 不变不变 发酵型发酵型 变黄变黄 变黄变黄 产碱型产碱型 不变不变 不变不变 （阴性）（阴性） n应用应用 鉴别肠杆菌科细菌与非发酵菌鉴别肠杆菌科细菌与非发酵菌3. -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（ONPG ）试验试验n原理原理 ONPG无色，经无色，经-半乳糖苷酶水解后生半乳糖苷酶水解后生成黄色的邻硝基酚成黄

21、色的邻硝基酚n方法方法（1）在含）在含ONPG的培养基中接种纯种细菌的培养基中接种纯种细菌（2）制成菌悬液，加入甲苯，再加）制成菌悬液，加入甲苯，再加ONPG试剂试剂n结果结果 阳性：变黄（阳性：变黄（2030min）n应用应用 迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定4. 七叶苷水解试验七叶苷水解试验n原理原理 葡萄糖葡萄糖七叶苷七叶苷 七叶素七叶素+Fe2+ 黑色化合物黑色化合物n培养基培养基 七叶苷、胆汁七叶苷培养基七叶苷、胆汁七叶苷培养基n结果结果 阳性：培养基变黑阳性：培养基变黑n用途用途 鉴别肠球菌、鉴别肠球菌、G-杆菌及厌氧菌杆菌及厌氧菌 5. 甲基红甲基红（meth

22、yl red MR）试验试验n原理原理葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 甲基红甲基红 - -葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸 各种酸各种酸 甲基红甲基红 + +n培养基培养基 葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水n结果结果 阳性：红色阳性：红色 阴性：黄色阴性：黄色 n应用应用 鉴别肠杆菌科细菌鉴别肠杆菌科细菌 6. VP（Voges-Proskauer）试验试验n原理原理葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 二乙酰二乙酰肌酸肌酸 萘酚萘酚红色化合物红色化合物 n培养基培养基 葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水n结果结果 阳性：红色阳性：红色n应用应用 鉴别肠杆菌科细菌鉴别肠杆菌科细菌（

23、二）蛋白质和氨基酸的代谢试验（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验明胶液化试验n原理原理：某些细菌可产生明胶酶，分解明：某些细菌可产生明胶酶，分解明 胶，使其失去凝固能力。胶，使其失去凝固能力。n方法方法：将待检物接种于明胶培养基：将待检物接种于明胶培养基22 培养培养7天天n结果结果：培养基呈液化状态为阳性：培养基呈液化状态为阳性n应用应用：肠杆菌科细菌鉴别：肠杆菌科细菌鉴别2. 吲哚吲哚（indol）试验试验n原理原理色氨酸色氨酸吲哚吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）n培养基培养基 蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基n结果结果 阳性：红色阳

24、性：红色 3. 硫化氢试验硫化氢试验n原理原理含硫氨基酸含硫氨基酸 H H2 2S+S+硫酸亚铁硫酸亚铁FeSFeS黑色黑色 醋酸铅醋酸铅 PbSPbS黑色黑色n培养基培养基 醋酸铅培养基醋酸铅培养基n结果结果 阳性：黑色沉淀阳性：黑色沉淀n用途用途 肠杆菌科菌属间的鉴定肠杆菌科菌属间的鉴定 4. 尿素分解试验尿素分解试验n原理原理尿素尿素 NH3+CO2+H2O (NH4)2CO3n培养基培养基尿素肉汤或尿素琼脂培养基尿素肉汤或尿素琼脂培养基n结果结果 阳性：红色阳性：红色n用途用途 肠杆菌科中变形杆菌的鉴定肠杆菌科中变形杆菌的鉴定 5. 苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验n原理原理苯丙氨

25、酸苯丙氨酸 苯丙酮酸苯丙酮酸+10%氯化铁氯化铁 绿色化合物绿色化合物n培养基培养基 苯丙氨酸琼脂培养基苯丙氨酸琼脂培养基 n结果结果 阳性：绿色阳性：绿色n用途用途 肠杆菌科中变形杆菌的鉴定肠杆菌科中变形杆菌的鉴定 6. 氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验n原理原理氨基酸氨基酸 胺胺+ CO2 培养基变碱培养基变碱n培养基培养基 氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照n结果结果 阳性：紫色阳性：紫色 阴性：黄色阴性：黄色n用途用途 肠杆菌科细菌鉴定肠杆菌科细菌鉴定（三）（三） 碳源和氮源利用试验碳源和氮源利用试验1. 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验n原理原理铵盐铵盐 碳

