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1、 细 胞 （组 织）化 学 技 术细胞化学术发展史：发展史：细细胞胞化化学学是是研研究究细细胞胞显显微微结结构构和和超超微微结结构构的的化化学学组组成成及及其其定定位位的的科学（定量）。科学（定量）。研研究究对对象象是是生生物物大大分分子子：核核酸酸、蛋蛋白白质质、酶酶、多多糖糖、脂脂类类等等在在细细胞胞或或组组织织内内的的结结构构、分分布布及及变变化化，为为深深入入阐阐明明细细胞胞和和异异常常细细胞胞的的增值与分化、遗传与发生、病理和病因等提供科学依据。增值与分化、遗传与发生、病理和病因等提供科学依据。1830年年比比利利时时植植物物学学家家Raspail发发表表论论文文在在生生理理学学重重
2、视视用用显显微微镜观察生化物质。镜观察生化物质。1830-1870组组织织化化学学主主要要用用于于揭揭示示生生物物界界中中的的生生理理现现象象。1880-1920随随着着显显微微镜镜的的改改进进和和组组织织细细胞胞学学染染色色技技术术的的发发展展，组组织织化化学学的概念从生理组织学转变为的概念从生理组织学转变为显微化学显微化学。1900-1935年年细细胞胞化化学学技技术术在在病病理理学学染染色色方方法法中中的的应应用用，丰丰富富了了显显微微镜镜下下证证实实核核酸酸、蛋蛋白白质质、酶酶、多多糖糖、脂脂类类等等物物质质的的组组织织化化学学内内容。容。以后发展了以后发展了酶细胞化学酶细胞化学。细胞
3、化学术20世世纪纪50年年代代，电电子子显显微微镜镜的的问问世世，观观察察细细胞胞的的超超微微结结构构。到到80年年代代末末，发发展展与与完完善善了了电电镜镜细细胞胞化化学学。70年年代代由由于于细细胞胞显显微微分分光光光光度度法法和和荧荧光光显显微微光光度度法法的的建建立立，使使细细胞胞化化学学的的成成分分得得以以定定量量、形形成成定定量量细细胞胞化化学学。80-90年年代代，流流式式细细胞胞仪仪可可对对单单细细胞胞化化学学成成分分定定量量分分析析的的新新技技术术（每每秒秒可可测测上上万万个个信信息息）。80年年代代后后期期，创创立立了了激激光光扫扫描描共共聚聚焦焦显显微微技技术术，对对单单
4、个个细细胞胞进进行行CT分分析析，通通过过计计算算机机进进行行三三微微立立体体旋旋转转，从从各各角角度度分分析析细细胞胞深深层层和和细细胞胞表表面面的的各各种种结结构构。可可研研究究活活细细胞胞和和定定量量分分析析细细胞胞内内的的遗遗传传物物质质DNA、RNA、细细胞胞器、酶的含量等。器、酶的含量等。细胞化学术基本原理：基本原理：细细胞胞中中的的某某种种化化学学成成分分和和其其相相应应的的底底物物呈呈现现一一系系列列的的化化学学反反应应，形形成成在在显显微微镜镜下下可可见见到到的的反反应应产产物物。对对细细胞胞内内的的各各种种成成分分进进行行定定性性、定定位位、定定量量研研究。（特异性）究。（
5、特异性）常用方法及原理：常用方法及原理：一一金金属属-金金属属盐盐沉沉淀淀法法原原理理利利用用金金、银银、铜铜、铁铁、钴钴等等金金属属化化合合物物与与细细胞胞化学成分反应过程中生成有色沉淀。化学成分反应过程中生成有色沉淀。二二偶偶氮氮偶偶联联法法原原理理用用人人工工的的酶酶底底物物，在在酶酶的的作作用用下下产产生生分分解解产产物物，后后者者与与重氮盐结合，引起偶氮偶联法反应，形成不溶性偶氮色素。重氮盐结合，引起偶氮偶联法反应，形成不溶性偶氮色素。三三过碘酸过碘酸Schiff氏剂反应氏剂反应原理原理四四多糖（糖原）多糖（糖原）+过碘酸过碘酸醛基醛基+Schiff氏剂氏剂紫红色化合物紫红色化合物显
6、示细胞内糖类为显示细胞内糖类为PAS反应反应显示细胞核内为显示细胞核内为Feulgen反应反应细胞化学术五五色素形成法显示酶定位的方法色素形成法显示酶定位的方法某化学物质在酶作用下在细胞局部形成色素沉淀，包括四唑盐法、某化学物质在酶作用下在细胞局部形成色素沉淀，包括四唑盐法、联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶等。化还原酶、多种脱氢酶、转移酶等。还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗体法等。体法等。具体几项细胞化学
7、技术简介：具体几项细胞化学技术简介：（一）。（一）。孚孚尔更反应显示尔更反应显示DNA方法方法(Feulgen)用弱酸（用弱酸（!NHCL）水解析饱和中）水解析饱和中DNA，打开嘌呤硷基和脱氧核糖，打开嘌呤硷基和脱氧核糖核酸连接的双链，释放出核酸连接的双链，释放出醛基醛基，与，与Schiff试剂试剂结合结合紫红色化合物紫红色化合物。用显微分光光度计定量分析。用显微分光光度计定量分析。（二）。（二）。甲绿甲绿派郎宁显示派郎宁显示DNA和和RNA甲绿染甲绿染DNA，派郎宁染，派郎宁染RNA，它们并不是化学作用，而是与两种，它们并不是化学作用，而是与两种核酸的聚合程度有关。核酸的聚合程度有关。结果结
