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1、 基因工程是指按照人们的愿望基因工程是指按照人们的愿望,进行进行严格的设计严格的设计,并通过在并通过在生物体外生物体外进行进行DNA 重组等技术，赋予生物以新的遗传特性重组等技术，赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于类型和生物产品。由于基因工程基因工程是在是在DNA分子水平上进行设计和施工的分子水平上进行设计和施工的,因此因此又叫做又叫做DNA重组技术或重组技术或基因拼接技术基因拼接技术.（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程
2、实质（原理）实质（原理）结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品人们需要的新的生物类型和生物产品切割切割 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组基因工程的若干问题基因工程的若干问题: :DNADNA重组技术重组技术( (基因工程基因工程) )的的 基本工具基本工具做工程是需要工具的做工程是需要工具的.一、限制性核酸内切酶（限制酶限制酶）“分子手术刀”主要来源及种类主要来源及种类：原核生物、原核生物、约约4000种种1.
3、 限制酶限制酶“分子手术刀分子手术刀”作用：能识别双链作用：能识别双链DNA的某种的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列，并且使并且使每一条链中每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之特定部位的两个脱氧核苷酸之间间(此处叫此处叫“切点切点”)的的磷酸二酯键磷酸二酯键断开断开(注意注意: :不是不是氢键氢键).注意注意: :一种限制酶只能识别一种限制酶只能识别一种一种特定的特定的核苷酸序列核苷酸序列,并且只能在并且只能在一个一个特定的特定的切点切点上切割上切割DNA分子。分子。即即：特异性特异性. ( (注意注意: :特异性表现在两个方面特异性表现在两个方面.).)作用部位在作用部位在DNA的骨架上的骨
4、架上限制酶的特异性表现在限制酶的特异性表现在: : 特定的脱氧核苷酸序列特定的脱氧核苷酸序列 特定的切点特定的切点.AATTGCCTTAAGDNADNA双链及双链及“磷酸二酯键磷酸二酯键”磷磷酸酸二二酯酯键键 1.大肠杆菌大肠杆菌(EcoR)的一种限制酶能识别的脱的一种限制酶能识别的脱氧核苷酸序列是氧核苷酸序列是(用碱基表示用碱基表示)_ ;切切点在点在_之间。之间。限制酶限制酶看图回答看图回答: :GAATTCG和和A在在G和和A之间被之间被限制酶限制酶切断的是化学键是切断的是化学键是_.EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Go backGo backEcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性
5、末端Go backGo backSma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同用同一种限制酶来切割，产生一种限制酶来切割，产生相同黏性相同黏性末端吗末端吗？ 会产生相同的黏性末端会产生相同的黏性末端.思考思考: :DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶将连接酶将DNADNA片段之间的缝隙片段之间的缝隙“缝合缝合”起起来，来，即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的的磷酸二酯键磷酸二酯键。DNA连接酶连接酶作用部位在作用部位在DNA骨架上骨架上互补的黏性末端的碱基通过氢键连接成互
6、补的黏性末端的碱基通过氢键连接成碱基对，碱基对，DNADNA连接酶的连接酶的种类种类( (根据来源分根据来源分) )及其在及其在功能功能上上的异同的异同. . -见课文见课文P5.P5.来源来源功功能能同同异异名称名称E.ColiDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键只能只能:互补的互补的黏性末端黏性末端黏性末端和平末黏性末端和平末端端均可均可 异异: : DNADNA连接酶连接酶: :是将几个是将几个DNADNA片段连接起来片段连接起来; ;不需不需DNADNA模板模板. . DNADNA聚合酶聚合酶: :则是将脱氧核苷酸连接则是
7、将脱氧核苷酸连接( (聚聚合合) )成成DNA;DNA;需以需以DNADNA的一条链为模板的一条链为模板. .提示提示: : 注意比较基因工程中的注意比较基因工程中的DNADNA连接酶连接酶和和DNADNA复制中的复制中的DNADNA聚合酶聚合酶的作用有何的作用有何异同异同? ? 同同: :两种酶都是形成两种酶都是形成磷酸二酯键磷酸二酯键. . - -导入过程需要运输导入过程需要运输“目的目的基因基因”的工具的工具运运载体载体。注意注意: : 一般地一般地, ,不能将目的基因直接导入受体细胞不能将目的基因直接导入受体细胞. .三、“分子运输车基因进入受体细胞的运载体需要的条件：有1多个限制酶切
8、点，供外源基因插入其中对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制，提供大量的目的基因有某些标记基因，鉴定鉴定鉴定鉴定受体细胞中是否有重组重组重组重组DNADNA，便于筛选，便于筛选，便于筛选，便于筛选常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体或某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车作为分子运输车载体，如果没有切割载体，如果没有切割位点行吗？位点行吗？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？来做分子运输车吗？载有目的基因的载体有没有进入受体细载有目的基因的载体有没有进入受体细胞，肉眼看不到，如何去鉴定它是
