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1、化学发光免疫化学发光免疫 分析技术分析技术内内容容第一节第一节概述概述一、发光的分类一、发光的分类二、化学发光产生的条件二、化学发光产生的条件三、化学发光效率三、化学发光效率四、化学发光免疫技术的分类四、化学发光免疫技术的分类五、化学发光免疫分析的非均相分离方式五、化学发光免疫分析的非均相分离方式第二节第二节化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术一、化学发光剂一、化学发光剂二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术第三节第三节化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析三、电化学发
2、光免疫分析四、鲁米诺氧途径免疫分析四、鲁米诺氧途径免疫分析第四节第四节化学发光免疫测定的临床应用化学发光免疫测定的临床应用发光免疫分析发光免疫分析: :是将发光分析和免疫反应相结是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测合而建立起来的一种新的检测微量微量抗原或抗体抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。的新型标记免疫分析技术。特点：特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、快速、特异性高、敏感性高、分离简便、快速、 试剂无毒、安全稳定、可自动化。试剂无毒、安全稳定、可自动化。第一节第一节 概概 述述发光发光:是指分子或原子中的电子是指分子或原子中的电子吸收能量吸收能量后，由后，由基态（较低能级
3、）跃迁到激发态（较高能级），基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并然后再返回到基态，并释放光子释放光子的过程。的过程。 光照发光光照发光：指发光剂（荧光素）经能量较高的指发光剂（荧光素）经能量较高的短波长短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出能量较低的复至基态时，发射出能量较低的较长波长较长波长的可见光（荧的可见光（荧光）的过程。光）的过程。 生物发光生物发光：指发生在生物体内的发光现象指发生在生物体内的发光现象 化学发光化学发光：指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象指伴随化学反应过程所
4、产生的光的发射现象一、发光的分类一、发光的分类（能量来源不同能量来源不同） 荧光素酶荧光素酶ATP；O2；Mg2+激发态氧激发态氧化型荧光素化型荧光素萤火虫荧光素萤火虫荧光素光光+AMP+O2+CO2+萤火虫发光萤火虫发光腰鞭毛虫腰鞭毛虫水母水母深海鱼发光深海鱼发光返返回回 概念概念：是指伴随化学反应过程所产生的光的发射是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。现象。某某些物质些物质( (发光剂发光剂) )在在化学反应化学反应时，吸收了反应过时，吸收了反应过程中所产生的程中所产生的化学能化学能，使反应的产物分子或中间态分子，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到
5、基态时，中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以以发射光子发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。化学发光化学发光化学发光与荧光的化学发光与荧光的区别区别：形成激发态分子的激发能不同：形成激发态分子的激发能不同关键步骤关键步骤化学发光化学发光的条件的条件反应必须提供足够的能量反应必须提供足够的能量（170300KJ/mol)化学能必须能被某种物质分子吸收而产生化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发，且有足够的光量子产率电子激发，且有足够的光量子产率大多数化学发光反应为大多数化学发光反应为氧化氧化-还原反应还原反应化学激发化学激发
6、发光发光二、化学发光产生的条件二、化学发光产生的条件(首要条件首要条件)化学发光产生的条件化学发光产生的条件步骤步骤：化学反应生成中间体；化学能转化为电子激发能使中：化学反应生成中间体；化学能转化为电子激发能使中间体变成电子激发态；激发态分子辐射光子回复到基态。间体变成电子激发态；激发态分子辐射光子回复到基态。直接化学发光直接化学发光:间接化学发光间接化学发光:A+BC*C* C+h.A+BC*C* +DC+D*D* D+h.三、化学发光效率三、化学发光效率l发光剂在反应中的发光分子数发光剂在反应中的发光分子数/参加反应的参加反应的分子数分子数l由由发光物质的性质决定发光物质的性质决定四、化学
