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1、基因功能研究王光明临床医学院病理科DNA水平RNA水平蛋白质水平DNA测序基因芯片实时定量PCR原位杂交Southern blotting 基因敲除和转基因RNA测序RNA芯片定性、定量PCR原位杂交Northern blotting 基因沉默蛋白质测序蛋白质芯片免疫组化、免疫荧光、免疫印迹酶活性免疫共沉淀蛋白质晶体结构免疫共沉淀EMSASuper-EMSAPromoter分析基因表达基因表达(gene expression)-基因转录及翻译的过程。基因转录及翻译的过程。rRNA、tRNA的合成属于基因表达的合成属于基因表达中心法则：中心法则：核酸分子杂交技术概念分子杂交（hybridizat
2、ion）：有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补配对形成稳定的双链分子的过程。印迹（blotting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体支持物上的过程。探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或者RNA片段种类固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定在固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交液相杂交（solution hybridization）指使变性的待测核酸单链与已知的核酸单链（探针）在溶液中保温，使
3、之形成杂交复合物DNA与DNA杂交RNA与RNA杂交DNA与RNA杂交几种常见的杂交分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被检测的对象，分子杂交可以分为：Southern杂交：检测DNA，探针为DNA或者RNANorthern杂交：检测RNA，探针为DNA或者RNA3.3.分类（常用分子杂交技术）分类（常用分子杂交技术）1969 ，In situ hybridization（ISH）1975，Southern，Southern blotting: DNA印印记记1977，Alwine，N
4、orthern blotting：RNA印记印记1979，Towbin，Western blotting：蛋白质印记：蛋白质印记基因芯片基因芯片复性RNADNA影响Southern杂交能否检出杂交信号的因素1、目的DNA在总DNA中所占的比例2、探针的大小和比活性3、转移到滤膜上的DNA的量4、探针与目的DNA的配对情况（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA酶切酶切硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段放射自显影或成像放射自显影或成像电泳电泳印记转移印记转移（转膜）（转膜）SouthernSouthern实验实验步骤示意图步骤示意图S
5、outhern的应用的应用 检测样品中的检测样品中的DNA插入的拷贝数，插入的拷贝数，了解基因的状态了解基因的状态, 如是否有点突变、扩如是否有点突变、扩增重排等。增重排等。 Sourthern杂交分析转基因拷贝数Northern blottingNorthern blotting1 1发展发展 J.C.AlwineJ.C.Alwine等人发展而来，是将等人发展而来，是将RNARNA分子从分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与法。由于这种方法与Sou
6、rthernSourthern杂交技术十分类杂交技术十分类似，所以叫做似，所以叫做Northern blottingNorthern blotting。 Northern的应用的应用检测样品中是否有基因的转录产物检测样品中是否有基因的转录产物及其含量。及其含量。SBEIIIWTSBEIII OX WTSBEIII OX 3 检测基因的表达水平检测基因的表达水平-Northern的应用实例的应用实例三三种种分分子子杂杂交交技技术术的的比比较较SouthernNorthernWestern原位杂交原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与细胞或组织中
7、的细胞或组织中的核核酸进行杂交，称为原位杂交。酸进行杂交，称为原位杂交。特点特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能状态核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤A.细胞或组织的原位杂交细胞或组织的原位杂交 检测特异检测特异mRNA是否存在。是否存在。步骤步骤： 细胞或组织的固定后置于载玻片上细胞或组织的固定后置于载玻片上 组织细胞杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理用去垢剂
8、或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记探针的选择和标记 杂交杂交 杂交结果检测杂交结果检测菌落原位杂交对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时采用。B.菌落或噬菌斑的原位杂交：构建基因文库时，菌落或噬菌斑的原位杂交：构建基因文库时，菌落或噬菌斑转移到菌落或噬菌斑转移到NC膜上进行杂交膜上进行杂交斑点杂交将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。生物芯片生物芯片1 1 概念概念 采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子有序地固化于支持物的表面，组成密集二
