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1、对于石蜡切片：对于石蜡切片：1 1、 烤片：烤片：6060 60 60 分钟分钟2 2、 脱蜡：二甲苯中脱蜡脱蜡：二甲苯中脱蜡 1515 分钟分钟二甲苯脱蜡二甲苯脱蜡 1515 分钟分钟无水乙醇无水乙醇5 5 分钟分钟无水乙醇无水乙醇5 5 分钟分钟90%90%乙醇乙醇5 5 分钟分钟90%90%乙醇乙醇5 5 分钟分钟7070乙醇乙醇 5 5 分钟分钟蒸馏水蒸馏水 5 5 分钟分钟蒸馏水蒸馏水 5 5 分钟。分钟。3 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入 l l 柠檬酸钠，柠檬酸钠，( (柠柠檬酸三钠檬酸三钠 3g, 3g
2、,柠檬酸柠檬酸 0.4g 0.4g 加入加入 1000ml1000ml 蒸馏水中蒸馏水中) )，上汽后加热上汽后加热 1010 分钟，分钟，关火。关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。2.2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加 3%H3%H2 2O2O22 2(2ml(2ml H H2 2O2O22 2加入加入 18ml18ml 蒸馏水蒸馏水中，现配现用，避光中，现配现用，避光) )，室温孵育，室温孵育 1010 分钟，分钟，PBSPBS 洗洗 3 3 次，每次次，每次 5 5 分钟。分钟。
3、 （也可不（也可不用去除内源性酶）用去除内源性酶） 。3.3. 封闭封闭(Blocking)(Blocking)加加 10%10%正常驴血清（原液正常驴血清（原液 100ul+900ulPBS,1ml100ul+900ulPBS,1ml 够用够用 3030 张片子）张片子） ，室温，室温孵育封闭孵育封闭 3030 分钟。如果背景较高，可以分钟。如果背景较高，可以 4 4封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。边水分。 从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。否则极
4、易产生较高的背景。4.4. 一抗孵育一抗孵育(Primary antibody incubation)(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%10%山羊血山羊血清清 PBSPBS 或或 1%BSA-PBS1%BSA-PBS）稀释一抗。）稀释一抗。立即加入稀释好的一抗，立即加入稀释好的一抗， 4 4过夜，第二天取出复温过夜，第二天取出复温 4545 分钟。分钟。PBSPBS 洗洗 3 3次，每次次，每次 5 5 分钟。分钟。5.5. 二抗孵育二抗孵育(Secondary
5、 antibody inucubation)(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或稀释好的二抗，室温或 4 4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。PBSPBS 洗涤洗涤 3 3 次。每次次。每次5 5 分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。并增加洗涤次数。6.6. 蛋白检测蛋白检测(Detection of proteins)(D
6、etection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。7.7. 复染复染用用 DAPIDAPI 对细胞核进行染色，室温对细胞核进行染色，室温 1010 分钟，分钟，PBSPBS 冲洗冲洗 5 5 分钟分钟3 3 次，封片（封片次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液 1 1：1 1 混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧
7、光染色。染色。例如用免疫荧光染色试剂盒例如用免疫荧光染色试剂盒- -抗小鼠抗小鼠 Cy3(P0193)Cy3(P0193)进行红色荧光染色，进行红色荧光染色，随后随后可以用免疫荧光染色试剂盒可以用免疫荧光染色试剂盒- -抗兔抗兔 FITC(P0186)FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用两种染色后可以使用 HoechstHoechst 染色试剂盒染色试剂盒(C0003)(C0003)对细胞核进行染色，染色后为对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。蓝色荧光。碳酸缓冲液配方：碳酸缓冲液配方：NaHCO3 3.7gNaHCO3 3.7gNa2CO3 0.6gNa2CO3 0.6g双蒸水溶解至双蒸水溶解至 100ml100ml，调节，调节 pHpH 至至
