高效液相色谱使用与维护课件

《高效液相色谱使用与维护课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱使用与维护课件（186页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、高效液相色谱的高效液相色谱的使用与维护使用与维护浙江省疾病预防控制中心高效液相色谱使用与维护课件n n液相色谱仪器部件n n日常维护n n色谱图相关术语n n实验操作与应用高效液相色谱使用与维护课件一些商品化仪器一些商品化仪器高效液相色谱使用与维护课件agilent高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱使用与维护课件n noe高效液相色谱使用与维护课件HPLC的环境设置：良好的接地良好的接地专门房间专门房间定制台面定制台面不间断电源不间断电源HPLCHPLC的日常操作条件：的日常操作条件：温度：温度：101030,30,最好是恒温；最好是恒温； 空空调器调器 相对湿度相对湿度80 ) 甲酰胺甲

2、酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙乙酸乙酯酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) )高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱流动相溶剂的物化性质（部分）高效液相色谱使用与维护课件合适选择性溶剂合适选择性溶剂液液相相色色谱谱溶溶剂剂选选择择范围范围 液相色谱流动相溶剂的选择步骤：液相色谱流动相溶剂的选择步骤： 选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等 选择合适洗脱强度的溶

3、剂：简单样品，2 k 5；复杂样品，0.5 k 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的值所有溶剂所有溶剂合适物理性质溶剂合适物理性质溶剂合适保留值溶剂合适保留值溶剂高效液相色谱使用与维护课件液相色谱中的溶剂强度液相色谱中的溶剂强度1. 1. 溶溶剂剂强强度度是是描描述述色色谱谱性性能能的的主主要要指指标标，表表示示溶溶剂剂对对样样品品的的洗洗脱脱能能力力，它它决决定定于于溶溶剂剂与与溶溶质质之之间间分分子子的的作作用用力力。目目前前还还没没有有一一个个统统一一标标准准描描述述不不同同类类型型液液相相色色谱谱体体系系中中的的溶溶剂剂强强度度，而而是是采采用用相相对对极极性性和和溶溶解解度

4、度参参数等作为溶剂强度指标。数等作为溶剂强度指标。1)溶解度参数（参见溶剂选择性）2)极性参数P 根据固定相和流动相的极性大小, 人们把液相色谱分成： 正相色谱正相色谱：固定相极性大于流动相 (包括硅胶吸附色谱) 反相色谱反相色谱：固定相极性小于流动相高效液相色谱使用与维护课件正正相相色色谱谱：增增加加溶溶剂剂极极性性，保留时间增大或变小？保留时间增大或变小？反反相相色色谱谱：增增加加溶溶剂剂极极性性，保留时间又如何变化？保留时间又如何变化？高效液相色谱使用与维护课件洗脱强度与溶剂极性洗脱强度与溶剂极性分分子子之之间间相相互互作作用用有有色色散散力力、偶偶极极作作用用、氢氢键键和和介介电电作作

5、用用。某某一一溶溶质质与与其其它它分分子子相相互互作作用用大大小小的的程程度度可可以以用用极极性性大大小小表表示示。极极性性越越大大, , 它它与与其其它它分分子子的的作作用用力力越越大大。 “极极性性”溶溶剂剂容容易易吸吸收收和和溶解溶解“极性极性”物质。物质。溶剂洗脱强度指流动溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力相中溶剂的洗脱能力, 它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中, “溶剂洗脱溶剂洗脱强度强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。高效液相色谱使用与维护课件溶剂强度图溶剂强度图反相色谱THF/H2OACN/H2OMeOH/H2O 0 20 4

6、0 60 80 100正相色谱正相色谱 0 20 40 60 80 100甲醇戊烷异丙基氯二氯甲烷乙醚乙腈 0 0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 高效液相色谱使用与维护课件混合溶剂的极性 在在液液相相色色谱谱中中, , 一一般般溶溶剂剂的的极极性性变变化化二二个个单单位位, , 溶溶质质的的分分配配比比差差不不多多能能有有十十倍倍的的变变化化。通通过过溶溶剂剂强强度度参参数数的的计计算算, , 可可以以较较好好地地较较快快地地选选择择合合适适溶溶剂剂或或调整流动相的极性范围。如：调整流动相的极性范围。如：正正相相色色谱谱：k k2 2 / / k k1 1 = = exp exp

7、(P(P1 1P P2 2)/2)/2反反相相色色谱谱：k k2 2 / / k k1 1 = = exp exp (P(P2 2P P1 1)/2)/2 在在液液相相色色谱谱常常用用混混合合溶溶剂剂作作流流动动相相。混混合合溶溶剂剂的的PP具有加和性：具有加和性： PPabab = = a aPPa a b bPPb b , , 为为某某一一溶溶剂剂的的体体积积分数。分数。高效液相色谱使用与维护课件溶剂选择性分类溶剂选择性分类 一般地说, 改变溶剂比例可调节流动相的极性, 从而使得组分的容量因子落在合适的范围内。但由于分子间相互作用的类型相同, 分离因子变化不大。因此专门研究了各种溶剂的选择

8、性, 并将常用溶剂进行分类。高效液相色谱使用与维护课件质子给予体偶极相互作用质子接受体溶剂选择性分类三角形图溶剂选择性分类三角形图XeXe XdXd Xn Xn 12345678纯质子接受体强偶极中性化合物纯质子给予体高效液相色谱使用与维护课件1 组：脂肪醚（纯质子接受体）2 组：脂肪醇（质子接受-给予体）3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈7 组：芳烃、芳醚、硝基甲烷8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）高效液相色谱使用与维护课件质子给予体偶极相互作用质子接受体

9、反相色谱中的溶剂选择性反相色谱中的溶剂选择性1甲醇2TFH345乙腈67水8高效液相色谱使用与维护课件质子给予体偶极相互作用质子接受体正相色谱中的溶剂选择性正相色谱中的溶剂选择性醚 1 2 34二氯乙烷 5乙腈 678 CHCl3 8主溶剂：己烷主溶剂：己烷高效液相色谱使用与维护课件 按溶剂分子的特殊作用类型分类按溶剂分子的特殊作用类型分类, , 采用三个不同的常数表示：采用三个不同的常数表示： Xe( Xe(接受质子参数接受质子参数)易与含羟基的分子作用易与含羟基的分子作用( (如酸类、酚类如酸类、酚类) )； Xd( Xd(给质子参数给质子参数)易与碱性化合物作用易与碱性化合物作用( (如

10、胺、亚砜等如胺、亚砜等) )； Xn(Xn(强强偶偶极极参参数数)易易与与偶偶极极距距较较大大的的溶溶质质分分子子作作用用( (如如硝硝基基化化合物、腈、亚砜和胺类等合物、腈、亚砜和胺类等) )。 通通常常把把常常用用溶溶剂剂分分成成八八组组。同同一一组组溶溶剂剂的的三三个个选选择择性性参参数数相相近近，其其选选择择性性相相似似。当当某某一一溶溶剂剂不不能能提提供供足足够够的的分分离离选选择择性性时时, , 那那么么更更换换同同组组的的其其它它溶溶剂剂亦亦不不能能提提高高选选择择性性。改改变变溶溶剂剂时时, , 只只有有从从距距离离较较远远的的溶溶剂剂组组挑挑选选, , 才才可可能能使使选选择

11、择性性有有较较大大变变化化。因因为为当当溶溶剂剂和和样样品品分分子子的的各各种种相相互互作作用用的的相相对对重重要要性性发发生生明明显显变变化化时时, , 流流动动相的选择性才会发生最大程度的改变。相的选择性才会发生最大程度的改变。高效液相色谱使用与维护课件流动相的优化 流动相的优化主要是考察流动相组成对保留时间、分离因子和分离度等参数的影响。 使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离选择性；保持流动相的低粘度, 从而保证高的柱效。 在在吸吸附附色色谱谱中中混混合合溶溶剂剂选选择择规规则则：混合溶剂中极性强的组分含量大或小时, 有最大的值；能与溶质发生氢键作用的溶剂, 有较好的分离选择性。高效液

12、相色谱使用与维护课件4.4.流动相的组成流动相的组成n n水相 纯水 缓冲溶液n n有机相 纯有机相 混合有机相 缓冲有机相高效液相色谱使用与维护课件对溶剂的要求对溶剂的要求n n水： 去离子水 自动纯水仪 重蒸水 重蒸水装置纯净水 商品瓶装水 n n有机溶剂: 色谱纯（国产、进口、进口分装）重蒸旋转蒸发仪高效液相色谱使用与维护课件因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物波长波长 (nm) (nm)纯化水纯化水去离子水去离子水吸吸吸吸光光光光率率率率水高效液相色谱使用与维护课件有机溶剂有机溶剂n n

13、溶剂的等级溶剂的等级n nHPLCHPLC级级n n优级纯优级纯n n分析纯分析纯都经过蒸馏和都经过蒸馏和0.45u0.45u的过滤的过滤( (除纤维毛除纤维毛, ,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大, ,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLCHPLC级经过级经过0.2u0.2u的过滤的过滤, ,且除去有紫外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱高效液相色谱使用与维护课件甲醇甲醇 乙睛乙睛 正己烷正己烷分析纯级和分析纯级和 HPLC HPLC 级溶剂的吸光度比较图级

14、溶剂的吸光度比较图高效液相色谱使用与维护课件水水 / MeOH / MeOH梯度梯度ODS ODS 柱柱鬼峰鬼峰Gradient CurveGradient Curve1 ml/min, 0-100% MeOH1 ml/min, 0-100% MeOHover 10 mins and hold forover 10 mins and hold for15 mins.15 mins.鬼峰的出现高效液相色谱使用与维护课件流动相溶剂的处理流动相溶剂的处理 (1)水 (2) 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH910的条件蒸馏，可用于常规洗脱。(3) 用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。 高效液相色

