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1、第三章 高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)高效液相色谱法(7)课件一、高效液相色谱中的速率方程 迁移的流动相高效液相色谱法(7)课件滞留的流动相高效液相色谱法(7)课件涡流扩散项涡流扩散项 纵向扩散纵向扩散 流动相传质流动相传质 滞留区传质滞留区传质 固定相内传质固定相内传质结论结论:提高柱效的关键是用小粒径填料：超高压液相提高柱效的关键是用小粒径填料：超高压液相UPLC流动相粘度流动相粘度,n：高温液相色谱：高温液相色谱低流速，高柱效低流速，高柱效高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件二、高效液相色谱仪1.仪器流程高效液
2、相色谱法(7)课件2. 检测器 v紫外检测器（紫外检测器（UVD）v示差折光检测器（示差折光检测器（RID）v荧光检测器（荧光检测器（FD）v蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD）v电化学检测器电化学检测器高效液相色谱法(7)课件n固定波长固定波长n可变波长可变波长n二极管阵列二极管阵列(DAD) (1)紫外检测器紫外检测器高效液相色谱法(7)课件A.A.固定波长的紫外检测器固定波长的紫外检测器高效液相色谱法(7)课件典型的流通池结构典型的流通池结构 高效液相色谱法(7)课件B. B. 可变波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器高效液相色谱法(7)课件C. C. 二极管阵列检测器二极管阵
3、列检测器高效液相色谱法(7)课件3-D plot of DAD高效液相色谱法(7)课件n可得到每个峰的光谱图可得到每个峰的光谱图n可进行谱库检索可进行谱库检索n可进行纯度检验可进行纯度检验n可进行多波长定量可进行多波长定量高效液相色谱法(7)课件D. D. 紫外检测器的特点紫外检测器的特点n选择性检测器n高灵敏度n线性宽n稳定n可做梯度nHPLC的常规检测器高效液相色谱法(7)课件通过选择合适的检测波长来提高方法的选择性通过选择合适的检测波长来提高方法的选择性高效液相色谱法(7)课件(2) 示差折光检测器示差折光检测器A. A. 结构结构高效液相色谱法(7)课件n通用 n灵敏度低n温度敏感n改
4、变流动相要重新平衡体系n不能做梯度B. B. 示差折光检测器的特点示差折光检测器的特点高效液相色谱法(7)课件(3) 荧光检测器荧光检测器高效液相色谱法(7)课件A. A. 结构结构高效液相色谱法(7)课件n高选择性n高灵敏度n干扰少n可做梯度n激发波长和发射波长皆可变化B. B. 特性特性高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件(4) 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD)A. A. 原理和结构原理和结构I=a.mblgI=blgm+lga1-色色谱柱；柱；2-喷雾气体；气体；3-蒸蒸发漂移管；漂移管；4-样品液滴；品液滴；5-激光光源；激光光源；6-光二极管光二极管检测器器7
5、-散射室散射室 高效液相色谱法(7)课件n通用型n灵敏度较高n方便n可梯度n响应与质量有关B. ELSDB. ELSD的特性的特性高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件(5) 电化学检测器电化学检测器nConductivity detection: 电导检测器电导检测器nDC Amperometric detection: 直流安培检测器直流安培检测器nIntegrated and pulsed amperometric：积分或脉冲积分或脉冲安培安培A. A. 分类分类高效液相色谱法(7)课件n选择性检测器n灵敏度高n电导检测器是离子色谱的常规检测器nDC a
6、mperometry: 神经化学类物质的检测 nPulsed amperometry:碳水化合物的检测B. B. 特点特点高效液相色谱法(7)课件3. 仪器附件nDegas Degas 脱气机脱气机nGradient Gradient 梯度装置梯度装置nColumn Thermostat Column Thermostat 柱温箱柱温箱nAuto sampler Auto sampler 自动进样器自动进样器nFraction collector Fraction collector 馏分收集器馏分收集器高效液相色谱法(7)课件梯度洗提n梯度洗脱即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂
7、强度按照特定的变化规律增加。n优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件溶剂溶剂A溶剂溶剂B电磁阀电磁阀A电磁阀电磁阀B混合室混合室泵泵溶剂溶剂A溶剂溶剂B高压泵高压泵A高压泵高压泵B混合室混合室低压溶剂梯度方框图低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图高效液相色谱法(7)课件n实现方式实现方式n对于复杂样品，线性梯度是最好的。对于复杂样品，线性梯度是最好的。n正相色谱中，常用二氯甲烷加入到正己烷中来实现。正相色谱中，常用二氯甲烷加入到正己烷中来实现。n反相色谱中，乙腈，甲醇加入到水中是最常用的。反相色谱中，乙腈，甲醇
8、加入到水中是最常用的。高效液相色谱法(7)课件三、三、HPLCHPLC主要类型及其选择主要类型及其选择 n化学键合相色谱法化学键合相色谱法n液固色谱法液固色谱法n离子对色谱法离子对色谱法n离子色谱法离子色谱法n体积排阻色谱法体积排阻色谱法高效液相色谱法(7)课件1. 键合相色谱法（1）键合相色谱法的分类和分离机理）键合相色谱法的分类和分离机理n正相色谱：正相色谱：流动相极性流动相极性固定相极性固定相极性 疏溶剂（水）作用机理疏溶剂（水）作用机理拓展知识：拓展知识：HILIC（亲水相互作用色谱）（亲水相互作用色谱）高效液相色谱法(7)课件反相键合相色谱法的 疏水机理： 溶质进入极性流动相(水）后
9、，其疏水基团由于水的斥力与非极性固定相上的烷基缔合，构成单分子吸附层。当流动相极性减小时，这种疏水斥力下降。高效液相色谱法(7)课件类型型分离方式分离方式应用特点用特点C-18C-18反相、离子反相、离子对普适性好，保留普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物中等极性化合物C-8C-8反相、离子反相、离子对与与C-18C-18类似，保留似，保留值略小略小C-3,C-4C-3,C-4反相反相保留保留值小，适合小，适合肽类和蛋白和蛋白质苯基苯基反相反相保留适中，保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化性不同。非极性、中等极性化合物合物-CN-CNHILIC
10、HILIC、正相、正相、选择性与硅胶性与硅胶类似，保留小，用途似，保留小，用途较广广-NH-NH2 2HILICHILIC、正相、正相分离糖分离糖类、核苷酸、固醇等、核苷酸、固醇等二醇基二醇基HILICHILIC、正相正相分离有机酸、排阻分蛋白分离有机酸、排阻分蛋白质等等醚基基反相、正相反相、正相分离酚分离酚类、芳硝基化合物，保留比、芳硝基化合物，保留比C-18C-18强强聚苯乙聚苯乙烯基基反相反相pHpH使用范使用范围广，广，对部分分离峰形好，寿命部分分离峰形好，寿命长（2）常常用固定相用固定相高效液相色谱法(7)课件固定相的碳链长度对保留时间的影响固定相的碳链长度对保留时间的影响高效液相色
11、谱法(7)课件固定相的商品牌号对分离的影响固定相的商品牌号对分离的影响高效液相色谱法(7)课件（3） 流流动相相表征溶剂特性的重要参数n溶剂强度：溶剂分子与吸附剂的亲合程度n溶解度参数：衡量溶剂极性强度的指标。是溶剂和溶质分子间色散力、偶极力、接受质子或给予质子能力的总和。相近的溶剂，选择性不同。n粘度：高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件溶剂的选择原则溶剂的选择原则具有稳定的化学性质；溶剂与检测器兼容 粘度要小；沸点不太低；纯度高且价格便宜n正正相相：正己烷/正庚烷为主体，加入质子受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷等 n反反相相：以水为主体，加入质子受体甲醇，
12、质子给体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。 高效液相色谱法(7)课件（4） 影响保留值的因素影响保留值的因素n溶质结构对保留值的影响：n正相：正相：溶质极性越强，官能团越多，保留值越大n反相：反相：溶质极性越弱，疏水性越强，保留值越大。溶质的保留值与其分子非极性部分的总面积有关，面积大，保留值大。高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件n烷基键合固定相特性对保留值的影响：n反相：键合相烷链长，k大，选择性好高效液相色谱法(7)课件n溶剂性质：n正相：溶剂极性越弱，保留越大n反相：流动相表面张力大、介电常数大，则极性越强。其斥力越大，溶质与固定相键合越强，保留值越大。高效液相色谱法(7)课件npH
13、值的影响n加入酸、碱或缓冲液，控制pH，抑制溶质的离子化，改善峰形。用于分析弱酸、碱。n盐的影响：n通常加入醋酸盐、硼酸盐、磷酸盐等。抑制溶质的离子化，改善峰型，抑制拖尾，提高保留时间的重复性。n影响流动相的表面张力，所以对中性化合物的保留时间也略有影响。高效液相色谱法(7)课件8种人参皂苷的k值与流动相离子浓度的关系高效液相色谱法(7)课件应用高效液相色谱法(7)课件2 2 离子对色谱法离子对色谱法 Ion-pair chromatography Ion-pair chromatography （1 1）基本原理）基本原理n将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（A A+ +