7、发光免疫技术的分类四、化学发光免疫技术的分类l标记物是否需要分离标记物是否需要分离l是否直接发光是否直接发光l反应模式不同反应模式不同l标记物不同标记物不同五、非均相分离方式五、非均相分离方式l固相分离固相分离l过滤分离过滤分离l珠式分离珠式分离l顺磁性颗粒分离（顺磁性颗粒分离（首选首选）第二节第二节 化学发光剂和标记技术化学发光剂和标记技术 在在化化学学发发光光反反应应中中参参与与能能量量转转移移并并最最终终以以发发射射光子的形式释放能量的化合物光子的形式释放能量的化合物一、一、化学发光剂（发光底物）化学发光剂（发光底物）直接化学发光剂直接化学发光剂间接化学发光剂间接化学发光剂能作为化学发光
8、剂的条件：能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；发光的量子产率高；物理物理- -化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。 1. 1. 吖啶酯吖啶酯 在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化时氧化时, ,发出波发出波长为长为470nm470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产的光，具有很高的发光效率，其激发态产物物N-N-甲基吖啶
9、酮甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。是该发光反应体系的发光体。 直接化学发光剂直接化学发光剂-可直接标记抗原或抗可直接标记抗原或抗体体2 2三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)RU(bpy)3 3 2+2+是是电化学发光剂电化学发光剂，它和，它和电电子供体三丙胺（子供体三丙胺（TPATPA）在在阳电极表面阳电极表面可同时失去一可同时失去一个电子而发生氧化反应。个电子而发生氧化反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反应原理电化学发光剂反应原理 1 1、酶促反应发光剂、酶促反应发光剂HRPHRP的发光底物：的发光底物：鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 ALPALP的发光底物
10、：的发光底物：AMPPDAMPPD间接化学发光剂间接化学发光剂酶酶 标记抗体或标记抗体或抗原，需酶催化后发光抗原，需酶催化后发光（1 1）鲁米诺）鲁米诺（最早合成）（最早合成） 鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理（2 2） AMPPDAMPPD3-(23-(2- -螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3- -磷酰氧基磷酰氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷2 2、酞箐、二甲基噻吩衍生物及、酞箐、二甲基噻吩衍生物及EuEu螯合物螯合物l通过活性离子氧传递连接的间接化学发光剂通过活性离子氧传递连接的间接化学发光剂l核心原理核心原理：高能态离子氧的产生和传
11、递：高能态离子氧的产生和传递酞箐结构酞箐结构680nm激发光激发光离子氧离子氧200nm范围内范围内二甲基噻吩衍生物二甲基噻吩衍生物紫外光紫外光Eu螯合物螯合物激发激发612nm光光二、发光剂的标记技术二、发光剂的标记技术通过通过化学反应化学反应将发光剂连接到抗体或抗原将发光剂连接到抗体或抗原l直接偶联：通过偶联反应，使标记物分子中反应基直接偶联：通过偶联反应，使标记物分子中反应基团直接连接到被标记物分子的反应基团上团直接连接到被标记物分子的反应基团上.碳二亚胺（碳二亚胺（EDC）缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法）缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法 l间接偶联：用功能交联剂在标记物和被标
12、记物之间间接偶联：用功能交联剂在标记物和被标记物之间插入一条链或一个基团，使之连接成结合物插入一条链或一个基团，使之连接成结合物琥珀酰亚胺活化法琥珀酰亚胺活化法1. 1. 碳二亚胺（碳二亚胺（EDCEDC）缩合法）缩合法 经缩合反应，蛋白质分子中的游离羧基与发光剂中的氨基形成稳定的酰胺键经缩合反应，蛋白质分子中的游离羧基与发光剂中的氨基形成稳定的酰胺键用于结构中有羧基或氨基的标记物用于结构中有羧基或氨基的标记物2. 2. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 用于含有芳香伯胺和脂肪伯胺的发光剂用于含有芳香伯胺和脂肪伯胺的发光剂不适于无糖基的蛋白质不适于无糖基的蛋白质3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 蛋白