15、谱使用与维护课件 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。高效液相色谱使用与维护课件(2)(2)有机溶剂的提纯有机溶剂的提纯 (3)用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。(4)氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。(5)氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸馏。(6)四氢呋喃（抗氧剂丁基甲苯酚）而强烈吸收紫外线，可蒸馏。(7) 为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。高效液相色谱使用与维护课件n n过滤：过滤：过滤：过滤：0.45um0.45um0.45

16、um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。尤其是使用无机盐配制的缓冲液。尤其是使用无机盐配制的缓冲液。尤其是使用无机盐配制的缓冲液。n n脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：

17、气泡对测定的影响： 1 1 1 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积积积积 2 2 2 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形）柱中气泡使流动相绕流，峰变形）柱中气泡使流动相绕流，峰变形）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3 3 3 3）检测器中的气泡产生基线波动）检测器中的气泡产生基线波动）检测器中的气泡产生基线波动）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意：无在线脱气应注意：无在线脱气应注意：无在线脱气应注意： 1 1 1 1）每天脱气）每天脱气）每天脱气）每天脱气 2

18、 2 2 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长长长长过滤与脱气过滤与脱气高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱使用与维护课件流动相过滤器流动相过滤器负压抽吸高效液相色谱使用与维护课件流动相的保存 高效液相色谱使用与维护课件保存于聚乙烯瓶中的超纯水 高效液相色谱使用与维护课件保存于棕色玻璃瓶中的超纯水 高效液相色谱使用与维护课件选择流动相时应注意的几个问题（1 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱

19、和使检测器噪声增加。不纯的溶剂会引起基积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生线不稳，或产生“伪峰伪峰”。（2 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。在柱中沉积。（）低粘度（粘度适中）（）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增高若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有

20、丙酮、甲醇和乙腈压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。高效液相色谱使用与维护课件（）化学稳定性好（）化学稳定性好（）流动相同时还应满足检测器的要求。对于紫外吸（）流动相同时还应满足检测器的要求。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长

21、的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。高效液相色谱使用与维护课件色谱泵及液相色谱对泵的要求色谱泵及液相色谱对泵的要求n n稳定平滑并且重现性好的流速n n可靠且充分的溶剂混合n n准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合n n准确及重现的梯度形成准确及重现的梯度形成

22、n n有效的流速范围n n制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注n n滞后体积n n仅仅应用于梯度实验仅仅应用于梯度实验目的：在任何情况下保持最高精度高效液相色谱使用与维护课件常见液相色谱泵常见液相色谱泵高效液相色谱使用与维护课件串联式往复泵串联式往复泵并联式微体积往复泵并联式微体积往复泵高效液相色谱使用与维护课件单向阀结构单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球单向阀原理单向阀原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头被动式单向阀高效液相色谱使用与维护课件主动式单向阀(电磁阀）高效液相色谱使用与维护课件梯度洗脱技术梯度洗脱技术梯度洗脱的特点梯度洗脱的特点梯度洗脱的主要条

23、件梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的基本原理梯度洗脱的基本原理梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成梯度洗脱（溶剂程序）：通过改变流动相的组成来调整组分的来调整组分的kk值，改变分离因子值，改变分离因子值，以达到值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。最短时间内得到最佳分离的目的。为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐？ 在液相色谱中最低温度和最高温度受到流动相的黏度和沸点的限制；同时它的温度效应比较小。高效液相色谱使用与维护课件1梯度洗脱的特点（1 1）改善分离）改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度；（2 2）改改善善峰峰形形, , 减减少少拖拖尾尾

24、, , 有有利于痕量组分的检测；利于痕量组分的检测；（3 3）增加峰容量；）增加峰容量；（4 4）强强烈烈滞滞留留的的组组分分不不容容易易残残留留在柱上在柱上, , 保持柱性能长期良好；保持柱性能长期良好；（5 5）下下次次分分析析时时, , 流流动动相相需需要要一一段段平平衡衡时时间间；不不同同溶溶剂剂的的UVUV吸吸收收程程度稍有差异度稍有差异, , 可能会引起基线漂移。可能会引起基线漂移。高效液相色谱使用与维护课件2梯度洗脱的主要条件 A A 流动相流动相/ /弱溶剂组成；弱溶剂组成； B B 流动相流动相/ /强溶剂组成；强溶剂组成； 梯度时间；梯度时间； 梯度曲线：线性、凸型或凹型等

25、。梯度曲线：线性、凸型或凹型等。强溶剂 A%time125高效液相色谱使用与维护课件梯度洗脱的基本原理 L.R.Snyder L.R.Snyder建立了线性梯度洗脱方程：建立了线性梯度洗脱方程： ln k = lnk ln k = lnk0 0 b(t/tb(t/t0 0) )这里这里, k, k为梯度洗脱过程中任一时刻的容量因子；为梯度洗脱过程中任一时刻的容量因子； t t为梯度时间；为梯度时间； b b为斜率为斜率-梯度连续变化的斜率；梯度连续变化的斜率； t t0 0为死时间。为死时间。而洗脱时而洗脱时 k k和和kk0 0 与溶液组成间的关系为：与溶液组成间的关系为： ln k = l

26、nk ln k = lnk0 0 S S 式式中中 为为强强溶溶剂剂在在洗洗脱脱液液所所占占的的体体积积分分数数；S S是是与与强强溶溶剂剂和和试试样样有关的参数。对有关的参数。对RPLCRPLC分离小分子，分离小分子，S S一般为一般为3-53-5。 k k0 0 为为 = 0 = 0时的时的PP值。值。结合上面二式结合上面二式, , 得得 高效液相色谱使用与维护课件 b = (b = ( StSt0 0) / t t) / t t0 0 = V = V0 0/t/t 在在梯梯度度完完成成时时, , t t = = t tG G 。此此时时, , 为为A A和和B B两两溶溶液液中中强强洗脱

27、剂组成的差洗脱剂组成的差, , 即即 = = , , 这时：这时： b = b = V V0 0/(t/(tG GF) F) / t / tG G 为梯度变化速率为梯度变化速率, S, S值可由前式求得。值可由前式求得。可可见见, , b b值值是是可可以以求求出出的的。求求出出b b值值后后, , 可可以以初初步步确确定定一一下下各各种种物物质质的的kk值值, , 为为更更好好地地选选择择分分离离条条件件提提供供依依据。据。 高效液相色谱使用与维护课件选择几个梯度洗脱时间选择几个梯度洗脱时间t tG G, , 确定确定S S值；值；确定确定t tG G下的最佳值下的最佳值( (小的小的t t

28、G G, , 大的流速大的流速) )；可可以以进进行行非非线线性性梯梯度度洗洗脱脱, , 使使欲欲分分离离物物与与其其它它物物质质尽可能分开；尽可能分开； 若若分分离离效效果果不不好好, , 可可以以调调整整pHpH值值、盐盐类类型型、有有机机溶溶剂组成等方法使分离物的峰与其它峰尽可能分开。剂组成等方法使分离物的峰与其它峰尽可能分开。在在全全浓浓度度范范围围内内进进行行梯梯度度洗洗脱脱, , 要要确确信信欲欲分分离离物物质质在在梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察分离物的位置；梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察分离物的位置；确定梯度使用范围确定梯度使用范围, , 的大小；的大小；确定最佳化的梯度

29、分离条件的实现步骤：确定最佳化的梯度分离条件的实现步骤：高效液相色谱使用与维护课件 梯度操作注意事项：梯度操作注意事项：两两个个流流动动相相溶溶剂剂要要能能互互溶溶，即即极极性性不不要要相相差太大差太大吸吸附附色色谱谱只只能能是是在在小小范范围围内内变变化化，因因此此在在吸附色谱中很少用梯度洗脱（为什么？）吸附色谱中很少用梯度洗脱（为什么？）折射检测器不适应于梯度洗脱（为什么？）折射检测器不适应于梯度洗脱（为什么？）高效液相色谱使用与维护课件梯度：高压混合梯度：高压混合n n高压梯度n n使用多台色谱泵，在泵后混合使用多台色谱泵，在泵后混合n n配置灵活、简单，脱气简单配置灵活、简单，脱气简单

30、n n易调节梯度的滞后体积易调节梯度的滞后体积高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱使用与维护课件梯度：低压混合梯度：低压混合n n低压梯度n n用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合n n对脱气要求高对脱气要求高n n不易调节梯度的滞后体积不易调节梯度的滞后体积n n如设计不当，梯度的准确性受影响n n滞后体积（系统滞后体积（系统体积）设计合理体积）设计合理高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱使用与维护课件梯度洗脱梯度洗脱125高效液相色谱使用与维护课件梯度滞后：系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)

31、检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意注意滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器高效液相色谱使用与维护课件梯度滞后大小的影响梯度滞后大小的影响n n滞后体积太大会引起梯度变化的延迟n n例如：滞后体积为例如：滞后体积为2.0ml2.0ml，流速，流速1.0ml/min1.0ml/minn n实际梯度会比设置值晚实际梯度会比设置值晚 2 2 分钟响应，没有问题分钟响应，没有问题n n对微柱色谱影响更大，同上例但流速对微柱色谱影响更大，同上例但流