14、）相反的离）相反的离子子(B(B- -) )（称为对离子或反离子）加入到色谱系（称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱为反相离子对色谱 高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件（2 2）固定相、流动相和离子对试剂）固定相、流动相和离子对试剂n固定相：固定相：多为多为C18,C8C18,C8反相键合相反相键合相n流流动动相相：是是以以水水为为主主的的缓缓冲冲液液，或或水水- -甲甲醇醇、水水- -乙腈等混
15、合溶剂乙腈等混合溶剂n离离子子对对试试剂剂：四四丁丁基基铵铵正正离离子子、十十六六烷烷基基三三甲甲基基铵正离子，铵正离子，ClOClO4 4- -，十二烷基磺酸根等，十二烷基磺酸根等高效液相色谱法(7)课件 （3） 影响保留值的因素影响保留值的因素npH的影响：改善分离选择性的有效方法。 反相中，对于阴离子的分离，pH下降，k减小。n离子对试剂的性质与浓度：反相中，离子对试剂烷基链越长，疏水性越大，k越大。n溶剂的极性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脱强度增大，k下降。洗脱强度与极性参数、介电常数同时相关n离子强度：反相中，离子强度增加，溶质k下降高效液相色谱法(7)课件（4 4）应用）应用
16、 有有机机酸酸、有有机机碱碱特特别别是是强强酸、强碱酸、强碱的分析：的分析：如如羧羧酸酸、磺磺酸酸、胺胺类类、酚酚类类、药物、染料等药物、染料等反相离子对色谱分析有机酸固定相：C18烷基键合相流动相：0.03mol/L四丁基铵+戊醇 1. 4-氨基苯甲酸；2. 3-氨基苯甲酸；3. 4-羟基苯甲酸； 4. 3-羟基苯甲酸；5. 苯磺酸； 6. 苯甲酸； 7. 甲苯-4-磺酸高效液相色谱法(7)课件3.液固色谱法（1 1）分离机理）分离机理n以固体吸附剂为固定相的液相色谱法以固体吸附剂为固定相的液相色谱法n溶溶质质分分子子和和流流动动相相分分子子在在吸吸附附剂剂表表面面的的吸吸附活性中心上进行竞
17、争吸附附活性中心上进行竞争吸附高效液相色谱法(7)课件（2 2） 固定相固定相 极性：硅胶、氧化镁、氧化铝等 非极性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等（3 3）流动相）流动相n越大，洗脱力越强。 n硅胶为固定相时：以正构烷烃为主体，加入二氯甲烷调节合适的洗脱强度。n可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂高效液相色谱法(7)课件（4） 影响保留值的因素影响保留值的因素n样品分子结构样品分子结构n溶质分子的官能团极性增加，保留值增加n溶质分子的官能团数目增加，保留值增加n保留值与溶质的空间效应有关n保留值与吸附中心的几何分布有关n吸附剂吸附剂n吸附剂的孔径越小，表
18、面积越大，保留值越大n吸附剂的活性越强，保留值越大n流动相流动相高效液相色谱法(7)课件D. 应用应用n中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等n不同极性取代基的化合物n结构异构体和几何异构体混合物的分离高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件4. 离子色谱法 (1) 分离机理不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离高效液相色谱法(7)课件（2）离子色谱的仪器）离子色谱的仪器n离子色谱的分离原理与离子交换色谱一样。n最大的改进是解决了微量组分的检测问题。 双双柱柱抑抑制制型型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗
19、液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。 单单柱柱非非抑抑制制型型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件（2）固定相）固定相 离子交换剂，根据功能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）等（3）流动相）流动相 双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。 单柱非抑制型：分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等高效液相色谱法(7)课件（4）影响保留值的因素
