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1、微生物发酵技术微生物发酵技术教学安排：教学安排： 1. 员工培训员工培训 由老师讲解发酵过程的理论基础。由老师讲解发酵过程的理论基础。 分配实操任务：发酵过程控制。分配实操任务：发酵过程控制。 2 营养基质浓度的变化营养基质浓度的变化 随发酵时间的延长不断降低，用于菌体的生长和产物的形成。 溶氧的变化规律(后面讲)。3 产物浓度的变化产物浓度的变化 (1) 与菌体浓度平行； (2) 与培养条件有关。二二 次级代谢产物发酵的代谢变化次级代谢产物发酵的代谢变化 次级代谢发酵的菌体生长(生长期)和产物合成期(生产期)是分开的。 发酵过程可分为：菌体生长、产物合成、菌体自溶三个阶段。1 菌体生长阶段菌
2、体生长阶段 (1) 营养成分的变化 碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显减少，而新菌体不断合成，菌浓明显增加。(2) 摄氧率的变化 随菌浓增加，摄氧率不断增加，溶氧浓度下降，菌浓至临界，溶氧至最低。(3) pH 先下降后下升：利用葡萄糖产生酸，而后再被利用。 先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架，剩下氨，而后氨又被利用。 限制性因素的出现，使菌体由生长向生产转化。2 产物合成阶段产物合成阶段 产物产量不断增多，起至达到最大值，生产速率也达最大，直至产物合成能力衰退。 该阶段要严格控制发酵条件，对产物的合成最为关键。例如营养浓度。3 菌体自溶阶段菌体自溶阶段 菌体衰老、开始自溶，氨氮含量
3、升高，pH上升，产物合成能力衰退，生产速率下降。此时结束发酵。第四节第四节 菌体浓度影响及其控制菌体浓度影响及其控制菌体浓度：菌体浓度：单位体积培养液中菌体的含量。一一 影响菌体生长的因素影响菌体生长的因素1 比生长速率：比生长速率：越大，菌体生长越快；决定于细胞的复杂性(越复杂越慢)；2 营养物质和环境条件营养物质和环境条件： 营养物质浓度在一定限度内，浓度与菌体生长成正比。 其它环境条件越适合，生长越快。二二 菌浓对初级代谢和次级代谢的影响菌浓对初级代谢和次级代谢的影响 产物的产率产物的产率： Rp = Qp X 其中： Qp 为比生产速率； X 为菌体浓度。 X太大的负面影响太大的负面影
4、响： 1 营养物质消耗太快； 2 生产毒素； 3 溶氧供应不上。三三发酵过程中菌浓度的控制发酵过程中菌浓度的控制四 通过调节生长速率实现，而这又要通过调节培养基的营养基质浓度。五 第五节第五节 营养基质影响及其控制营养基质影响及其控制一一 碳源的影响及其控制碳源的影响及其控制1 碳源的种类影响代谢情况碳源的种类影响代谢情况迅速利用的碳源：迅速利用的碳源：迅速参与代谢，合成菌体和产生能量，并产生分解产物，因此有利于菌体生长，但对产物(特别是次级代谢)有抑制作用(例如葡萄糖)。缓慢利用的碳源：缓慢利用的碳源：可被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、饴糖等)。机理解
5、释：机理解释： 乳糖的利用速度刚好符合青霉素的合成速度。控制方法：控制方法：流加葡萄糖或采用混合碳源。2 碳源浓度的影响碳源浓度的影响 浓度合适。控制方法：控制方法：中间补料。二二 氮源的影响和控制氮源的影响和控制1 氮源浓度的影响氮源浓度的影响以谷氨酸发酵为例：以谷氨酸发酵为例：NH4+太高：合成谷氨酰氨；NH4+不足：积累-酮戊二酸。2 氮源的种类的影响氮源的种类的影响速效氮源：速效氮源：氨基态氮和玉米浆，促进菌体生长，但对部分产物，特别是次级产物合成有抑制作用。缓慢氮源：缓慢氮源：延长产物合成期。发酵培养基一般采用速效与缓慢氮源的混合物，且中间还要补充。(1) 补加有机氮源(2) 补加无