32、速0.1ml/min0.1ml/minn n实际梯度会比设置值晚实际梯度会比设置值晚20 20 分钟响应，不能接受分钟响应，不能接受n n滞后体积的不同会使方法转换麻烦n n滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现n n滞后体积的变化会导致梯度重现性不好滞后体积的变化会导致梯度重现性不好n n普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml高效液相色谱使用与维护课件滞后体积变化的影响滞后体积变化的影响n n设计不好的设计不好的HPLCHPLC系统，滞后体积随反压变化系统，滞后体积随反压变化n n滞后体积随反压变化的后果：滞后体积随反压变化的后果：n n梯度的准确性不好

33、，造成：方法的适应性不好梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好n n用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性度特性梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积，改善了梯度性能普通的低压梯度系统高效液相色谱使用与维护课件色谱柱的结构 色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组成。应特别注意柱头规格及无死体积连接柱头规格及无死体积连接的特性。 柱规格 制备柱 分析柱分析柱 微径柱液相色谱 (Microbore HPLC) 毛细管液相色谱 (Capillary HPLC) 快速柱：高效短柱，如4.63

34、0mm, 3mODS柱 高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱使用与维护课件分离模式的选择样品样品溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于四氢呋喃溶于四氢呋喃非离子化非离子化离子化离子化溶于有机溶剂溶于有机溶剂溶于水溶于水溶于正己烷溶于正己烷溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇/ /水水或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈/ /水水用硅胶的正相模式用硅胶的正相模式用键合相的正相模式用键合相的正相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式离子对键

35、合相的反相模式用硅胶的正相模式用硅胶的正相模式离子交换模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式用大孔填料的反相模式分子量分子量2, 0002, 000分子量分子量2, 0002, 000高效液相色谱使用与维护课件 反相分配色谱反相分配色谱 极性极性: :固定相固定相 流动相流动相固定相固定相 - - 极性极性流动相流动相( (己烷己烷, , 庚烷庚烷)- )- 非极性非极性极性物质后出峰极性物质后出峰正相色谱正相色谱 20% 20%反相色谱反相色谱80%80%正相 &反相色谱高效液相色谱使用与维护课件 硅胶

36、基质硅胶基质- - pH 38pH 38 Al Al2 2O O3 3 . . nH nH2 2O - pH114O - pH114 聚合物基质聚合物基质 - - pH114pH114高或低高或低pHpH下下, , 硅胶会溶解硅胶会溶解化学修饰困难化学修饰困难孔结构复杂孔结构复杂, , 孔径不均匀导致柱效不够高孔径不均匀导致柱效不够高, , 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质高效液相色谱使用与维护课件C-18柱-性能影响因素键合类型键合类型碳覆盖率碳覆盖率封端封端 化学性质化学性质物理性质物理性质硅胶纯度硅胶纯度色谱柱尺寸色谱柱尺寸颗粒形状颗粒形

37、状粒径粒径表面积表面积孔径孔径高效液相色谱使用与维护课件硅胶纯度硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱尺寸 填料床的长度和内径填料床的长度和内径颗粒形状颗粒形状 球型或不规则型球型或不规则型粒径粒径 平均颗粒直径平均颗粒直径, , 通常通常3-103-10m m表面积表面积 颗颗粒粒外外表表面面和和内内部部孔孔表表面面的的总总和和, , 以以m m2 2/gram/gram表表示示孔径孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸颗粒的孔或腔的平均尺寸, , 范围范围80-30080-300 色谱柱物理性质色谱柱物理性质C-18柱-性能影响因素高效液相色谱使用

38、与维护课件键合类型键合类型 单体键合单体键合 - - 键合相分子与基体单点相连键合相分子与基体单点相连 聚合体键合聚合体键合 - - 键合相分子与基体多点相连键合相分子与基体多点相连碳覆盖率碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量与基体物质相连的键合相的量封端封端 键键合合步步骤骤之之后后, , 用用短短链链将将裸裸露露的的硅硅羟羟基基键键合合后后封封闭闭起来起来色谱柱化学性质色谱柱化学性质C-18柱-性能影响因素高效液相色谱使用与维护课件A A类硅胶类硅胶Original ZORBAX SIL (1970s)Original ZORBAX SIL (1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面

39、由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高上金属含量高 ( (硅羟基的硅羟基的pKapKa低低), ), 导致碱性化合物发生拖尾导致碱性化合物发生拖尾B B类硅胶类硅胶 ( (高纯高纯) )ZORBAX Rx-Sil (1987)ZORBAX Rx-Sil (1987)由于金属含量低由于金属含量低, , 硅羟基硅羟基pKapKa高高, , 碱性化合物不发生拖尾碱性化合物不发生拖尾Zorbax Rx-SIL: 11Zorbax Rx-SIL: 11种金属种金属 35 ppm ( 35 ppm (未检出其他杂质未检出其他杂质, 1ppm); 99.995% , 4, 000, MW 4, 00

40、0, 选择选择 300 300 的孔径的孔径高效液相色谱使用与维护课件大孔径填料适用于大分子分析n n大孔径大孔径300 300 全多孔色谱柱全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但分子量虽小但hydrodynamic volume(hydrodynamic volume(水动力学体水动力学体积积) )较大的分子较大的分子n nPoroshell Poroshell 色谱柱色谱柱 高流速下高流速下, , 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔测物分子自由进出填料孔, ,

41、与孔内表面的键合相进行分与孔内表面的键合相进行分离分配离分配高效液相色谱使用与维护课件300 300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.200.200 00.020.020.040.040.060.060.080.080.100.100.120.120.140.140.160.160.180.18300SB-C18 (300)300SB-C18 (300)SB-C18 (80)SB-C18 (80)PW 1/2PW 1/2Leu EnkephalinLeu EnkephalinM.W. = 556M.W. = 556Angiotensin II(Angiotensin I

42、I(血管紧张素血管紧张素 II) II)M.W. = 1046M.W. = 1046Insulin BInsulin BM.W. = 3, 496M.W. = 3, 496Cyt CCyt CM.W. = 12, 327M.W. = 12, 327Rnase(Rnase(核糖核酸酶核糖核酸酶) )M.W. = 13, 684M.W. = 13, 684Lysozyme(Lysozyme(溶菌酶溶菌酶) )M.W. = 13, 900M.W. = 13, 900孔径孔径, , 分子量对峰宽的影响分子量对峰宽的影响( (梯度分离梯度分离) )选择合适的选择合适的填料孔径分析填料孔径分析大分子可获得

43、大分子可获得最佳峰形最佳峰形高效液相色谱使用与维护课件300 300 孔径可改善大分子的峰形孔径可改善大分子的峰形 色谱柱色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm : 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% : 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸三氟乙酸 流速流速: 0.75 mL/min : 0.75 mL/min 温度温度: RT: RT 检测器检测器: UV 282 nm: UV 282 nm 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍窄的峰宽表

44、明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3 SB-C3 (80)(80)300SB-C3 300SB-C3 (300)(300)Pw Pw 1/21/2 = 0.442 = 0.442Pw Pw 1/21/2 =0.125 =0.125 O OO ON NHOHOHOHOCHOCHOHOHOO OH HO OH HO OO OO OO OO OO OO OCHCH3 3CHCH3 3OCHOCH3 3OCHOCH3 3CHCH3 3CHCH2 2CHCH2 2CHCH2 2CHCH3 3CHCH3 3CHCH3 3H H3 3C CH H3 3C CH H3 3C C0 5 100 5 10T

45、ime (min)Time (min)0 5 100 5 10Time (min)Time (min)Tylosin(Tylosin(泰乐菌素泰乐菌素) )MW. 926MW. 926分子量虽小但分子量虽小但 hydrodynamic volume hydrodynamic volume( (水动力学体积水动力学体积) )较大的分子较大的分子高效液相色谱使用与维护课件键合类型键合类型 - - 对色谱分离的影响对色谱分离的影响 单齿键合：单齿键合：提高传质速率提高传质速率, , 加快色谱柱平衡加快色谱柱平衡双齿键合：双齿键合：增加色谱柱稳定性增加色谱柱稳定性, , 增加色谱柱的载增加色谱柱的载样

46、量样量C-18柱-性能影响因素CHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHO OSiSiO OO OO OO OSiSiSiSiSiSiCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHCHSiSi3 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 3SiSiSiSiO OO OSiSiSiSiO OO O高效液相色谱使用与维护课件碳覆盖率碳覆盖率- - 对色谱分离的影响对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率高碳覆盖率：提高分辨率, , 分析时间分析时间长长低碳覆盖率：缩短运行时间低碳覆盖率：缩短运行时间封端封端 - - 对色谱分离的影响对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与

47、硅胶表面残留的酸性封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品对于极性样品, , 未封端与经过封端处理未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异的色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱-性能影响因素高效液相色谱使用与维护课件 固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷 封端封端四甲基硅烷四甲基硅烷SiSiO OOHOHO OO OCHCH3 3SiSiR RCHCH3 3CHCH3 3SiSiCHCH3 3CHCH3 3SiSiR RCHCH3 3R = C8, R = C8, C18, C18, etc etc . .O

48、 OOHOHOHOHO OCHCH3 3SiSiR RCHCH3 3CHCH3 3SiSiR RCHCH3 3+ + +ClClCHCH3 3SiSiCHCH3 3CHCH3 3OHOHOHOHOHOHOHOHCHCH3 3ClClR RCHCH3 3( (TMS)TMS)传统键合及封端技术传统键合及封端技术 高效液相色谱使用与维护课件取代基：五个取代基：五个 旁侧基团旁侧基团: : 异丙基异丙基Zorbax StableBond Zorbax StableBond 空间位阻保护空间位阻保护-抗水解能力抗水解能力键合相键合相流失流失, , 保留减弱保留减弱另一个裸露的硅羟基另一个裸露的硅羟基