13、质中能偶合重氮盐的位置：酪氨酸残基蛋白质中能偶合重氮盐的位置：酪氨酸残基的邻位酚羟基的邻位酚羟基组氨酸残基的咪唑环组氨酸残基的咪唑环色氨酸残基的吲哚环色氨酸残基的吲哚环4. N-4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 蛋白质分子中的羧基被活化后与发光剂的氨基偶联形成酰胺键蛋白质分子中的羧基被活化后与发光剂的氨基偶联形成酰胺键 1 1发光剂的选择发光剂的选择 2 2被标记蛋白质的性质被标记蛋白质的性质 3 3标记方法的选择标记方法的选择 4 4原料比原料比 5 5标记率标记率 6 6温度温度 7 7纯化与保存纯化与保存 影响标记的因素影响标记的因素第三节第三节 化学发光免疫分析的类型
14、化学发光免疫分析的类型 用用化学发光剂（如吖啶酯）化学发光剂（如吖啶酯）直接标记直接标记抗体抗体( (抗原抗原) )，与待测标，与待测标本中相应的抗原本中相应的抗原( (抗体抗体) )发生免疫反应后，形成固相包被抗体发生免疫反应后，形成固相包被抗体- -待测待测抗原抗原- -发光剂标记抗体复合物，加入氧化剂（发光剂标记抗体复合物，加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱使成碱性环境，性环境，化学发光剂（化学发光剂（吖啶酯）在吖啶酯）在不需要催化剂不需要催化剂的情况下分解、发的情况下分解、发光光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子由集光器和光电倍增管
15、接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成比例，可从标准曲线上计算能，这部分光的积分与待测抗原的量成比例，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析吖啶酯化学发光的特点吖啶酯化学发光的特点 标记物：吖啶酯及其衍生物标记物：吖啶酯及其衍生物底物：底物：Pre-trigger（双氧水）（双氧水）/trigger（氢氧化钠）（氢氧化钠）固相载体：顺磁性微粒固相载体：顺磁性微粒 分离：电磁场分离：电磁场Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY
16、YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点l抗原和抗体结抗原和抗体结合与未合与未结合部结合部分分的的易易分离分离化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法）化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法） ARCHITECT-i2000ARCHITECT-i2000化学发光微粒子免疫分析化学发光微粒子免疫分析化学发光微粒子免疫分析化学发光微粒子免疫分析化学发光免疫测定仪化学发光免疫测定仪 CLEIACLEIA是用参与催化某一化学发光反应的是用参与催化某一化学发光反应的酶标记抗原酶标记抗原或抗体或抗体，在与待测标本中相应的抗原，在与待测标本中相应的抗
17、原( (抗体抗体) )发生免疫反应发生免疫反应后后，形成固相包被抗体，形成固相包被抗体- -待测抗原待测抗原- -酶标记抗体复合物，经酶标记抗体复合物，经洗涤后，加洗涤后，加入入底物底物( (发光剂发光剂) )，酶，酶催催化和分解底化和分解底物物发光。发光。 由由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析（CLEIACLEIA）化学发光酶免疫分析的特点化学发光酶免
18、疫分析的特点 标记物：酶（标记物：酶（HRPHRP、ALP)ALP) 底物底物( (发光剂）：发光剂）：HRP-HRP-鲁米诺鲁米诺 ALP-AMPPDALP-AMPPD 固相载体：磁性微粒、固相载体：磁性微粒、塑料珠、塑料锥形小管塑料珠、塑料锥形小管 分离：磁场、高速离心分离：磁场、高速离心辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 VitrosECi全自动增强化学发光酶免分析仪全自动增强化学发光酶免分析仪 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 IMMULITEIMMULITE 10001000型全自动型全自动任选式酶