9、否进胞，肉眼看不到，如何去鉴定它是否进入？入？ 什么是质粒什么是质粒? 是一种裸露的、结构简是一种裸露的、结构简单、单、独立于独立于细菌染色体细菌染色体( (即即原原核的核的DNADNA) )之外之外，并具有自，并具有自我复制能力的双链环状我复制能力的双链环状DNADNA分子分子. . 质粒是基因工程最常用质粒是基因工程最常用的载体的载体. . 小结小结: : 质粒是小型、质粒是小型、环状的环状的DNADNA分子分子. .基因工程的基本操作程序主要包括基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：四个基本步骤：1）目的基因目的基因的获取的获取2）“基因表达载体基因表达载体”的构建的构建3）将目的
10、基因）将目的基因导入导入受体细胞受体细胞(即即“转化转化”)4）目的基因的）目的基因的检测检测与与鉴定鉴定步骤一：步骤一：目的基因目的基因的获取的获取什么叫什么叫目的基因目的基因? 主要是指编码蛋白质的结构基因主要是指编码蛋白质的结构基因.获取获取目的基因目的基因的途径有哪些的途径有哪些? ?1.1.从从“基因文库基因文库”中获取中获取. .2.2.利用利用“PCRPCR技术技术”扩增扩增. .3.3.直接人工合成直接人工合成( (适合于基因较小且已知适合于基因较小且已知其核苷酸顺序其核苷酸顺序) )-见课文见课文.共三条共三条.从从基因文库基因文库中获取中获取“目的基因目的基因”：什么叫什么
11、叫“基因文库基因文库”? ?分为分为: :1.基因组文库基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因,这这种基因文库叫做基因组文库种基因文库叫做基因组文库.2.部分基因文库部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这这种基因文库叫做部分基因文库种基因文库叫做部分基因文库.如如cDNA文库文库. 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入导入受受体菌体菌的群体中储存的群体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的不各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因同的基因, ,称为
12、基因文库称为基因文库(gene library)(gene library) 类似从图书馆里取书类似从图书馆里取书. .利用利用PCRPCR技术技术扩增扩增“目的基因目的基因”. .1.1.概念概念:PCR:PCR即即“聚合酶链式反应聚合酶链式反应”, ,是一种在生物体外复制特定是一种在生物体外复制特定DNADNA片断片断的技术的技术. .2.2.原理原理:DNA:DNA的半保留复制的半保留复制. .3.3.过程过程:(:(见图见图).).4.4.优点优点: :大量大量获取目的基因获取目的基因.(.(指数式指数式扩增扩增, , 近近2 2n n) )提示提示: :PCRPCR的基本操作的基本操
13、作( (过程过程):): PCR是一种反复循环的是一种反复循环的DNA合成反应过程合成反应过程,其基本反应其基本反应有三个步骤：有三个步骤： 1. 变性变性:通过通过加热加热(高温高温)使模板使模板DNA完全变性成为单链完全变性成为单链,同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除. 2. 退火退火:将温度下降至适宜温度，使将温度下降至适宜温度，使引物引物与模板与模板DNA退退火结合；火结合； 3. 延伸延伸:将温度升高将温度升高,热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(即耐高温即耐高温)以脱以脱氧核苷酸为原料催化合成氧核苷酸为原料催化合成DNA链
14、延伸链延伸. 以上三步为一个循环，新合成的以上三步为一个循环，新合成的DNADNA分子又可以作为下一轮合分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNADNA片段的目的片段的目的.提示与思考提示与思考: :1.1.图中的图中的“模板模板DNADNA”就就是已知核苷酸是已知核苷酸序列的序列的2.2.引物引物是人工合成的是人工合成的, ,与模板与模板DNA(DNA(即目的基即目的基因因) )互补互补3.3.加热的作用是使加热的作用是使_._.4.4.聚合酶聚合酶(Tap(Tap酶酶) )是指是指_(_(选选: :DNADNA聚合酶聚合酶;RNA;RN
15、A聚合酶聚合酶),),其特点是其特点是_._.5.5.原料是原料是_._.6.6.每扩增一次每扩增一次, ,目的基因目的基因的数目增加的数目增加_._.DNADNA解链解链目的基因目的基因每循环每循环(扩增扩增)一次一次,就需要添加就需要添加 引物引物.两个两个人工合成人工合成目的基因目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过以通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成。合成仪用化学方法直接合成。1.1.通过通过反转录法反转录法合成合成: :又分为又分为: :目的基因的目的基因的mRNA(已知已知)单链单链DNA双链双链DNA(即目的基因即目的基
16、因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成2.2.直接合成直接合成. . 根据已知蛋白根据已知蛋白质的氨基酸序列，质的氨基酸序列，推测出相应的信使推测出相应的信使RNARNA序列，然后按序列，然后按照碱基互补配对原照碱基互补配对原则，推测出它的结则，推测出它的结构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序列，再通过化学方列，再通过化学方法，以单核苷酸为法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成提示提示