49、, , 潜在的拖尾因素潜在的拖尾因素普通硅胶柱低普通硅胶柱低 pH 2 pH 15000:1MV-30.00-25.00-20.00-15.00-10.00-5.000.005.0010.0015.00Minutes2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5AU0.000.020.040.060.080.100.120.14Refractive Index S/N 125:1流动相：MeOH/H2O 60:40流速：1.0 mL/min色谱柱：C18色谱柱温：30 C检测温度：35 C样品： Paraben M

50、ixture高效液相色谱使用与维护课件示差检测器的缺点示差检测器的缺点 不适宜作梯度不适宜作梯度流动相：A= CH3CN/H2O 75:25B= CH3CN流速： 1.4 mL/min色谱柱：NH2色谱柱温：30 C检测温度：35 CMV-2600-2400-2200-2000-1800-1600-1400-1200-1000-800-600-400-2000200400Minutes0246810121416182022242628300% B25 % BChromatography ForumChromatography Forum: : Is RI with a Reverse Phas

51、e gradient possible?Is RI with a Reverse Phase gradient possible?By XXXXXXXXXXXXXXXXXX: I have a good separation of a multi-substituted, cyclohexane that fully resolves 12 different oligomers. I can detect the components by MS, but I would like to use a standard LC detector instead. There is virtual

52、ly no adsorption above 230nm and below 230nm picks up solvent interference. Im considering using RI detection and afterward subtracting a blank run. Is there any hope of this working or would I be wasting my time? 高效液相色谱使用与维护课件示差检测器的缺点示差检测器的缺点 对温度敏感对温度敏感流动相 甲醇 0.25mL / minute检测器温度 35C；没有使用柱温箱Temp.(D

53、eg C)18.519.019.520.0MV-1.000.001.002.00Minutes51015202530354045505560657075室温变化RI 基线高效液相色谱使用与维护课件吸光度（吸光度（Absorbance UV/VisAbsorbance UV/Vis）检测）检测n n目前实验室中最流行的选择n n多数公司约多数公司约75%75%的检测器是吸光度检测器（其中的检测器是吸光度检测器（其中50%50%是多波长，是多波长，25%25%是是PDAPDA）n n测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失n n吸光度与样品浓度呈线性关系n n在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最

54、大高效液相色谱使用与维护课件吸光度检测器（吸光度检测器（UV/VisUV/Vis） 优点优点n n这种检测器简单、可靠n n多数人熟悉并喜欢这种技术n n可以作梯度实验并且是非破坏性的n n大多数有机化合物有一定程度的吸光度n n一般来说灵敏度还可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm高效液相色谱使用与维护课件吸光度检测器（吸光度检测器（UV/VisUV/Vis） 缺点缺点n n由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用由于不是所有化合物都有吸光度，

55、因此不是通用检测器检测器n n对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器n n样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长使用多波长检测，或使用折衷的波长n n受流动相组成的影响：受流动相组成的影响：n n用截止波长以上至少用截止波长以上至少5 510nm10nm作为工作波长作为工作波长n n缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响高效液相色谱使用与维护课件背景吸收的影响背景吸收的影响背景吸收降低背景吸收降低了线性范围了线性范围多数流动相有多数流动相有紫

56、外吸收紫外吸收实际浓度浓度理想1 10 0吸光度吸光度2 21 10 0背景吸收背景吸收背景吸收背景吸收高效液相色谱使用与维护课件背景吸收对紫外检测器噪音的影响背景吸收对紫外检测器噪音的影响UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1

57、% TFA50% ACN with 0.1% TFA高效液相色谱使用与维护课件溶剂混合的基线噪音溶剂混合的基线噪音色谱条件色谱条件色谱柱：C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C.流动相： A: 0.1% TFA in Water.B: 0.1% TFA in Acetonitrile.梯度： 5 - 40% B in 35 min.流速： 1.0 mL/min.样品： 水（10 L inj. vol.）检测： 214 nm 图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统高效液相色谱使用与维护课件为何如此重要？为何如此重要？五个小肽的5ng进样，好的色谱系

58、统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。高效液相色谱使用与维护课件基线噪音对积分的影响基线噪音对积分的影响1.2241.1831.183Caffeine 271 nm高效液相色谱使用与维护课件荧光（荧光（FluorescenceFluorescence）检测）检测n n发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光基态激发态S1S0激发（1）振动能（2）发射（3）1. 1. 分子在吸收分子在吸收UVUV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态。量状态。2. 2. 电子失去

59、过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。3. 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光电子失去能量达到基态时发出荧光共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象高效液相色谱使用与维护课件荧光检测器原理荧光检测器原理高效液相色谱使用与维护课件荧光检测器的应用荧光检测器的应用n n环境中的污染物n n多环芳烃多环芳烃(PAH)(PAH)，多，多酚，氨基甲酸酯等酚，氨基甲酸酯等n n食品、饮料n n食品中的毒素；例食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素如：黄曲霉毒素n n染料染料n n维生素及衍生氨基维生素及衍生氨基酸酸n n生

60、物技术及制药氨基甲酸酯类杀虫剂黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）维生素高效液相色谱使用与维护课件荧光检测器的优点荧光检测器的优点n n选择性提高n n灵敏度提高（在 pg/fg 范围）n n低背景技术mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDAMDAMDAMDA及及及及MDMAMDMAMDMAMDMA柱上柱上柱上柱上200pg200pg200pg200pgExcitation Excitation Excitation Excitation =280=280=28

61、0=280Emission Emission Emission Emission =360=360=360=360高效液相色谱使用与维护课件荧光检测器的缺点荧光检测器的缺点n n不是所有化合物都有荧光，需要衍生n n检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏感n n对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响n n多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。n n有的仪器信号及噪音大于另一台有的仪器信号及噪音大于另一台2 23 3倍，光电倍，光电倍增管的特征是导致这个现象的原因。倍增管的特征是导致这个现象的原因。高效液相色谱使用与维护课件溶

62、剂中溶解的气体对响应值的影响溶剂中溶解的气体对响应值的影响MinutesColumn - PAH Column 27 CEluent A: WaterEluent B: AcetonitrileGradient: 60% B to 100% B using curve 9 in 12 minutesHold 11 minutesBack to initial conditionsFlow Rate 1.2 ml/minInjection: 20ulTime programmed wavelength changes20.521.022.01000 MV充分脱气未充分脱气Fluorescence

63、 Fluorescence DetectorDetector1231. Benzo(b)flouranthene - 400 ppb2. Benzo(k)fluoranthene - 200 ppb3. Benzo(a)pyrene - 200 ppb高效液相色谱使用与维护课件浓度对芘（浓度对芘（PyrenePyrene）最大激发波长的影响）最大激发波长的影响Emission Excitation 103 M 10 5 M在正己烷中From: Turro, N.J., Modern Molecular PhotochemistryMenlo Park CA, Benjamin/Cummings

64、 Publishing, 1978高效液相色谱使用与维护课件蒸发光散射（蒸发光散射（Evaporative Light Evaporative Light ScatteringScattering）n n用氮气把流动相吹成细雾状用氮气把流动相吹成细雾状n n流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉n n蒸发的溶剂被从检测器中除去蒸发的溶剂被从检测器中除去n n溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交束相交n n被颗粒散射的光由光电倍增管（被颗粒散射的光由光电倍增管（PMTPMT）收集）收集n nPMT

65、PMT的输出与溶质的存在量呈比的输出与溶质的存在量呈比例关系例关系高效液相色谱使用与维护课件蒸发光散射检测器原理蒸发光散射检测器原理Evaporative Light ScatteringEvaporative Light Scattering简称：简称：ELSDELSD高效液相色谱使用与维护课件ELSD ELSD 优点及应用领域优点及应用领域n n通用型通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测比流动相挥发性小的物质都能被检测n n可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平n n对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸

66、收的溶剂作流动相流动相n n应用领域：应用领域：n n碳水化合物碳水化合物n n油脂及脂肪酸油脂及脂肪酸n n未衍生的氨基酸未衍生的氨基酸n n制药行业制药行业n n表面活性剂表面活性剂n n天然产物天然产物高效液相色谱使用与维护课件ELSD ELSD 缺点缺点n n不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）n n要求使用雾化气源（典型的是氮气）n n不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化n n破坏性技术n n蒸发出的溶剂要因到户外或通风橱里n n对挥发性化合物的检测不理想n n一般得到的是非线性校正曲线n n某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器高效液相色谱使用与维护课件光电二极管矩阵（

67、光电二极管矩阵（Photo Diode ArrayPhoto Diode Array） Photo Diode ArrayPhoto Diode Array简称：简称：PDAPDA或或DADDAD高效液相色谱使用与维护课件PDAPDA检测器检测器 特点特点三维水平的吸光度检测器三维水平的吸光度检测器二极管矩阵检测二极管矩阵检测器是在器是在19821982年首年首度出现的度出现的在整个在整个UV-VisUV-Vis带带宽上检测吸光度宽上检测吸光度都需要相应的软都需要相应的软件进行数据的分件进行数据的分析析高效液相色谱使用与维护课件PDAPDA检测器的用途及要求检测器的用途及要求n n光电二极管检