6、机氮源(补氮和调pH双重功效)。三三 磷酸盐的影响和控制磷酸盐的影响和控制 适合微生物生长的磷盐浓度偏高； 适合微生物药物合成的磷盐浓度偏低。 发酵过程一般采用亚适量。第六节第六节 温度的影响及其控制温度的影响及其控制一一 温度对发酵的影响温度对发酵的影响1 影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质； 菌体生长所需温度与产物合成温度不一致(如青霉素)；温度不同还可能影响产物合成的方向(如金霉素和四环素)。2 影响发酵液的物理性质。(粘度、氧和基质的溶解与传递、分解和吸收)二二 影响发酵温度变化的因素影响发酵温度变化的因素产热的因素：产热的因素：1 生物热(Q生物) 与培养基成分和培养阶段有关。2 搅
7、拌热(Q搅拌)散热的因素：散热的因素：1 蒸发热(Q蒸发)2 辐射热(Q辐射)三三 温度的控制温度的控制1 最适温度的选择最适温度的选择2 温度的控制温度的控制第七节第七节 pH的影响及其控制的影响及其控制一一 pH对发酵的影响对发酵的影响1 影响微生物的生长及产物的合成影响微生物的生长及产物的合成(通过影响酶活性实现)；生长最适pH与合成最适pH不一致菌体内的pH近中性，因为发酵培养基中的pH是通过间接方式作用与胞内酶的2 影响菌体对基质的利用速度和细胞结构影响菌体对基质的利用速度和细胞结构(通过影响膜实现)；例如产黄青霉在低pH 下为丝状，高pH为酵母状3 影响产物的稳定性；影响产物的稳定
8、性；噻呐霉素在pH6.7-7.5时稳定；青霉素在碱性条件下发酵产量低二二 发酵发酵pH的变化的变化(影响因素影响因素)1 菌种的遗传特性菌种的遗传特性菌种具有自我调节pH能力，但能力有限度(地中海卡诺氏菌发酵生产利福霉素SV)2 营养成分的分解代谢营养成分的分解代谢碳源分解代谢产生中间产物丙酮酸，产生丙酮酸的多少与碳源种类和浓度有关。 pH变化是菌体产酸或产碱的综合作用结果，可能通过pH变化反应发酵情况。三三发酵发酵pH的确定和控制的确定和控制四四1 发酵发酵 pH的确定的确定五 根据实验结果确定六六2 pH控制控制七七最适最适pH在微生物生长和产物形成相互在微生物生长和产物形成相互关系关系：
9、八 (1) 二者的pH相似且在较宽的内；九 (2) 生长的pH较宽，而合成的pH较窄；十 (3) 二者都敏感，但最适点相同；十一 (4) 二者都敏感，但最适点不同。pH的控制方法的控制方法：1 培养基配比适当，使pH在合适的范围内变化；2 直接补加酸碱或补料； 其中采用补料的方法可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和改变培养基性质等几种目的。第八节第八节 溶氧的影响及控制溶氧的影响及控制一一 溶氧对发酵的影响溶氧对发酵的影响 影响菌体生长、产物合成及产物的性质。1 有时，氧充分促进产物合成，如谷氨酸和金霉素发酵；2 有时，氧充足会对产物有抑制作用，如维生素B12发酵。 因此溶氧并非越高
10、越好。因此溶氧并非越高越好。氨基酸发酵对氧的需求分三类：氨基酸发酵对氧的需求分三类：1 谷氨酸、精氨酸和脯氨酸，氧必须供应充足，产量才大；2 异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸，供氧充分可获得最高产量，但供氧受限时，不会有太大影响；3 亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，供氧受限对产物合成有利。二二 发酵过程的溶氧变化发酵过程的溶氧变化 在一定的发酵条件下，每种产物发酵的溶氧变化都有自身的规律。总的规律：总的规律：先下降，后上升，不同产物后期出现最低谷的时间不同。溶氧异常下降的原因：溶氧异常下降的原因：1 污染好气性杂菌；2 菌体代谢异常；3 某些设备或工艺控制发生故障，如搅拌。引起溶氧异常升高的原因：引起溶氧异
11、常升高的原因：1 代谢异常，菌体过早衰老；2 污染噬菌体。三三 溶氧浓度的控制溶氧浓度的控制 溶氧浓度是由氧的供需平衡所决定的。供大于需时，溶氧上升；供小于需时，溶氧下降。提高供氧的方法：提高供氧的方法：提高氧传递动力和液相体积氧传递系数。氧传递动力的提高受限，只能通过搅拌、通气及发酵液粘度控制。控制需氧的方法：控制需氧的方法： 需氧量受菌体浓度、营养基质的种类和浓度、培养条件影响，其中重要的是菌体浓度。菌体浓度可通过控制比生长速率来实现，这又要通过营养基质浓度的控制来实现。一一 二氧化碳对发酵的影响二氧化碳对发酵的影响二氧化碳的作用：二氧化碳的作用：1 刺激作用，如环状芽孢杆菌发芽孢子开始生