9、维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。芯片发展历史芯片发展历史Southern & Northern Southern & Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarray芯片种类芯片种类 按固定分子：按固定分子： 基因芯片基因芯片(Gene Chip)(Gene Chip) 蛋白质芯片蛋白质芯片(Protein Chip)(Protein Chip) 细胞（组织）芯片（细胞（组织）芯片（Cell/tissue
10、ChipCell/tissue Chip） 根据用途根据用途 信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。芯片特点芯片特点优点：优点：微型化微型化 ：平方厘米大小，实验所需试剂用量少：平方厘米大小，实验所需试剂用量少高通量：一次检测数万个分子高通量：一次检测数万个分子自动化自动化标准化标准化 ： 传统方法检测众多基因要经历多次实传统方法检测众多基因要经历多次实 验，因而每次实验之间是存在系统误差的。验，因而每次实验之间是存在系统误差的。缺点：缺点： 在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不 同。同。生
11、物芯片的应用基因表达水平的检测基因表达水平的检测 基因诊断基因诊断药物筛选药物筛选个体化医疗个体化医疗测序测序生物信息学研究生物信息学研究1.芯片制备芯片制备2.样品制备样品制备3.分子杂交分子杂交4.检测分析检测分析（二）芯片分析基本流程（二）芯片分析基本流程1生物芯片的制作生物芯片的制作玻璃片（最常用的材料）玻璃片（最常用的材料）聚丙烯酰胺板聚丙烯酰胺板金属片金属片硅片硅片1.1 1.1 载体的材料载体的材料1.2 1.2 芯片的制作方法芯片的制作方法基因芯片的制基因芯片的制作方式作方式原位合成原位合成直接点样直接点样提取DNA或RNA，PCR或RT-PCR扩增，掺入荧光染料标记。与Nor
12、thern和Southern杂交的区别：样品标记而不是探针标记2 2 样品的制备样品的制备样品与样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：与经典分子杂交的区别：1.杂交时间短，杂交时间短，30分钟内完成分钟内完成2.可同时平行检测许多基因序列可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构二级结构3 3 杂交杂交过程类似于一般的杂交法。过程类似于一般的杂交法。1) hybridizeApply sample2) rinse4 4 检测分析检测分析1.激光激发使含荧光标记的
13、激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧片段发射荧光光2.激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号交点的信号3.软件进行进行图象分析和数据处理软件进行进行图象分析和数据处理4 4 检测分析检测分析Laser 1Laser 2Detector 1Detector 2Scanner芯片的扫描5.5.图像处理图像处理Detector 1Detector 2False-color differential image图 像 分 析基因芯片应用基因芯片应用 基因表达谱（基因表达谱（gene expression pattern)BiologicalBiologic
14、alSampleSampleFunctionalFunctional Information Information红色红色 上调上调黄色黄色 不变不变绿色绿色 下调下调生物芯片生物芯片（biochipbiochip）的概念）的概念 指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂
15、交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。的数量。DNA Chip TechnologySolid support (glass, plastic, metal, silicon)Miniaturized array of DNA (genetic material)Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationHybridized probes (DNA molecules) ar
16、e fluorescently labeled生物芯片的主要特点：生物芯片的主要特点： 高通量、微型化和自动化高通量、微型化和自动化生物芯片的分类：生物芯片的分类：基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室 1.基因芯片（基因芯片（Genechip） 又称又称DNA芯片芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析布来进行分析 。2. 蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip) 利用抗体与抗