68、测器可以提供许多又用的功能n n光谱信息光谱信息n n色谱峰纯度色谱峰纯度n n谱库拟合谱库拟合 n n像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要：n n高的信噪比；好的线性高的信噪比；好的线性n n另外；还需要：n n光学分辨率光学分辨率n n光谱灵敏度及光谱分析软件光谱灵敏度及光谱分析软件高效液相色谱使用与维护课件光学分辨率（带宽）光学分辨率（带宽）好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息230.00250.00270.00nmnmBenzeneBenzene 3.0nm 3.0nm vs

69、 1.0nm1.0nm 损失分辨率，UV最大波长移动 1.0nm3.0nm190nm5.0nm高效液相色谱使用与维护课件分辨率与色谱性能分辨率与色谱性能n n高分辨率给出更多数据点（同样波长范围）n n高分辨率有更好的线性n n低分辨率的数据文件尺寸较小n n宽的光学带宽可以得到更高的光通量（灵敏度）1.2 nm14.4 nm高效液相色谱使用与维护课件PDAPDA的优点及缺点的优点及缺点n n优点n n通用的通用的UV/VisUV/Vis检测检测n n好的选择性、线性好的选择性、线性n n提供色谱峰的提供色谱峰的UV/VisUV/Vis光谱图（峰确认）光谱图（峰确认）n n可提供纯度估计可提供

70、纯度估计n n缺点n n低光学通量（较窄的带宽通量）低光学通量（较窄的带宽通量）n n与普通与普通UV/VisUV/Vis相比更复杂，容易漂移相比更复杂，容易漂移n n灯输出能量随时间降低灯输出能量随时间降低高效液相色谱使用与维护课件色谱图：色谱图：HPLCHPLC图形结果图形结果（ChromatogramChromatogram）色谱图色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。 色谱峰色谱峰保留时间（分）保留时间（分）基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值高效液相色谱使用与维护课件液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语n n色谱峰色谱峰

71、 Peak Peakn n色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线曲线n n峰底峰底 Peak Base Peak Basen n峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线n n峰高峰高 Peak Height Peak Heightn n峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离n n峰宽峰宽 Peak Width Peak Widthn n在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离n n半（高）峰宽半（高）峰宽 Peak Width at Half Height Peak

72、Width at Half Heightn n通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离交两点之间的距离高效液相色谱使用与维护课件液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语n n峰面积峰面积 Peak Area Peak Arean n峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积, ,又称响应值又称响应值n n标准偏差；标准偏差； Standard Error Standard Errorn n0.6070.607倍峰高处所对应峰宽的一半倍峰高处所对应峰宽的一半n n拖尾峰拖尾峰 Tailing Peak Tailing Peakn n后沿较

73、前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰n n前伸峰前伸峰 Leading Peak Leading Peakn n前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰n n鬼峰鬼峰 Ghost Peak Ghost Peakn n并非由试样所产生的峰；亦称假峰并非由试样所产生的峰；亦称假峰高效液相色谱使用与维护课件液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语n n基线基线 Baseline Baselinen n在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线曲线n n基线飘移基线飘移 Baseline Drift Baseline Driftn n基线

74、随时间定向的缓慢变化基线随时间定向的缓慢变化n n基线噪声；基线噪声；N N Baseline Noise Baseline Noisen n由各种因素所引起的基线波动由各种因素所引起的基线波动n n谱带扩展谱带扩展 Band Broadening Band Broadeningn n由于纵向扩散由于纵向扩散, ,传质阻力等因素的影响传质阻力等因素的影响, ,使组分在色谱使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象柱内移动过程中谱带宽度增加的现象高效液相色谱使用与维护课件液相色谱图相关术语液相色谱图相关术语n n死时间，死时间，t t0 0 Dead time Dead timen n不被固定

75、相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间的时间n n保留时间，保留时间，t tR R Retention time Retention timen n组分从进样到出现峰最大值所需的时间组分从进样到出现峰最大值所需的时间n n死体积，死体积，V V0 0 Dead volume Dead volumen n不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积的流动相体积n n保留体积，保留体积，V VR R Retention volume Retention volumen n组分从进样到出现

76、峰最大值所需的流动相体积组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积高效液相色谱使用与维护课件高效液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手高效液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手高效液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手高效液相色谱仪器出现故障可以从多方面入手1 1、观测：、观测：、观测：、观测： 仪器运转的参数；从部件的运转情况推测，如压力、流仪器运转的参数；从部件的运转情况推测，如压力、流仪器运转的参数；从部件的运转情况推测，如压力、流仪器运转的参数；从部件的运转情况推测，如压力、流速的变化速的变化速的变化速的变化. . 色谱图的形状；如出峰时间、峰形色谱图的形状；如出峰时间、峰形色谱图的形状；如出

77、峰时间、峰形色谱图的形状；如出峰时间、峰形 从数据结果中分析从数据结果中分析从数据结果中分析从数据结果中分析 各种流动相的量与质；各种流动相的量与质；各种流动相的量与质；各种流动相的量与质；2 2、伶听：、伶听：、伶听：、伶听： 仪器运转的声音、噪声仪器运转的声音、噪声仪器运转的声音、噪声仪器运转的声音、噪声3 3、促摸：、促摸：、促摸：、促摸： 温度、渗漏温度、渗漏温度、渗漏温度、渗漏高效液相色谱使用与维护课件维护流程图维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器手动进样器检测器高效液相色谱使用与维护课件n n吸滤头定期清洗，更换溶剂时n n单向阀定期清洗，压力波动大时n n泵自动清洗n n在

78、线过滤器压力大时清洗高效液相色谱使用与维护课件材料：不锈钢烧结，孔径材料：不锈钢烧结，孔径10um10um故障：堵塞故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成表现：管路中不断有气泡生成措施：用措施：用5 5稀硝酸，超声波清洗，稀硝酸，超声波清洗， 再用蒸馏水清洗再用蒸馏水清洗吸滤头吸滤头高效液相色谱使用与维护课件故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好表现：系统压力波动大表现：系统压力波动大措施：措施：n n打开排液阀，以异丙醇为流动相输液打开排液阀，以异丙醇为流动相输液n n拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗单向阀单向阀高效

79、液相色谱使用与维护课件故障：堵塞故障：堵塞现象：系统压力波动大或压力现象：系统压力波动大或压力 偏高偏高措施：措施：5 5稀硝酸，超声波清洗稀硝酸，超声波清洗判断依据判断依据：关闭排液阀，断开出：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速口管路，设定流速1mL/min1mL/min，如压力如压力3kgf/cm3kgf/cm2 2，则堵塞。则堵塞。线路过滤器线路过滤器排液阀压力传感器线路过滤器流动相高效液相色谱使用与维护课件泵的保养：泵的保养：n n使用流动相尽量要清洁；n n进液处的砂芯过滤头要经常清洗；n n流动相交换时要防止沉淀； n n避免泵内堵塞或有气泡；n n每次分析结束后，要反复冲洗进样口

80、，防止样品的交叉污染；高效液相色谱使用与维护课件n n柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；n n当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；n n要注意流动相的脱气；要注意流动相的脱气；n n避免使用高粘度的溶剂作为流动相；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；n n进样样品要提纯；进样样品要提纯；n n严格控制进样量；严格控制进样量；n n每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；n n每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；每天分析测定结束后

81、，都要用适当的溶剂来清洗柱；n n若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；柱的保养：柱的保养：高效液相色谱使用与维护课件色谱柱柱内体积和平衡时间色谱柱柱内体积和平衡时间单次样品运行时间单次样品运行时间 = 分析时间分析时间 + 色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积倍柱内体积 流速流速4.6 x 500.5 mL5 min4.6 x 300.3 mL3 min4.6 x 150.15 mL1.5 min4.6 x 1501.54 mL15 min2.1 x 500.10 mL5 min60 sec2.

82、1 x 300.06 mL3 min36 sec2.1 x 150.03 mL1.5 min18 sec色谱柱色谱柱柱内柱内 平衡时间平衡时间 尺寸尺寸体积体积 流速流速(mm)(Vm) 1.0 mL/min色谱柱色谱柱柱内柱内 平衡时间平衡时间 尺寸尺寸体积体积 流速流速(mm)(Vm) 0.2 mL/min 1.0 mL/min高效液相色谱使用与维护课件清洗液相色谱柱清洗液相色谱柱冲洗色谱柱冲洗色谱柱-用比用比流动相更强的溶剂流动相更强的溶剂反相色谱柱反相色谱柱用以下溶剂至少各用以下溶剂至少各25mL25mL冲洗色谱柱冲洗色谱柱( (分析柱分析柱) ) 不含缓冲盐的流动相不含缓冲盐的流动相

83、100%100%甲醇甲醇100%100%乙腈乙腈75%75%乙腈乙腈+25%+25%异丙醇异丙醇100%100%异丙醇异丙醇100%100%二氯甲烷二氯甲烷 * *100%100%己烷己烷* * *若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱, , 则在重新使用反相则在重新使用反相流动相以前流动相以前, , 必须用异丙醇冲洗色谱柱必须用异丙醇冲洗色谱柱 ! !正相色谱柱正相色谱柱用以下溶剂至少各用以下溶剂至少各50mL50mL冲洗色谱柱冲洗色谱柱( (分析柱分析柱) ) 50%50%甲醇甲醇+50%+50%三氯甲烷三氯甲烷100%100%乙酸乙酯乙酸乙酯高效液相色谱使用与维护课

84、件灯的保养：灯的保养：n n在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。n n样品池要保养高效液相色谱使用与维护课件实验操作实验操作n n样品前处理n n流路检查n n排气、溶剂更换高效液相色谱使用与维护课件色谱柱的连接 各种锥箍和管路接头长度示意图: 高效液相色谱使用与维护课件色谱柱的连接 Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 高效液相色谱使用与维护课件锥箍锥度不合适造成渗漏 色谱柱的连接 高效液相色谱使用与维护课件启动液相色谱仪器的流程 高效液相色谱使用与维护课件样品溶剂溶解强度样品溶剂溶解强度 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰样