8、果细胞核的细胞核的DNA绿色绿色兰绿色兰绿色，核仁和胞质的，核仁和胞质的RNA呈红色呈红色。（三）。（三）。丫叮橙（丫叮橙（AO）荧光染色显示）荧光染色显示DNA和和RNAAO荧光染料与荧光染料与多聚体的多聚体的DNA和和RNA具有亲和力。结果具有亲和力。结果细胞核的细胞核的DNA亮绿色亮绿色黄绿黄绿色荧光色荧光，核仁和胞质的，核仁和胞质的RNA呈红色荧光呈红色荧光。细胞化学术（四四）。多多糖糖的的显显示示法法过过碘碘酸酸雪雪夫夫（Schiff）氏氏剂反应剂反应多多糖糖（糖糖原原）+过过碘碘酸酸醛醛基基+Schiff氏氏剂剂紫紫红红色色化合物化合物（五）。（五）。酶的显示酶的显示1碱性磷酸酶碱
9、性磷酸酶的显示（钙的显示（钙-钴法）钴法）用用磷磷酸酸脂脂为为底底物物，被被碱碱性性磷磷酸酸酶酶水水解解后后释释放放出出磷磷酸酸基基，在在pH9。29。8条条件件下下，磷磷酸酸基基与与钙钙形形成成磷磷酸酸钙钙（无无色色）+硝硝酸酸钴钴磷磷酸酸钴钴（无无色色）+黄黄色色硫化胺硫化胺硫化胺钴（黑色）硫化胺钴（黑色）结结果果碱碱性性磷磷酸酸酶酶成成浅浅灰灰、灰灰黄黄、灰灰黑黑色色。色色深深者者表示酶多。对照组无反应。表示酶多。对照组无反应。细胞化学术2三磷酸腺苷酶（三磷酸腺苷酶（ATPase）ATP酶使酶使ATPADP,释放磷酸基释放磷酸基+硝酸铅硝酸铅磷酸铅（黑色）磷酸铅（黑色）结果结果ATP酶呈
10、棕黑色酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。对照组无反应。3葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶显示法（磷酸酶显示法（G-6-Pase）葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶作用葡萄糖磷酸酶作用葡萄糖-6-磷酸酶钠（钾）磷酸酶钠（钾）释放磷酸基释放磷酸基+硝酸铅硝酸铅磷酸铅（黑色）磷酸铅（黑色）结果结果G-6-P酶呈棕黑色酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。对照组无反应。细胞化学术 ATPase细胞化学术ATPase 细胞化学术ATPase 细胞化学术G-6-Pase 细胞化学术G-6-Pase 细胞化学术G-6-Pase 细胞化学术G-6-Pase 细胞化
11、学术45-核苷酸酶的显示法核苷酸酶的显示法（5-Nucleoyidase）此此酶酶作作用用于于5-核核苷苷酸酸、水水解解嘌嘌呤呤核核苷苷酸酸或或嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸第第五五位位碳碳原原子子的的磷磷酸酸分分子子，释放磷酸基释放磷酸基+硝酸铅硝酸铅磷酸铅（黑色）。磷酸铅（黑色）。结果结果5-核苷酸酶呈棕黑色核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。免疫细胞化学术免疫细胞化学术应应用用抗抗原原与与抗抗体体结结合合的的免免疫疫学学原原理理，检检测测细细胞胞内内的的多多肽肽、蛋蛋白白质质及及膜膜抗抗原原和和受受体等大分子物质的存在与分布。体等大分子物质的存在
12、与分布。其特点是特异性强、敏感性高、进展迅速，应用广泛。其特点是特异性强、敏感性高、进展迅速，应用广泛。程程序：序： 1 抗原（提取动物某些肽类或蛋白质）抗原（提取动物某些肽类或蛋白质）注入另一动物体内注入另一动物体内产生抗体（产生抗体（Ig）血清分离提取抗体血清分离提取抗体 2 抗体标记抗体标记抗体抗体+荧光素（异硫氰酸荧光素）荧光素（异硫氰酸荧光素）与相应抗原结合呈与相应抗原结合呈黄绿色荧光黄绿色荧光抗体抗体+辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）与相应抗原结合呈与相应抗原结合呈棕红色荧光棕红色荧光细胞化学术方方法：法：（1）直接法直接法抗原抗原抗体直接结合抗体直接结合简便、迅速，简便、
13、迅速，但是敏感性较低。但是敏感性较低。（2）间间接接法法一一抗抗体体（作作为为抗抗原原）注注入入物物体体内内产产生生第第二二抗抗体体常用过氧化物酶常用过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（抗过氧化物酶复合物法（PAP法）。法）。较复杂，敏感性高较复杂，敏感性高（3）新进展新进展亲合素（卵白素）亲合素（卵白素）生物素法（生物素法（LAB法）法）桥连亲合素（卵白素）桥连亲合素（卵白素）生物素法（生物素法（BAB法）法）亲亲合合素素生生物物素素过过氧氧化化物物酶酶复复合合物物法法（ABC法法）(市市场场商品商品)细胞化学术细胞化学术细胞化学术组织培养术组织培养术:体外研究活细胞或组织的有价值的手段体外研究