20、）影响保留值的因素n溶质溶质n无机阴离子：与水合离子的半径有关，半径越大，保留值越大。还与离子的价态有关，价数越高，保留越强。n有机阴离子：一元脂肪酸一元芳香酸二元脂肪酸二元芳香酸，并于Pka有关n阳离子：与价数及分子大小有关高效液相色谱法(7)课件n固定相：选择性的改变主要通过固定相来实现。选择性与固定相的组成（如交联度）、交换基团的结构、位置都有关。n流动相的组成：组成不同，保留和选择性不同。n流动相的浓度：浓度高，k下降，由于下降幅度与离子电荷数有关，因此用于改变一价离子和二价离子的选择性n流动相的离子强度：离子强度增加，k下降n流动相的pH：pH升高，阳离子交换色谱中，阳离子的保留值下
21、降；因离子交换色谱中，阴离子保留值增加n有机调节剂：如甲醇、丁醇、乙腈等。影响选择性。注意与柱的匹配。高效液相色谱法(7)课件（5 5）应用）应用n分析无机阴离子的首选方法n还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。高效液相色谱法(7)课件多聚磷酸盐的分析多聚磷酸盐的分析高效液相色谱法(7)课件常见阴离子分析常见阴离子分析高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件5.5.体积排阻色谱法体积排阻色谱法 （1 1）分离原理）分离原理n以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径，使样品中不同分子大小的组分得以分离。n用于分子大小差大于10%的样品。高效液相色谱法(7)课件VR=V0+
22、KDVp 0KD1.0洗脱体积在V0 和V0 +Vp之间，峰容量有限，10-12个峰高效液相色谱法(7)课件nGFC (Gel Filtration Chromatography)n使用水溶液的凝胶过滤色谱法，用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。nGPC (Gel Permeation Chromatography)n使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法，用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定。高效液相色谱法(7)课件（2 2）固定相）固定相n硬质凝胶硬质凝胶n高交联度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝胶渗透色谱法n多孔球形硅胶：凝胶过滤色谱法、凝胶渗透色谱法n羟基化聚醚多孔微球：凝胶过滤色谱法n特性
23、参数：特性参数：n渗透极限，分离范围，固流相比（凝胶孔体积Vp/颗粒间体积Vo），柱效高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件（3 3）流动相）流动相n改善分离主要通过固定相来实现。改善分离主要通过固定相来实现。n流动相的选择原则是：流动相的选择原则是：n 能溶解样品n 与凝胶浸润n 与检测器匹配n 粘度小n如四氢呋喃；缓冲溶液如四氢呋喃；缓冲溶液高效液相色谱法(7)课件（4） 应用（分子量的测定）应用（分子量的测定）高效液相色谱法(7)课件（1）了解分析对象和分析要求）了解分析对象和分析要求6. 液相色谱分离类型及条件选择液相色谱分离类型及条件选择What is the sample
24、 ?Concentration of the interested component（组分浓度？）（组分浓度？）Contaminant（干扰物？）（干扰物？）Characteristics of the analyte? Structure（结构）（结构）Molecular weight（分子量）（分子量）pKa（酸碱性）（酸碱性）Solubility（溶解度）（溶解度）高效液相色谱法(7)课件（2） 高效液相色谱分离类型及仪器条件高效液相色谱分离类型及仪器条件n采用何种高效液相色谱类型？采用何种高效液相色谱类型？n对仪器有什么要求，类型？梯度？制备？对仪器有什么要求，类型？梯度？制备？n采
25、用何种检测器？采用何种检测器？n采用什么色谱柱？采用什么色谱柱？高效液相色谱法(7)课件（3）选择合适的分析条件）选择合适的分析条件n流动相条件流动相条件n检测器的参数检测器的参数n温度温度n流速流速n样品的样品的前处理前处理方法方法高效液相色谱法(7)课件银杏制剂中银杏内酯的分析银杏制剂中银杏内酯的分析不汽化不汽化含量低含量低没有紫外吸收没有紫外吸收复杂、基体干扰较多复杂、基体干扰较多高效液相色谱法(7)课件n醇溶性、中性：反相键合相色谱法n无紫外吸收：ELSD、RI、MSn含量低：ELSD、MSn干扰大：净化，SPE、SFE高效液相色谱法(7)课件高效液相色谱法(7)课件n色谱柱问题色谱柱问题n保留值和分离度的重现性：影响方法的准确度与精密度n谱峰拖尾：分离质量下降，精密度下降n色谱柱寿命补充内容：补充内容：HPLC实验中常见问题实验中常见问题高效液相色谱法(7)课件n 柱外效应的影响高效液相色谱法(7)课件n 溶解样品的溶剂强度对分离的影响高效液相色谱法(7)课件参考书目参考书目nL.R.施奈德，张玉奎、王杰、张维冰译， 实用高效液相色谱法的建立，第二版n于世林，高效液相色谱及其应用，2003，化学工业出版社高效液相色谱法(7)课件