85、品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰色谱柱色谱柱: ZORBAX StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm : ZORBAX StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相流动相: 82% H: 82% H2 2O : 18% ACNO : 18% ACN进样体积进样体积: 30 mL: 30 mLA.A.样品溶剂样品溶剂100% 100% 乙腈乙腈0 100 10Time (min)Time (min)1 12 2B.B.样品溶剂样品溶剂流动相流动相0 100 10Time (min)Time (min)1

86、 12 2样品样品: : 1. Caffeine (1. Caffeine (咖啡因咖啡因) ) 2. Salicylamide (2. Salicylamide (水杨酰胺水杨酰胺) )161高效液相色谱使用与维护课件中性分析时为何要使用缓冲液？中性分析时为何要使用缓冲液？色谱柱色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 75 mm, 3.5 m : ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相流动相: 44% A : 56% : 44% A : 56% 甲甲醇醇流速流速: 1.0 mL/min : 1.0 mL/min

87、温度温度: 25C : 25C 检测检测: UV 250 nm: UV 250 nm含缓冲液的流动相可改善保留含缓冲液的流动相可改善保留, , 分离和色谱峰峰形分离和色谱峰峰形. .样品样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibuprofen: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranol

88、ol 7. ibuprofenA = pH 7.0A = pH 7.0水水A = pH 7.0 A = pH 7.0 水水+25 mM +25 mM 磷酸缓冲液磷酸缓冲液0 01 12 23 34 45 5Time (min)Time (min)1 12 23 34 46 67 75 50 01 12 23 34 41, 4, 6, 71, 4, 6, 72 23 35 5Time (min)Time (min)高效液相色谱使用与维护课件0 2.5 5.0 7.5Time (min)1234560 2.5 5.0Time (min)123456增加缓冲液浓度减少拖尾增加缓冲液浓度减少拖尾色谱柱

89、色谱柱: :ZORBAX Eclipse XDB-C8ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm, 5 mm4.6 x 150 mm, 5 mm流动相流动相: :40% 40% 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液60% ACN60% ACN流速流速: :1.5 mL/min.1.5 mL/min.温度温度: :4040CCUSP TfUSP Tf1.1.1.621.622.2.1.651.653.3.1.631.634.4.1.771.775.5.1.831.836.6.1.121.1210 mM 10 mM 磷酸盐磷酸盐pH 7.0pH 7.0USP TfUSP Tf1.1.1

90、.411.412.2.1.501.503.3.1.331.334.4.1.391.395.5.1.361.366.6.1.001.0025 mM 25 mM 磷酸盐磷酸盐pH 7.0pH 7.0 在中等在中等pHpH下下, , 离子强度较高离子强度较高, , 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾样品样品: :Tricyclic AntidepressantsTricyclic Antidepressants（三环抗抑郁剂）（三环抗抑郁剂）1. Desipramine1. Desipramine（脱甲丙咪嗪）（脱甲丙咪嗪）2. Nortriptyline2. No

91、rtriptyline（去甲替林）（去甲替林）3. Doxepin3. Doxepin（多塞平）（多塞平）4. Imipramine4. Imipramine（丙咪嗪）（丙咪嗪）5. Amitriptyline5. Amitriptyline（阿米替林）（阿米替林）6. TrImipramine6. TrImipramine（三甲丙咪嗪）（三甲丙咪嗪）高效液相色谱使用与维护课件TEATEA对碱性成分峰形的影响对碱性成分峰形的影响0 2.5 5.00 2.5 5.0Time (min)Time (min)1 12 23 34 45 5色谱柱色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8,

92、4.6 x 150 mm, 5 mm : ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相流动相: 85% 25 mM Na: 85% 25 mM Na2 2HPOHPO4 4 : 15% ACN : 15% ACN 流速流速: 1.0 mL/min. : 1.0 mL/min. 温度温度: 35: 35CCUSP TF 5%USP TF 5%1. 1.291. 1.292. 1.332. 1.333. 1.633. 1.634. 2.354. 2.355. 1.575. 1.57No TEANo TEA10 mM TEA10 mM TEAUSP TF

93、 5%USP TF 5%1. 1.191. 1.192. 1.182. 1.183. 1.203. 1.204. 1.264. 1.265. 1.145. 1.14Time (min)Time (min)0.00.02.52.55.05.03 35 54 42 21 1pH 7样品样品: :1. Phenylpropanolamine 1. Phenylpropanolamine （去甲麻黄碱）（去甲麻黄碱） 2. Ephedrine2. Ephedrine（麻黄素）（麻黄素）3. Amphetamine3. Amphetamine（苯丙胺）（苯丙胺） 4. MethAmphetamine4.

94、 MethAmphetamine（脱氧麻黄碱）（脱氧麻黄碱）5. Phenteramine 5. Phenteramine （苯丁胺）（苯丁胺）高效液相色谱使用与维护课件竞争酸对酸性组分的峰形的影响竞争酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱色谱柱: :ZORBAX StableBond SB-C18ZORBAX StableBond SB-C184.6 x 150 mm, 5 mm4.6 x 150 mm, 5 mm流动相流动相: :40% A: 60% ACN40% A: 60% ACN流速流速: :1.0 mL/min.1.0 mL/min.温度温度: :室温室温样品样品: :IbuprofenI

95、buprofen（异丁苯丙酸）（异丁苯丙酸） pKa 4.4 pKa 4.4pH 3pH 35 mM NaH5 mM NaH2 2POPO4 4T Tf f = 1.8 = 1.8pH 3pH 35 mM NaH5 mM NaH2 2POPO4 41% 1% 乙酸乙酸pH 2.5pH 2.50.1% 0.1% 三氟乙酸三氟乙酸T Tf f = 1.0 = 1.0T Tf f = 1.09 = 1.09A:A: 乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中 三氟乙酸由于所需浓度较低三氟乙酸由于所需浓度较低, , 可作为首选可作为首选高效液相色谱使用与维护课

96、件色谱柱技术色谱柱技术 5988-6467EN 5988-6467EN流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE40)(TE40)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8: ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5m: 4.6 x 50 mm 3.5m部件号部件号: 935967-906: 935967-906UV: 254 nmUV: 254 nm流速流速: 1 mL/ min.: 1 mL/ min.室温室温1.1.UracilUracil2.2.ButylparabenButylparaben3.3.Nap

97、hthaleneNaphthalene4.4.DipropylphthalateDipropylphthalate5.5.AcenaphtheneAcenaphthene1.1.尿嘧啶尿嘧啶2.2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.3.萘萘4.4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.5.苊苊刻度混合刻度混合: Dial-a-Mix: Dial-a-Mix A: A: 水水 B: B: 甲醇甲醇, , 用泵抽取用泵抽取50% 50% B B体积比混合体积比混合: Vol/Vol: Vol/Vol250 mL250 mL水水 + 250 mL + 250 mL甲醇甲醇, , 用泵抽取用泵抽取100%

98、100%混合液混合液定容混合定容混合: Mix-to-Mark : Mix-to-Mark 250 mL250 mL甲醇甲醇, , 用水定容至用水定容至500 mL, 500 mL, 用泵抽取用泵抽取100%100%混合液混合液预混合（重量比混合）预混合（重量比混合）: Premixed (w/w) : Premixed (w/w) 200 g200 g甲醇甲醇 + 200 g + 200 g水水, , 用泵抽取用泵抽取100%100%混混合液合液改变流动相配比方改变流动相配比方式式, , 可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件液相分析液相分析- -小诀窍小

99、诀窍1.1.提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2.2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3.3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）敏度）4.4.减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）5.5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6.6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7.7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）

100、度）8.8.改变流动相改变流动相pH pH ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）9.9.改变有机相改变有机相% % ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）10.10.改变键合相改变键合相 ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）11.11.改变有机添加剂改变有机添加剂 ，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）12.12.改变流动相配比方式改变流动相配比方式 ，可增加柱效（提高灵，可增加柱效（提高灵敏度）敏度）高效液相色谱使用与维护课件生化生化 多肽多肽- 5988-6316EN- 5988-6316EN升温对于反相升温对于反相 HPLC H

101、PLC分离强疏水肽的影响分离强疏水肽的影响 (B27) (B27)PolypeptidePolypeptide流动相流动相: : A: A: 含含0.05%0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水B: B: 含含0.05%0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2% B / min2% B / min进样量进样量: 100L (50g: 100L (50g的的6M6M脲脲/5%/5%乙酸乙酸) )UV: 210 nmUV: 210 nm流速流速: 1 mL/min: 1 mL/min室温室温液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18: ZORBAX StableBond-C18

102、色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m: 4.6 x 250 mm 5m部件号部件号: 880975-902: 880975-902室温室温30300 0C C40400 0C C50500 0C C60600 0C C70700 0C C提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件环保环保样品样品: : 除草剂除草剂流动相流动相: : 52/48 52/48 0.1 0.1 M M乙乙酸酸钠钠/ /甲醇甲醇, pH 6, pH 6流速流速: : 0.45 mL/min0.45 mL/min温度温度: : 40, 9040, 9