17、原特异性结合即免疫反应的原理利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子将蛋白质分子（抗原或抗体抗原或抗体）结合到固相支持物结合到固相支持物上上，形成蛋白质微阵列形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片即蛋白质芯片 。 3.芯片实验室芯片实验室(labs-on-chip) 高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统及检测为一体的便携式生物分析系统 实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化 芯片实验室是生
18、物芯片技术发展的最终目标芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标 DNA芯片技术包括四个主要步骤芯片技术包括四个主要步骤芯片的设计与制备芯片的设计与制备样品制备样品制备杂交反应和信号检测杂交反应和信号检测结果分析结果分析基基 因因 芯芯 片片 流流 程程样品制备样品制备芯片制备芯片制备杂交杂交杂交信号检测杂交信号检测数据分析数据分析基因芯片技术在医学中的应用基因表达分析基因型、基因突变和多态性分析疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤药物筛选指导医院及治疗方案预防医学蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip） 又称蛋白质微阵列又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多是指以蛋白质或多肽作为配基肽作为配基
19、,将其有序地固定在固相载体的将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记荧光的蛋白质或表面形成微阵列；用标记荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。其它分子之间的相互作用关系。 根据制作方法和应用的不同，蛋白质芯片分为根据制作方法和应用的不同，蛋白质芯片分为两种两种:蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 细胞中的每一种蛋白质占据芯片上一个确定的细胞中的每一种蛋白质占据芯片上一个确定的
20、点，主要是高度平行地检测天然蛋白质活性点，主要是高度平行地检测天然蛋白质活性 。蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片将能够识别复杂生物溶液（如细胞提取液）中将能够识别复杂生物溶液（如细胞提取液）中靶多肽的高度特异性配体进行点阵，这种芯片靶多肽的高度特异性配体进行点阵，这种芯片能够高度并行的检测生物样品中的蛋白质能够高度并行的检测生物样品中的蛋白质 。 蛋白质芯片技术在医学中的应用蛋白质芯片技术在医学中的应用1.特异性抗原抗体的检测特异性抗原抗体的检测 2.生化反应的检测生化反应的检测 3.疾病诊断疾病诊断 4.疾病分子机制的研究疾病分子机制的研究 5.药物筛选及新药的研制开发药物筛选及新药的研制开发
21、基因表达谱（基因表达谱（gene expression pattern)BiologicalBiologicalSampleSampleFunctionalFunctional Information Information红色红色 上调上调黄色黄色 不变不变绿色绿色 下调下调基基 因因 芯芯 片片 的的 应应 用用1 1 基因表达分析：基因表达分析： 分析基因表达时空特征分析基因表达时空特征 检测基因差异表达检测基因差异表达 发现新基因发现新基因 大规模测序大规模测序2 2 基因型、基因突变和多态性分析基因型、基因突变和多态性分析 分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系分析基因组中不同基因与
22、性状或疾病的关系 3 3 疾病的诊断与治疗疾病的诊断与治疗 遗传病相关基因的定位遗传病相关基因的定位: :产前筛查与诊断产前筛查与诊断 肿瘤诊断肿瘤诊断 感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 4 4 药物研究中的应用药物研究中的应用 新药开发新药开发 发现药物的新功能发现药物的新功能 调查药物处理细胞后基因的表达情况调查药物处理细胞后基因的表达情况 对药物进行毒性评价对药物进行毒性评价 5 5 基因芯片在中医学领域中的应用基因芯片在中医学领域中的应用 药物筛选药物筛选 中医中医“证证”本质的研究本质的研究 针灸原理研究针灸原理研究 6 6 其它应用其它应用 环境化学毒物的筛选环境化学毒物的筛选 体
23、质医学的研究体质医学的研究 基 因启 动 子转录调控因子的结合位点PPARRXRPPAR binding site SOD3 promotor sequenceCo-activators基因检测1、常规PCR（定性或者半定量）2、定量PCR：Real-timePCR1）反应体系中含有SYBR Green I荧光染荧光染料料2）标记特异的探针：TaqMan探针探针常规常规PCR与定量与定量PCR的比较的比较 外标准方法外标准方法 在在扩扩增增检检测测待待测测样样本本的的同同时时，扩扩增增一一系系列列稀稀释的已知标准（通常为质释的已知标准（通常为质粒粒DNA）如如果果在在该该标标准准稀稀释释系系列
24、列范范围围内内，扩扩增增产产物物/模模板板成成线线性性相相关关，则则可可推推导导出出同同时时扩扩增增的的待待测样本中测样本中PCR模板的相对量模板的相对量 外标准方法外标准方法定量定量PCRPCR 外标准方法外标准方法优点：优点：方法简便，容易建立方法简便，容易建立使用双孔重复测定使用双孔重复测定可得到非常准确的结果可得到非常准确的结果甚至可排除管间的差异甚至可排除管间的差异不能排除样本间的差异不能排除样本间的差异定量定量PCRPCR 外标准方法外标准方法缺点缺点PCR反反应应体体系系的的微微小小区区别别也也会会对测定造成较大的影响对测定造成较大的影响在在扩扩增增效效率率上上的的差差异异，会会