12、长时就需要二氧化碳，此谓二氧化碳效应。2 抑制作用，影响生长速度、菌体形态、产物合成和培养基pH。第九节第九节 二氧化碳影响及其控制二氧化碳影响及其控制二 二氧化碳浓度的控制 二氧化碳受呼吸强度、发酵液流变学特性、通气搅拌程度和外界压力大小影响。 通过 通气和搅拌 来控制。第十节第十节 补料分批发酵补料分批发酵一一 补料分批发酵的作用补料分批发酵的作用补料分批发酵的概念。补料分批发酵的优点：补料分批发酵的优点：(1) 解除了底物抑制、产物反馈抑制和分解解除了底物抑制、产物反馈抑制和分解产物阻遏；产物阻遏；(2) 避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的不良影响，降低发酵液的粘度；
13、(3) 可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；(4) 一种理论研究方法。(一一) 可以控制抑制性底物的浓度可以控制抑制性底物的浓度 高密度的生物量需要投入几倍的基质，但高浓度的基质有抑制作用。抑制原因：(1)有的基质浓度过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；(2)(2) 高浓度基质能使微生物热致死；(3)(3) 对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用；(4) 改变菌体的生化代谢而影响生长。 部分前体物有毒性，部分是由于溶解度小。(二二) 可以解除或减弱分解产物阻遏可以解除或减弱分解产物阻遏 部分合成酶受到易利用的碳或氮源的阻遏，例如葡萄糖的分解代谢产物引起的阻遏。(三三) 可以使发酵过程最
14、佳化可以使发酵过程最佳化二二 补料的方式和控制补料的方式和控制(一一) 补料方式补料方式 连续流加、不连续流加(多周期流加)。(二二) 补料控制补料控制 1 有反馈控制有反馈控制 反馈控制系统：传感器、控制器和驱动器。 直接方法：直接方法：以限制性营养物浓度作为反馈参数； 间接方法：间接方法：以溶氧、pH、呼吸商、排气中的CO2及代谢产物浓度等为参数。 间接方法的例子：以CO2和pH为控制参数。2 无反馈控制无反馈控制 经验补料法。第十一节第十一节 泡沫的影响及控制泡沫的影响及控制 泡沫泡沫(机械泡沫和流态泡沫机械泡沫和流态泡沫)的危害：的危害：1 装料系数减小；2 增加染菌机率。消泡方法：1
15、 机械消泡；机械消泡；2 消泡剂消泡。消泡剂消泡。1泡沫保持恒定的水平；泡沫保持恒定的水平；2早期稳定下降，以后早期稳定下降，以后恒定；恒定；蛋白质的消耗。蛋白质的消耗。3前期稍微降低，后又前期稍微降低，后又回升；回升；4开始低，以后上升。开始低，以后上升。5综合方式（无规律性）综合方式（无规律性）控制泡沫方法：控制泡沫方法：防止（气体、防止（气体、发泡物质：有机氮源，发泡物质：有机氮源，降低有机氮源浓度，需求量不足，补料降低有机氮源浓度，需求量不足，补料）不能斗绝治理不能斗绝治理天然油脂天然油脂（豆油、菜籽油）；高碳醇、（豆油、菜籽油）；高碳醇、脂肪酸或脂类；脂肪酸或脂类；聚醚类聚醚类；硅酮
16、。；硅酮。浓度低能消泡；浓度低能消泡；能力持久（持久存在，不被消耗）。能力持久（持久存在，不被消耗）。不影响氧和提取；不影响氧和提取；天然油脂质量：酸价。泡敌：聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE）。GP化学消泡剂增效：加载体、并用、乳化。第十二节第十二节 发酵终点判断发酵终点判断确定一个合理的放罐时间，需考虑：确定一个合理的放罐时间，需考虑：1 经济因素；2 对产品质量的影响；3 特殊因素。作作 业业1 请说明菌种保藏的基本原理，及各保藏方法的特点。2 影响微生物需氧量的因素有哪些？并详细说明它们是如何影响需氧量的。3 影响供氧的因素有哪些？并说明它们是如何影响供氧的。3分别谈谈碳源、氮源、磷酸盐对发酵有哪些影响及如何控制。4温度对发酵有哪些影响？哪些因素会导致发酵温度的变化？发酵过程中如何控制温度？5溶氧对发酵会产生何影响？发酵过程中，溶氧如何变化？如何控制溶氧浓度？