103、0检测检测: : UVUV除草剂除草剂: : 柱温的影响柱温的影响Herbicides: Effect of Column TemperatureHerbicides: Effect of Column Temperature1. 1. 西玛津西玛津2. 2. 敌草隆敌草隆3. 3. 扑灭津扑灭津4. 4. 扑灭净扑灭净5. 5. 异丙甲草胺异丙甲草胺1. Simazine1. Simazine2. Diuron2. Diuron3. Propazine3. Propazine4. Prometryn4. Prometryn5. 5. MetolachMetolachlorlor液相色谱柱液相

104、色谱柱: Zorbax StableBond-C18: Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m: 4.6 x 150 mm, 5m部件号部件号: 883975-902: 883975-902 目录目录P625P62540409090提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax 300 StableBond-C3: Zorbax 300 StableBond-C3色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m : 4.6 x

105、150 mm, 5m 部件号部件号: 883995-909: 883995-909肽类肽类/ /蛋白质蛋白质: : 升温对分离的影响升温对分离的影响Peptides/Proteins: Peptides/Proteins: Effect of Elevated TemperatureEffect of Elevated Temperature样品样品: : 多肽多肽 流动相流动相: : A A = = 5: 5: 95, 95, 乙乙腈腈 : : 水水, , 0.10%0.10%三三氟氟乙乙酸酸 (V/V%)(V/V%)B B = = 95: 95: 5, 5, 乙乙腈腈 : : 水水, ,

106、0.085%0.085%三三氟氟乙乙酸酸 (V/V%)(V/V%)梯度梯度: : 在在 20 20 minmin内内 15-53%, 15-53%, 后后运运行行时时间间 12 12 minmin流速流速: : l.0 mL/min l.0 mL/min 温度温度: : 室温室温 -60 -60检测检测: : UV 215 nmUV 215 nm1. 1. 亮氨酸脑啡呔亮氨酸脑啡呔 2. 2. 血管紧张素血管紧张素II II 3. 3. 核糖核酸酶核糖核酸酶A A 4. 4. 牛胰岛素牛胰岛素 5. 5. 细胞色素细胞色素C C 6. 6. 溶菌酶溶菌酶 7. 7. 肌红蛋白肌红蛋白 8. 8

107、. 碳酸酐酶碳酸酐酶1. 1. Leucine Leucine EnkephalinEnkephalin2. Angiotensin II2. Angiotensin II3. Rnase A3. Rnase A4. Insulin(BOV)4. Insulin(BOV)5. Cytochrome C5. Cytochrome C6. Lysozyme6. Lysozyme7. Myoglobin7. Myoglobin8. 8. Carbonic Carbonic anhydraseanhydrase 目录目录P611P611提高柱温，提高柱温，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度

108、）高效液相色谱使用与维护课件生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax StableBond-C8: Zorbax StableBond-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 150 mm, 5m: 150 mm, 5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏度Reducing Capillary ID to Improve SensitivityReducing Capillary ID to Improve Sensitivityfor Concentration-Limited Samplesfor Concentration-Limited S

109、amples流动相流动相: : 60%60%乙腈乙腈/40%/40%水水流速流速: : 内径内径 0.3 mm-4 uL/min 0.3 mm-4 uL/min内径内径 0.5 mm-10 uL/min 0.5 mm-10 uL/min内径内径 1.0 mm-50 uL/min 1.0 mm-50 uL/min内径内径 4.6 mm-1.0 uL/min 4.6 mm-1.0 uL/min温度温度: : 室温室温检测器检测器: : UV 254 nmUV 254 nm样品样品: : 200 ng200 ng联二苯联二苯 (100 nl) (100 nl) 目录目录P611P611减小柱径，可增

110、减小柱径，可增加柱效（提高灵加柱效（提高灵敏度）敏度）高效液相色谱使用与维护课件色谱柱技术色谱柱技术 5988-6454EN 5988-6454EN使用小体积色谱柱对于检测器响使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性应时间的重要性 (TE32) (TE32)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBond-C18: ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 15 mm 3.5m: 4.6 x 15 mm 3.5m部件号部件号: 831975-902: 831975-902流动相流动相: : 乙腈乙腈: 1%: 1%甲酸甲酸=32: 68=32:

111、68UV: 254 nmUV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min.: 1.0 mL / min. 30C 30C进样量进样量: 5 L: 5 L响应时间响应时间: 4.0: 4.0秒秒响应时间响应时间: 2.0: 2.0秒秒响应时间响应时间: 1.0: 1.0秒秒响应时间响应时间: 0.5: 0.5秒秒响应时间响应时间: 0.1: 0.1秒秒1.1.尿嘧啶尿嘧啶2.2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.3.N-N-乙酰苯胺乙酰苯胺1.1.UracilUracil2.2.Acetylsalicylic acidAcetylsalicylic acid3.3.AcetanilideAceta

112、nilide缩短检测器响应时间，可缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）增加柱效（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件色谱柱技术色谱柱技术 5988-6428EN 5988-6428EN不同硅胶类型比较不同硅胶类型比较 (TE1) (TE1)流动相流动相: : 含含0.05%0.05%甲醇的二氯甲烷甲醇的二氯甲烷 液相色谱柱液相色谱柱1.1.toluenetoluene2.2.benzanilidebenzanilide3.3.phenolphenol4.4.benzyl alcoholbenzyl alcoholZorbax SilZorbax SilSpherisorbSpheri

113、sorbZorbax Rx-SilZorbax Rx-Sil1.1.甲苯甲苯2.2.N-N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺3.3.苯酚苯酚4.4.苯甲醇苯甲醇使用高纯硅胶，使用高纯硅胶，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件有机化学有机化学 5988-6366EN 5988-6366ENpHpH对苯胺取代物分析的影响对苯胺取代物分析的影响 (ORCH1) (ORCH1)流动相流动相25mM25mM磷酸磷酸: : 甲醇甲醇=58: 42 =58: 42 流速流速: 1 mL/min : 1 mL/min 22C22C液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBo

114、nd-C18: ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m: 4.6 x 150 mm 5m部件号部件号: 883975-902: 883975-9021.1.对位甲氧基苯胺对位甲氧基苯胺2.2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.3.3-3-氨基氨基- -苯甲腈苯甲腈4.4.对位氯苯胺对位氯苯胺5.5.间位氯苯胺间位氯苯胺6.6.邻位氯苯胺邻位氯苯胺1.1.p-anisidinep-anisidine2.2.m-toluidinem-toluidine3.3.3-amino-benzonitrile3-amino-benzonitrile4.4.p-

115、chloroanilinep-chloroaniline5.5.m-chloroanilinem-chloroaniline6.6.o-chloroanilineo-chloroanilinepH: 2.5pH: 2.5pH: 7.0pH: 7.0改变流动相改变流动相pHpH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件生化生化 肽肽 5988-6293EN 5988-6293EN三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响 (B10) (B10)PeptidePeptide流动相流动相: : A: A: 水和三氟乙酸水和三氟乙酸B: B:

116、 乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0 - 30% B 0 - 30% B （30 min.30 min.内）内）流速流速: 1 mL/min: 1 mL/minUV: 254 nmUV: 254 nm进样量进样量: 6uL: 6uL十肽菌素标样十肽菌素标样S1-S5S1-S5（疏水性有略微差异）（疏水性有略微差异）4040C C液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX 300 SB-C8: ZORBAX 300 SB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m: 4.6 x 150 mm 5m部件号部件号: 883995-906: 883995-9061.0%1.0%三氟乙酸三氟乙酸0

117、.05%0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%0.25%三氟乙酸三氟乙酸改变流动相改变流动相pHpH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件食品分析食品分析 5988-6360EN 5988-6360EN流动相强度对单糖和二糖分离的影响流动相强度对单糖和二糖分离的影响 (FD4) (FD4)流动相流动相: : 乙腈乙腈/ /水如图水如图流速流速: 1 mL/min: 1 mL/min示差折光检测器示差折光检测器液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX NH2 : ZORBAX NH2 色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m: 4.6 x 250 m

118、m 5m部件号部件号: 880952-708: 880952-7081.1.果糖果糖2.2.葡糖葡糖3.3.蔗糖蔗糖4.4.PalatinosePalatinose5.5.海藻糖海藻糖6.6.异麦芽糖异麦芽糖1.1.FructoseFructose2.2.GlucoseGlucose3.3.SaccharoseSaccharose4.4.PalatinosePalatinose5.5.TrehaluloseTrehalulose6.6.IsomaltoseIsomaltose乙腈乙腈/ /水水70/3070/30 乙腈乙腈/ /水水75/25 75/25 改变有机相改变有机相% %，可增加柱效

119、可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件色谱柱技术色谱柱技术 5988-6468EN 5988-6468EN有机改性剂和有机改性剂和pHpH对于选择性的影响对于选择性的影响 (TE5) (TE5)流动相流动相: : 25 mM25 mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液流速流速: 1.0 mL/min.: 1.0 mL/min.22C22C液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX StableBond-CN: ZORBAX StableBond-CN色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m: 4.6 x 150 mm 5m部件号部件号: 883975-905: 883975

120、-9051.1.anisidineanisidine2.2.m-toluidinem-toluidine3.3.4-cl-aniline4-cl-aniline4.4.3-aminobenzonitrile3-aminobenzonitrile5.5.3-cl-aniline3-cl-aniline6.6.2-cl-aniline2-cl-aniline1.1.甲氧基苯胺甲氧基苯胺2.2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.3.4-4-氯氯- -苯胺苯胺4.4.3-3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈5.5.3-3-氯氯- -苯胺苯胺6.6.2-2-氯氯- -苯胺苯胺42%42%甲醇甲醇 ：58%58%缓冲液缓冲液