14、活细胞或组织的有价值的手段无菌条件下，取活组织、活细胞（或传代培养的细胞无菌条件下，取活组织、活细胞（或传代培养的细胞株）株）培养液（天然或人工合成），在一定温度、培养液（天然或人工合成），在一定温度、O2、CO2、Ph培养（加某种受试因素）培养（加某种受试因素）倒倒置显微镜下观察：细胞活组织的增殖、分化、运动、置显微镜下观察：细胞活组织的增殖、分化、运动、吞噬等。可连续录像观察。吞噬等。可连续录像观察。细胞化学术 正常培养细胞正常培养细胞 细胞化学术 中药组细胞中药组细胞 细胞化学术 西药组细胞西药组细胞细胞化学术 对照组细胞对照组细胞 细胞化学术中药组细胞中药组细胞 细胞化学术原位杂交术原
15、位杂交术:即核酸分子杂交组织化学术。即核酸分子杂交组织化学术。基本原理：两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过基本原理：两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA双链分双链分子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素、生物素、地高辛等放射性物质）、荧光素、生物素、地高辛等放射性物质）DNA或或RNA片段作为片段作为核酸探针核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或或DNA）片段进行杂交片段进行杂交，然后可用放射自
16、显影等方法予以显示。，然后可用放射自显影等方法予以显示。在光镜或电镜下观察目的在光镜或电镜下观察目的mRNA或或DNA的存在与定位。用此的存在与定位。用此技术可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。技术可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有极高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平探讨此方法有极高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平探讨细胞的功能表达及其调控机制，已成为当今细胞生物学、分细胞的功能表达及其调控机制，已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。子生物学研究的重要手段。细胞化学术放射自显影术放射自显影术: 是通过活细胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该细
17、胞的是通过活细胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该细胞的功能状态、或该物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性功能状态、或该物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性同位素或放射性同位素标记的物质注入体内，间隔一定时间同位素或放射性同位素标记的物质注入体内，间隔一定时间后取材、制备切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳胶或后取材、制备切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳胶或贴以照相底片），置暗处暴光，再显影、定影。结果，在放贴以照相底片），置暗处暴光，再显影、定影。结果，在放射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原为黑色的射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原为黑色的微细颗粒，可在光镜或电镜
18、下观察，从而获知被检物质在组微细颗粒，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组织或细胞内的分布及相对含量。在注入同位素标记物后，如织或细胞内的分布及相对含量。在注入同位素标记物后，如果有规律地在若干时间段取材，则可以观察到被检物质的动果有规律地在若干时间段取材，则可以观察到被检物质的动态分布及变化过程，如将态分布及变化过程，如将131I注入体内可以观察碘在甲状腺注入体内可以观察碘在甲状腺滤泡内的代谢情况；将滤泡内的代谢情况；将3H标记的胸腺嘧啶核苷注入体内，就标记的胸腺嘧啶核苷注入体内，就能研究蛋白质或核酸在组织、细胞内的代谢过程。能研究蛋白质或核酸在组织、细胞内的代谢过程。细胞化学术组织工