17、“基因表达载体基因表达载体”就是已插就是已插入入 的载的载体体. .目的基因目的基因基因表达载体基因表达载体的构建的构建 3.3.启动子启动子: :是有特殊结构的是有特殊结构的DNADNA片断片断, ,位于目位于目的基因的首端的基因的首端, ,是是RNARNA聚合酶聚合酶的识别和结合的的识别和结合的部位部位. .有它才能驱动有它才能驱动目的基因目的基因转录转录出出MRNA.MRNA.最终获得蛋白质最终获得蛋白质. . ( (不是不是复制复制!)!)4.4.终止子终止子: :位于目的基因的尾端位于目的基因的尾端. .作用是终止作用是终止转录转录. .5.5.标记基因标记基因: :是为了鉴别受体细
18、胞里是否已是为了鉴别受体细胞里是否已经含有目的基因经含有目的基因, ,从而将含目的基因的细胞从而将含目的基因的细胞筛选出来筛选出来. .如如“抗生素基因抗生素基因”、“荧光标记荧光标记基因基因”等等. . 6.6.复制原点复制原点是载体是载体复制复制( (不是转录不是转录) )时的起点时的起点. . 什么叫什么叫转化转化? 将将目的基因进入受体细胞内，并且在受体目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内细胞内维持稳定维持稳定(如复制如复制)和和表达表达(即转录、翻译即转录、翻译为特定蛋白质及表现特定性状等为特定蛋白质及表现特定性状等)的过程的过程.提示提示: : 注意注意,目的基因目的基因是随着
19、是随着基因表达载体基因表达载体被导入受被导入受体细胞的体细胞的,而不是被单独导入的而不是被单独导入的.步骤三：步骤三： 转化转化-将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞-.-.农杆菌转化法农杆菌转化法提示提示: : (1) (1)农杆菌农杆菌及及农杆菌转化法农杆菌转化法: :农杆菌是农杆菌是土壤中的一种细菌土壤中的一种细菌. .能感染双子叶植物和能感染双子叶植物和裸子植物裸子植物. .其细胞里含其细胞里含TiTi质粒质粒, ,该质粒上含该质粒上含有一段有一段DNADNA叫叫“T-DNAT-DNA”( (叫叫“可转移的可转移的DNADNA
20、”).).将将目的基因目的基因插入到该插入到该“T-DNAT-DNA”中中, ,通过使农杆菌感染植物通过使农杆菌感染植物, ,而将目的基因而将目的基因转化入植物细胞并将其插入到植物细胞中转化入植物细胞并将其插入到植物细胞中的染色体的的染色体的DNADNA上上. . (2) (2)将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞的方法还有细胞的方法还有: :基因枪法和花粉通道法基因枪法和花粉通道法. .2.2.将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞-显微注射法显微注射法. . 用口径为用口径为1m的的DNA注注射器，将大量射器，将大量目的基因目的基因片段片段( (注意注意: :是含是含目的基因目的
21、基因的的“基因表达载体基因表达载体”, ,而不是而不是裸的目的基因裸的目的基因) )注入到受精注入到受精卵的核内，然后把经过注射卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。育为转基因动物。什么叫显微注射技术？什么叫显微注射技术？ 1）将细菌用）将细菌用 ，以，以增大增大细细菌菌 的的通透性通透性。 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的 进进入入受体细胞。受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而其繁殖而复制复制，由于细菌，由于细菌 的的速度速度非常快，在很短的时间内就能
22、非常快，在很短的时间内就能获得获得大量大量的目的基因。的目的基因。CaCl2处理处理重重组组DNA繁殖繁殖3.3.将目的基因导将目的基因导入入微生物微生物细胞细胞感受态细胞法感受态细胞法. .大肠杆菌细胞是最常用的微生物受体细胞大肠杆菌细胞是最常用的微生物受体细胞细胞壁细胞壁 通过通过转化转化以后以后,目的基因目的基因是否是否真正插入到了真正插入到了受体细胞受体细胞的的DNA中，是否能够在中，是否能够在受体细胞受体细胞中稳中稳定遗传和正确表达呢定遗传和正确表达呢? 这只有通过这只有通过检测、鉴检测、鉴定定才能得知才能得知 .提示提示: :目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测鉴定鉴定
23、检测检测转基因生物转基因生物染色体的染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定方法方法方法方法-方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADNA分子杂交原理：分子杂交原理： DNA DNA分子杂交是基因诊断最基本的分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的方法之一。其基本原理是：互补的DNADNA单链能够在一定条件下结合成双链
24、，即单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段用一段已知基因的核苷酸序列作为已知基因的核苷酸序列作为探针探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明全配对成双链，则表明被测基因被测基因中含有中含有已知的基因序列。已知的基因序列。基因探针基因探针只能和只能和_(_(选选: :目的基因目的基因; ;非非目的基因目的基因) )杂交杂交. .例：用棉铃饲喂例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基则说明摄入了抗虫基因并得到表达。因并得到表达。-个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质
