《MSI检测技术ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《MSI检测技术ppt课件（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、MSI 检测技术检测技术1v微卫星简要介绍v现用微卫星检测技术流程v多重荧光PCR技术概略介绍v毛细管电泳概略介绍v微卫星检测的临床检测可行性MSI 检测技术摘要检测技术摘要2MSvSimple repeat sequences of 1 to 6 base pairs单核苷酸型:AAAAAAAA.双核苷酸型:ATATATAT.三核苷酸型:ATCATCATC. .3MSvProne to replication errorsDefection of MMR MS instabilityLSSporadic MSILS4MS 错错误误产产生生机机制制Stutter 又被称为影子带，或者DNA聚合
2、酶滑脱产物。表现为PCR产物比主要扩增产物增加或减少一个或几个重复单位。 5MSI MAKERS IN LSv National Cancer Institutesponsored workshop in 1997 2 mononucleotide repeats(BAT25 and BAT26) 3 dinucleotide repeats (D2S123,D5S346, and D17S250) vRevised in 20025 mononucleotide repeats(BAT25, BAT26,NR-21, NR-22, and NR-24)vPromega MSI Analysi
3、s System 5 mononucleotide repeats(BAT25, BAT26,MONO-27, NR-21 and NR-24） 2 pentanucleotide repeats(Penta-C and Penta-D)criteriaMSI-H Replication errors2 makersMSI-L 1MSS 06实验流程实验流程v1、基因DNA的提取v2、多重荧光PCRv3、毛细管电泳检测v4、分析数据7基因基因DNA的提取流程的提取流程Promega试剂盒法试剂盒法分别挑选正常、肿瘤组织显微切割8多重荧光多重荧光PCRDisease Markers 20 (20
4、04) 237250Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan上游引物的5端作荧光标记JOEGreen FL Blue TMRBlack9多重荧多重荧光光PCRPCR反应体系（反应体系（25l）：）：2.5l GoldSTR 10X Buffer0.1-1 M each primers 0.05 l AmpliTaq Gold DNA Polymerase(5Units/ l)1-2ng DNAPCR条件：条件：1 cycle 95C for 11minutes; 1 cycle 96C for 1 minute;10 cycles 94C for 30 sec-
5、onds, ramp 6 seconds to 56C, hold for 30 seconds,ramp 50 seconds to 70C, hold for 45 seconds; 20 cycles at 90C for 30 seconds, ramp 60 seconds to 56C,hold for 30 seconds, ramp 50 seconds to 70C, hold for45 seconds; 60C for 30 minutes final extension; 4C hold.Disease Markers 20 (2004) 237250Jeffery W
6、. Bacher, Laura A. Flanagan10毛细管电泳检测、分析毛细管电泳检测、分析v微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后，取适量PCR产物、分子内标(ILS 600)溶于缓冲液（甲酰胺）中经遗传分析仪毛细管电泳进行扫描，通过检测片段长度来判断微卫星不稳定性。v利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析，计算出微卫星等位变异扩增片段的大小。Promega MSI Analysis System, Version 1.211横坐标代表片段长度 纵坐标代表荧光强度12多重荧光多重荧光PCR优点优点v多重PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，同时
7、扩增多个序列，从而产生高度特异性的反应过程，该技术对DNA模板要求量小、高通量分析且省时、省力、省材。v应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠，极大的提高效率。13多重荧光多重荧光PCR前提条件前提条件v所有引物对的退火温度必须接近；v在同一反应体系中，所有引物对之间不能有相互作用（形成引物寡聚体）；v同色引物扩增产物应长度有别，这样才可同时对多个位点进行片段分析。14毛细管电泳毛细管电泳清洗毛细管 更换电泳缓冲液进样电泳并同时在线检测操操作作步步骤骤15毛细管电泳优点毛细管电泳优点v荧光标记毛细管电泳(FCE) 快速、准确、敏感性强、可重复性好、结果易分析、高通量检测、客观性强
8、v聚丙烯凝胶电泳加放射显影或银染 (传统方法）费时、步骤繁琐、判断结果主观性较强16MSI 直肠癌的临床检测可行性直肠癌的临床检测可行性v99% con-cordance with IHCvNearly 100% accuracy vLower cost bacause of the use of a single multiplex fluorescent MSI assayvFind out those misclassified only based on IHC (about 5% MSI-H tumors had normal levels of four MMR proteins
9、)Disease Markers 20 (2004) 237250Jeffery W. Bacher, Laura A. Flanagan1718关于突变的一些概念关于突变的一些概念vGermline mutation ：由父母传给后代的突变，由于此种突变发生在精细胞和卵细胞中，故称为生殖系突变。vConsititutive mutation :突变发生在配子或合子过程中，并且这种突变在合子分裂过程中得以保留，导致个体所有组织、所有细胞均含有突变。vMosaic mutation：突变发生在合子分裂之后的胚胎早期（几个细胞或几十个细胞），若其中一个细胞含有突变，那么由此细胞分裂形成的组织/器官就会携带此突变（如果不涉及生殖细胞则称为体细胞镶嵌突变）。19