25、使使定定量测定精密度和重复性不佳量测定精密度和重复性不佳操作麻烦操作麻烦荧光检测法原理原理荧光定量荧光定量PCR技术，是指在技术，是指在PCR反应体系反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的技术中，有一个很重要的概念概念 Ct值。值。C代表代表Cycle，t代表代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循的荧光信号到
26、达设定的域值时所经历的循环数环数 根据所使用的技术不同，荧光定量根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可又可以分为以分为TaqMan探针和探针和SYBR Green I荧光染荧光染料两种方法。料两种方法。 荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定和对数据精度的要求来决定 荧光染料法：荧光染料法：SYBR Green I是一种只与是一种只与DNA双链结合的荧双链结合的荧光染料。当它与光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；双链结合时，发出荧光；从从DNA双链上
27、释放出来时，荧光信号急剧减双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链了双链DNA分子的数量。分子的数量。 在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与增加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。 SYBR Green荧光染料法定量荧光染料法定量PCR
28、的基本过程是：的基本过程是：（1）开始反应，当）开始反应，当SYBR Green染料与染料与DNA双双链结合时发出荧光。链结合时发出荧光。（2）DNA变性时，变性时，SYBR Green染料释放出来，染料释放出来，荧光急剧减少。荧光急剧减少。（3）在聚合延伸过程中，引物退火并形成）在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。产物。（4）聚合完成后，）聚合完成后，SYBR Green染料与双链产染料与双链产物结合，定量物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大系统检测到荧光的净增量加大。 实时动态定量实时动态定量PCR真正的定量真正的定量PCR00.20.40.60.811.21.41.61.
29、822.2010203040cycle numberRnno template2000010000500020001000500100原理：原理：当溶液中有当溶液中有PCR产物时，该探针可与模板产物时，该探针可与模板的特异序列结合的特异序列结合当当Taq酶靠近探针时，酶靠近探针时， 激活激活了了Taq酶的外切酶的外切酶活性，将探针酶活性，将探针5 的的R切下，切下，R基团发出荧基团发出荧光光根据荧光强度计算初始模板的数量根据荧光强度计算初始模板的数量荧光探针法：荧光探针法：（1）TaqMan荧光探针：荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧
30、光探针，该探针为一寡核苷酸，特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与
31、荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。特异性荧特异性荧光双标记光双标记探针探针Taq酶酶 5 533外切酶活外切酶活性性基因敲除、转基因、基因沉默基因表达调控基因表达缺失特殊基因表达：比如荧光蛋白基因高表达常规敲除条件敲除无组织特异基因敲除组织特异质粒和病毒介导的基因表达常规敲入条件敲入无组织特异基因敲入组织特异基因沉默荧光蛋白表达病毒转染重组腺病毒腺相关病毒慢病毒逆转录病毒稳定转染瞬时转染质粒荧光蛋白的应用组织培养细胞培养肿瘤细胞动物体内试验基因沉默基因沉寂（基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被称也可以被称为为“基因沉默基因沉默”，是指，是指生物体中特定基因
32、由于生物体中特定基因由于种种原因不表达。基因种种原因不表达。基因沉寂是真核生物细胞基沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要因表达调节的一种重要手段。手段。 在染色体水平，在染色体水平，基因沉寂实际上是形成基因沉寂实际上是形成异染色质异染色质（Heterochromatin)的过程，被沉寂的基因的过程，被沉寂的基因区段呈高浓缩状态。区段呈高浓缩状态。基因敲除基因敲除和基因嵌入技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入
33、受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。目前用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。 ZFN 技术原理技术原理锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。新技术介绍新技术介绍CRISPR-CRISPR-CasCas系统基因系统基因修饰技术修饰技术