19、放大任选式酶放大化学发光免疫化学发光免疫分析系统分析系统AccessAccess全自动微粒子酶放大全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系化学发光免疫分析系统统 是以是以电化学发光剂电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体三联吡啶钌标记抗体( (抗原抗原) )，以，以三丙胺三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体为电子供体, ,在电场中因在电场中因电子转移电子转移而发生特异而发生特异性化学发光反应，它包括性化学发光反应，它包括电化学和化学发光电化学和化学发光两个过程。两个过程。 三、电化学发光免疫分析（三、电化学发光免疫分析（ECLIAECLIA）电化学发光免疫分析的特点电化学发光免疫分析的特点l在在电极表面电
20、极表面因因电子转移电子转移而发生的特异性化学发光而发生的特异性化学发光反应，包括了反应，包括了电化学电化学和和化学发光化学发光两个部分。两个部分。l电化学反应：电化学反应：三联吡啶钌：标记抗体三联吡啶钌：标记抗体/抗原抗原TPA（三丙胺）：电子供体（三丙胺）：电子供体l磁性微粒子固相磁性微粒子固相l亲和素亲和素- - 生物素间接包被，生物素间接包被，使检测的灵敏度大大使检测的灵敏度大大提高。提高。样本盘型样本架型Elecsys1010Elecsys2010E170电化学发光免疫检测系统（电化学发光免疫检测系统（Elecsys)Elecsys)电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图EC
21、LIA体系结构图体系结构图ECLIAECLIA检测流程图一检测流程图一（双抗体夹心的形成）（双抗体夹心的形成）ECLIAECLIA检测流程图二检测流程图二 （生物素与亲和素结合）（生物素与亲和素结合）ECLIAECLIA检测流程图三检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）（磁珠吸引吸附于电极表面）ECLIAECLIA检测流程图四检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）（电极充电启动电化学反应）电极表面的电化学发光反应电极表面的电化学发光反应ECLIAECLIA检测流程图五检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）（撤消磁场冲洗磁珠）四、鲁米诺氧途径免疫分析四、鲁米诺氧途径免疫分析（LOCI）l均相反应
22、均相反应模式模式l核心原理核心原理：高能态离子氧的产生和传递：高能态离子氧的产生和传递l两个微粒两个微粒：感光珠：内含酞箐（鲁米诺类化学发光物质）感光珠：内含酞箐（鲁米诺类化学发光物质）发光珠：内含二甲基噻吩衍生物及发光珠：内含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物螯合物l反应基础：两种微粒相互接近的化学能量传递反应基础：两种微粒相互接近的化学能量传递l感光微粒感光微粒在在680nm激发光激发光下能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧下能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧l在在200nm范围之内范围之内，发光微粒发光微粒中的二甲基噻吩衍生物接受高能态离子中的二甲基噻吩衍生物接受高能态离子氧产生紫外光并激发
23、氧产生紫外光并激发Eu螯合物，发出螯合物，发出612nm的光。的光。 分别包被分别包被2个抗体个抗体发射光发射光612nm发光微发光微球球1O2AB激发光激发光680nm感光微球感光微球200nm200nml是是均相反应均相反应的模式，反应时间更短；的模式，反应时间更短；l反应过程有放大效应，发光迅速，保证了测定的敏感性；反应过程有放大效应，发光迅速，保证了测定的敏感性；l整个能量（光）的产生、传递和放大过程十分稳定，不易整个能量（光）的产生、传递和放大过程十分稳定，不易受受pH值、离子强度和温度的影响；值、离子强度和温度的影响；l可实现对多种生物分子的测定，包括酶的活性、受体可实现对多种生物
24、分子的测定，包括酶的活性、受体-配配体反应、低亲和力的反应、第二信使水平、体反应、低亲和力的反应、第二信使水平、DNA、RNA、蛋白质、多肽、碳水化合物等。蛋白质、多肽、碳水化合物等。LOCI的特点的特点 第第四节四节 临床应用临床应用思考题思考题l概念：发光免疫分析技术，发光，概念：发光免疫分析技术，发光，化学化学发光，化学发光剂发光，化学发光剂l常用发光剂及发光原理常用发光剂及发光原理l直接化直接化学发光免疫分析的原理、特点学发光免疫分析的原理、特点l化学发光酶免疫分析的原理、特点化学发光酶免疫分析的原理、特点l电化学发光免疫分析的原理、特点电化学发光免疫分析的原理、特点l鲁米诺氧途径免疫分析的原理、特点鲁米诺氧途径免疫分析的原理、特点