19、程组织工程:是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。组织工程主要包括以下四方面：组织工程主要包括以下四方面：获取生长旺盛的细胞获取生长旺盛的细胞,即种子细胞。即种子细胞。准备细胞外基质，准备细胞外基质，包括生物材料包括生物材料(如牛胶原如牛胶原)及无毒、可被机体吸收的人工及无毒、可被机体吸收的人工合成高分子材料。合成高分子材料。构建组织或器官，即有目的地把种构建组织或器官，即有目的地把种子细胞置于细胞外基质中进行三维培养，并形成所需要子细胞置于细胞外基质中进行三维培养，并形成所需要的形状。的形状。将构建物移植机体。目前正在研究构建的组
20、将构建物移植机体。目前正在研究构建的组织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功并已应用于临角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功并已应用于临床治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病。床治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病。细胞化学术软骨组织工程研究进展软骨组织工程研究进展实验中的组织工程实验中的组织工程“耳耳” CaoYL，etal:Transplantationofchondrocytesutilizingapolymer-cellconstructtoproducetissueengineeredcartilagein
21、theshapeofahumanear PlasticReconstrSurg,1977,100:297 细胞化学术细胞化学术实验中的组织工程实验中的组织工程“耳耳”制备程制备程序序1、将人的耳廓印下来，制成石膏软件。将人的耳廓印下来，制成石膏软件。2 2、生物材料（聚乙醇酸）形成耳廓模型。、生物材料（聚乙醇酸）形成耳廓模型。3 3、取小牛关节软骨细胞，加入到耳廓模型、取小牛关节软骨细胞，加入到耳廓模型 中，体外细胞培养中，体外细胞培养 (1 (1周）。周）。4 4、将耳模型植入到裸鼠背部。、将耳模型植入到裸鼠背部。5 5、4 4周后生长形成与人耳外形相同的周后生长形成与人耳外形相同的“人耳人
22、耳”。细胞化学术5形态计量术形态计量术形态计量术形态计量术是研究组织和细胞内各种有形成分的数量、是研究组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等项的绝对或相对值的方法。研究机体某些体积、表面积等项的绝对或相对值的方法。研究机体某些结构的立体数值的科学，称为结构的立体数值的科学，称为体视学体视学数值以数值以“量量”的概念的概念进一步阐述了结构与功能关系及其病理状态下发生的变化。进一步阐述了结构与功能关系及其病理状态下发生的变化。目前常用的精密定量方法有以下几种：目前常用的精密定量方法有以下几种：（1）显微分光光度术显微分光光度术显微分光光度术是显微镜技术与分光光度技术的结合，可显微分光光度术
23、是显微镜技术与分光光度技术的结合，可测出细胞内各种化学成分的含量，如测定蛋白质、酶、脂测出细胞内各种化学成分的含量，如测定蛋白质、酶、脂类、糖及类、糖及DNA与与RNA等含量。等含量。细胞化学术（2）显微荧光光度术显微荧光光度术显微荧光光度术显微荧光光度术是利用对细胞内原有发荧光的物质，是利用对细胞内原有发荧光的物质，或对细胞内各种化学成分用不同荧光素标记后，进或对细胞内各种化学成分用不同荧光素标记后，进行定性、定位和定量的测量。行定性、定位和定量的测量。（3）流式细胞术流式细胞术流式细胞术流式细胞术是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进行快速定量分析与分选技
24、术。同时可测量一个细胞行快速定量分析与分选技术。同时可测量一个细胞8个个相关参数，测速可达相关参数，测速可达5000个细胞个细胞/秒，分选纯度可高达秒，分选纯度可高达99%以上。以上。细胞化学术（4）图像分析术图像分析术是把计算机、电视和数字图像是把计算机、电视和数字图像处理等结合在一起的一种新技术，可快速处理等结合在一起的一种新技术，可快速准确地测量组织切片或电镜照片中的微细准确地测量组织切片或电镜照片中的微细结构，通过软件程序获得各项数据。也可结构，通过软件程序获得各项数据。也可测量组织化学染色切片，根据染色深浅而测量组织化学染色切片，根据染色深浅而提供该物质含量的相对数值。还可以根据提供该物质含量的相对数值。还可以根据连续的组织切片应用计算机进行三维重建，连续的组织切片应用计算机进行三维重建，该仪器使用面广泛，所得数据迅速、准确。该仪器使用面广泛，所得数据迅速、准确。避免人为因素。避免人为因素。细胞化学术小小结结:简述细胞化学的原理及常用的几种方法简述细胞化学的原理及常用的几种方法?名词解释名词解释:PAS反应反应组织培养术组织培养术流式细胞术流式细胞术组织工程组织工程原位杂交原位杂交形态计量术形态计量术图像分析术图像分析术细胞化学术 谢谢 谢！谢！细胞化学术