26、酸钠碳酸钠+氨氨n培养基培养基 枸橼酸盐培养基枸橼酸盐培养基n结果结果 阳性：蓝色阳性：蓝色 阴性：绿色阴性：绿色2.丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验利用枸橼酸盐生长利用枸橼酸盐生长 + 不能利用不能利用 - IMViC试验试验I - 吲哚吲哚（indol）试验试验M - 甲基红甲基红（methyl red）试验试验V - VP（Voges-Proskauer）试验试验C -枸橼酸盐利用枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验试验 I M Vi C试验试验 大肠埃希菌大肠埃希菌 + + - - 产气杆菌产气杆菌 - - + + （四）（四） 各种酶类试验各种酶类试验1. 氧化

27、酶试验氧化酶试验n原理原理n方法方法 菌落法菌落法 滤纸法滤纸法 试剂纸片法试剂纸片法 n结果结果 深紫色为阳性深紫色为阳性2. 过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验3. 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验4. 脂酶试验脂酶试验5. 卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验6. DNA酶试验酶试验7. 凝固酶试验凝固酶试验8.CAMP试验试验9. 胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验（五）抑菌试验（五）抑菌试验1.O/129试验试验n用于弧菌科的属间鉴别用于弧菌科的属间鉴别2.杆菌肽试验杆菌肽试验n用于用于A群链球菌与其他链球菌间的鉴别群链球菌与其他链球菌间的鉴别3.奥普托欣试验奥普托欣试验n用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别用于肺炎链

28、球菌与其他链球菌的鉴别第四节第四节 细菌的非培养检测方法细菌的非培养检测方法一、一、免疫学检测免疫学检测利用抗原、抗体特异性结合的原理，用已利用抗原、抗体特异性结合的原理，用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未知抗原。未知抗原。（一）抗原检测（一）抗原检测1. 凝集反应凝集反应n直接凝集、间接凝集、直接凝集、间接凝集、SPA协同凝集试验协同凝集试验2.免疫荧光技术免疫荧光技术n用荧光标记抗体，显微镜观测结果用荧光标记抗体，显微镜观测结果3.酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术n用酶标记抗体，根据颜色变化判断结果用酶标记抗体，根据颜色变化判断结果反向间接血凝试

29、验反向间接血凝试验免疫荧光技术免疫荧光技术1.直接法：直接法：荧光素标记抗体荧光素标记抗体2.间接法间接法：荧光素标记二抗（抗抗体）：荧光素标记二抗（抗抗体）3.免疫荧光免疫荧光 菌球法菌球法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验-ELISA1. 双抗体夹心法双抗体夹心法2. 竞争法竞争法 阳性阳性-无色无色（二）抗体检测（二）抗体检测n用已知的细菌或其特异性抗原检测病人用已知的细菌或其特异性抗原检测病人 血清中有无相应抗体及其效价的动态变血清中有无相应抗体及其效价的动态变 化，辅助诊断某些传染病。化，辅助诊断某些传染病。二、分子生物学检测二、分子生物学检测（一）核酸杂交（一）核酸杂交n来自两个不同

30、个体的单链来自两个不同个体的单链DNA 相互结合成互补的相互结合成互补的DNA双链的过程双链的过程（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（PCR）n是一项简便、快速的特异性是一项简便、快速的特异性DNA体外扩增技术体外扩增技术（三）生物芯片技术（三）生物芯片技术n常用的芯片：基因芯片、蛋白质芯片常用的芯片：基因芯片、蛋白质芯片三、细菌毒素的检测三、细菌毒素的检测（一）内毒素（一）内毒素1.内毒素的致热作用（体内实验）内毒素的致热作用（体内实验）n原理原理：内毒素产生于：内毒素产生于G-菌，菌体死亡后菌，菌体死亡后释放，作用于体温调节中枢，引起发热。释放，作用于体温调节中枢，引起发热。n方法方法：

31、（1）将家兔分成两组，每组）将家兔分成两组，每组4只，测量基只，测量基 础体温并记录。础体温并记录。（2）用无菌注射器抽取待检物注入一组家）用无菌注射器抽取待检物注入一组家兔耳静脉，另一组注射等量生理盐水。兔耳静脉，另一组注射等量生理盐水。（3）观察动物反应，并间隔）观察动物反应，并间隔30min测量测量两组家兔体温。两组家兔体温。n结果结果 ：阳性阳性 试验组体温升高试验组体温升高 对照组体温正常对照组体温正常n应用应用：无菌的生物制品：无菌的生物制品2.鲎试验（体外实验）鲎试验（体外实验）原理原理：鲎血液中含有一种变形细胞，此细：鲎血液中含有一种变形细胞，此细胞裂解物可与微量内毒素起凝胶反

32、应，即胞裂解物可与微量内毒素起凝胶反应，即细胞裂解物中的一种酶被激活，使细胞裂细胞裂解物中的一种酶被激活，使细胞裂解物中的蛋白质形成凝胶。解物中的蛋白质形成凝胶。鲎试剂鲎试剂：鲎变形细胞裂解物：鲎变形细胞裂解物n方法方法（1）打开）打开3支鲎试剂安瓶，各加支鲎试剂安瓶，各加0.1ml无菌无菌蒸馏水使之溶解，同时编号。蒸馏水使之溶解，同时编号。（2）向）向3支安瓶中分别加待测物、标准内支安瓶中分别加待测物、标准内毒素、无热原生理盐水各毒素、无热原生理盐水各0.1ml。（3）轻轻摇匀，垂直放轻轻摇匀，垂直放37 水浴，水浴，1530min后观察结果。后观察结果。鲎试验鲎试验n结果结果- 不形成凝胶

33、不形成凝胶+ 形成凝胶，但不牢固形成凝胶，但不牢固+ 形成牢固凝胶，倒持安瓶凝胶不动。形成牢固凝胶，倒持安瓶凝胶不动。n应用应用鲎试验鲎试验（二）外毒素（二）外毒素1.体内毒力试验体内毒力试验n原理原理：细菌外毒素对机体具有强烈毒性：细菌外毒素对机体具有强烈毒性 作用，但可被相应抗毒素中和，中和后，作用，但可被相应抗毒素中和，中和后， 实验动物不产生中毒症状。实验动物不产生中毒症状。如：破伤风外毒素的毒性作用和抗毒素保如：破伤风外毒素的毒性作用和抗毒素保护作用。护作用。2.体外毒力试验体外毒力试验 抗原抗体反应抗原抗体反应四、动物实验四、动物实验（一）实验动物的分类（一）实验动物的分类1.遗传

34、学控制方法分类遗传学控制方法分类（1）近交系动物）近交系动物 纯系动物纯系动物（2）突变种纯系动物）突变种纯系动物（3）杂种动物）杂种动物2.微生物学控制方法分类微生物学控制方法分类（1）无菌无菌动物（动物（GFGF）（2）悉生悉生动物动物（GBGB）（3）无特殊病原体无特殊病原体动物（动物（SPFSPF）（4）清洁清洁动物或最低限度疾病动物动物或最低限度疾病动物（5）普通普通动物动物（二）实验动物的选择（二）实验动物的选择1. 选择敏感动物选择敏感动物2. 选择不同种类和品系动物选择不同种类和品系动物3. 根据统计学标准选择动物根据统计学标准选择动物4. 选择符合要求的健康动物选择符合要求的

35、健康动物5. 尽量选择小动物尽量选择小动物（三）（三） 实验动物的接种途径和方法实验动物的接种途径和方法1.接种途径和方法接种途径和方法（1）皮下皮下接种接种 腹壁、背部、腹股沟腹壁、背部、腹股沟 0.21.0ml（2）皮内皮内接种接种 背部背部 0.10.2ml（3）肌肉肌肉接种接种 0.21.0ml（4）腹腔腹腔接种接种 小白鼠小白鼠 家兔家兔 豚鼠豚鼠 （5）静脉静脉接种接种 家兔家兔 耳静脉耳静脉 鼠鼠 尾静脉尾静脉 鸡鸡 翅下静脉翅下静脉（6）脑内脑内接种接种 眼角与耳根连线的中点眼角与耳根连线的中点 深度深度36mm 0.10.2ml 小鼠：小鼠：0.010.03ml 兔、豚鼠兔、豚鼠 ：0.10.2ml （7） 脚掌脚掌接种法接种法 0.10.5ml（四）接种后的观察与解剖（四）接种后的观察与解剖1.接种后观察接种后观察每日观察并作详细记录每日观察并作详细记录（1）观察动物外表）观察动物外表（2）动物生理体征的变化）动物生理体征的变化2.动物解剖动物解剖（五）（五） 动物采血法动物采血法1.心脏采血法心脏采血法适用动物：兔适用动物：兔 2040ml 豚鼠豚鼠 510ml2.静脉采血法静脉采血法适用动物适用动物 绵羊绵羊 颈静脉颈静脉 100200ml 家兔家兔 耳静脉耳静脉 12ml 白鼠白鼠 尾静脉尾静脉3.颈动脉采血颈动脉采血