121、30%30%甲醇甲醇 ：70%70%缓冲液缓冲液pH 2.6pH 2.6pH 3.0pH 3.0改变有机相改变有机相% %，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件色谱柱技术色谱柱技术 5988-6453EN 5988-6453ENZORBAX EclipseZORBAX Eclipse系列色谱柱的选系列色谱柱的选择性择性 (TE31) (TE31)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m: 4.6 x 150 mm 5

122、m部件号部件号: 993967-912: 993967-912流动相流动相: : 甲醇甲醇 : : 水水=70: 30=70: 30UV: 254 nmUV: 254 nm流速流速: 1.0 mL / min.: 1.0 mL / min.室温室温Zorbax Eclipse XDB-Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C18Zorbax Eclipse XDB-C181.1.尿嘧啶尿嘧啶2.2.苯酚苯酚3.3.4-4-氯氯- -硝基苯硝基苯4.4.甲苯甲苯5.5

123、.萘萘1.1.UracilUracil2.2.PhenolPhenol3.3.4-Cl-nitrobenzene4-Cl-nitrobenzene4.4.TolueneToluene5.5.NaphthaleneNaphthalene改变键合相，改变键合相，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件生物制药生物制药液相色谱柱液相色谱柱: Zorbax Extend-C18: Zorbax Extend-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 2.1 x 150 mm, 5um: 2.1 x 150 mm, 5um部件号部件号: 773700-902: 773700-902

124、三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类RP-HPLCESI-MSRP-HPLCESI-MS分离的选择性比较分离的选择性比较Selectivity Comparison of TFA and Selectivity Comparison of TFA and NHNH4 4OH for Peptide RP-HPLCESI-MS AnalysisOH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis流速流速: : 0.25 mL/min. 0.25 mL/min. 温度温度: : 25 25 梯度梯度: : 5-60% B in 20 min.5-60% B i

125、n 20 min.LC/MS: LC/MS: 正离子正离子, ESI- Vf 70V, Vcap 4.5 kV, , ESI- Vf 70V, Vcap 4.5 kV, N2- N2- 35 35 psi, psi, 12 12 L/min., L/min., 300300样品样品: : 4L (4L (各各50 ng)50 ng)三氟乙酸条件三氟乙酸条件: : A- 0.1%A- 0.1%三氟乙酸水溶液三氟乙酸水溶液B-0.085%B-0.085%三氟乙酸三氟乙酸 80% 80%的乙腈溶液的乙腈溶液NH4OHNH4OH条件条件: : A- 20 mM NH4OHA- 20 mM NH4OH水

126、溶液水溶液B- 20 mM NH4OH 80%B- 20 mM NH4OH 80%的乙腈溶液的乙腈溶液 目录目录P613P613改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件生化生化 肽肽 十肽菌素十肽菌素 5988-6299EN 5988-6299EN酸对于反相肽的分离的影响酸对于反相肽的分离的影响(B16)(B16)decapeptidedecapeptide流动相流动相: : A: A: 含相应的酸的水相含相应的酸的水相 B: B: 含相应的酸的乙腈含相应的酸的乙腈 0%-30% B0%-30% B（30 min.30 min.

127、内）内）进样量进样量: 6L: 6L肽标样肽标样UV: 254 nmUV: 254 nm流速流速: 1 mL/min: 1 mL/min40C40C液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX 300 SB-C8 : ZORBAX 300 SB-C8 色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 150 mm 5m: 4.6 x 150 mm 5m部件号部件号: 883995-906: 883995-9061.1.十肽菌素十肽菌素 S1S12.2.十肽菌素十肽菌素 S2S23.3.十肽菌素十肽菌素 S3S34.4.十肽菌素十肽菌素 S4S45.5.十肽菌素十肽菌素 S5S51.1.decapeptidedeca

128、peptide S1 S1 2.2.decapeptidedecapeptide S2 S2 3.3.decapeptidedecapeptide S3 S3 4.4.decapeptidedecapeptide S4 S4 5.5.decapeptidedecapeptide S5 S50.1% 0.1% 三氟乙酸三氟乙酸0.025 M H0.025 M H3 3POPO4 4改变有机添加剂，改变有机添加剂，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件色谱柱技术色谱柱技术 5988-6467EN 5988-6467EN流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响(TE4

129、0)(TE40)液相色谱柱液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C8: ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5m: 4.6 x 50 mm 3.5m部件号部件号: 935967-906: 935967-906UV: 254 nmUV: 254 nm流速流速: 1 mL/ min.: 1 mL/ min.室温室温1.1.UracilUracil2.2.ButylparabenButylparaben3.3.NaphthaleneNaphthalene4.4.DipropylphthalateDipropylphthalate

130、5.5.AcenaphtheneAcenaphthene1.1.尿嘧啶尿嘧啶2.2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.3.萘萘4.4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.5.苊苊刻度混合刻度混合: Dial-a-Mix: Dial-a-Mix A: A: 水水 B: B: 甲醇甲醇, , 用泵抽取用泵抽取50% B50% B体积比混合体积比混合: Vol/Vol: Vol/Vol250 mL250 mL水水 + 250 mL + 250 mL甲醇甲醇, , 用泵抽取用泵抽取100%100%混合液混合液定容混合定容混合: Mix-to-Mark : Mix-to-Mark 250 mL250 mL

131、甲醇甲醇, , 用水定容至用水定容至500 mL, 500 mL, 用泵抽取用泵抽取100%100%混合液混合液预混合（重量比混合）预混合（重量比混合）: Premixed (w/w) : Premixed (w/w) 200 g200 g甲醇甲醇 + 200 g + 200 g水水, , 用泵抽取用泵抽取100%100%混合混合液液改变流动相配比方改变流动相配比方式，可增加柱效式，可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）高效液相色谱使用与维护课件倍数倍数前缀前缀符号符号1,000,000,000,000,000,000 = 101,000,000,000,000,000,000 = 10181

132、8exa-exa-E E1,000,000,000,000,000 = 101,000,000,000,000,000 = 101515peta-peta-P P1,000,000,000,000 = 101,000,000,000,000 = 101212tera-tera-T T1,000,000,000 = 101,000,000,000 = 109 9giga-giga-G G1,000,000 = 101,000,000 = 106 6 mega-mega-M M1,000 = 101,000 = 103 3kilo-kilo-K K100 = 10100 = 102 2hecto-

133、hecto- H H10 = 1010 = 101 1deka-deka-dada0.1 = 100.1 = 10-1-1deci-deci-d d0.01 = 100.01 = 10-2-2centi-centi- c c0.001 = 100.001 = 10-3-3milli-milli- m m0.000 001 = 100.000 001 = 10-6-6micro-micro- u u0.000 000 001 = 100.000 000 001 = 10-9-9nano-nano-n n0.000 000 000 001 = 100.000 000 000 001 = 10-12

134、-12pico-pico-p p0.000 000 000 000 001 = 100.000 000 000 000 001 = 10-15-15femto-femto- f f0.000 000 000 000 000 001 = 100.000 000 000 000 000 001 = 10-18-18atto-atto-a appm ( part per million) = mg/kg, ug/g, ng/mg, pg/ug, mg/L, ug/mL, ppm ( part per million) = mg/kg, ug/g, ng/mg, pg/ug, mg/L, ug/mL,

135、 ng/uLng/uLppb ( part per billion) = ug/kg, ng/g, pg/mg, ug/L, ng/mL, pg/uLppb ( part per billion) = ug/kg, ng/g, pg/mg, ug/L, ng/mL, pg/uLppt ( part per trillion) = ng/kg, pg/g, fg/mg, ng/L, pg/mL, fg/uLppt ( part per trillion) = ng/kg, pg/g, fg/mg, ng/L, pg/mL, fg/uL附录附录-1-1mg/mL = 1,000 ppmmg/mL

136、= 1,000 ppm高效液相色谱使用与维护课件反相反相HPLCHPLC常用缓冲液常用缓冲液 缓冲液缓冲液pKapKapHpH范围范围磷酸盐磷酸盐pK1pK12.12.11.13.11.13.1柠檬酸盐柠檬酸盐pK1pK13.13.12.14.12.14.1甲酸盐甲酸盐3.83.82.8 4.8 2.8 4.8 柠檬酸盐柠檬酸盐pK2pK24.74.73.75.7 3.75.7 乙酸盐乙酸盐4.84.83.85.8 3.85.8 柠檬酸盐柠檬酸盐pK3pK35.45.44.46.4 4.46.4 磷酸盐磷酸盐pK2pK27.27.26.28.26.28.2羟甲基甲胺羟甲基甲胺8.38.37.3

137、9.3 7.39.3 氨氨9.29.28.210.2 8.210.2 硼酸盐硼酸盐9.29.28.210.2 8.210.2 甘氨酸甘氨酸9.89.88.810.8 8.810.8 1-1-甲基甲基- -哌啶哌啶10.310.39.311.3 9.311.3 四氢化吡咯四氢化吡咯10.510.59.511.5 9.511.5 二乙胺二乙胺10.510.59.511.5 9.511.5 三乙胺三乙胺10.710.79.711.7 9.711.7 磷酸盐磷酸盐pK3pK312.312.311.313.311.313.3pH 2.5pH 2.5磷酸磷酸 0.1% 0.1%三氟乙酸三氟乙酸 0.1% 0.1%附录附录-2-2高效液相色谱使用与维护课件超高效液相色谱超高效液相色谱n n管路n n接头n n色谱柱n n柱前过滤器高效液相色谱使用与维护课件液质联用液质联用n n流动相n n色谱柱n n流量n n离子源n n真空高效液相色谱使用与维护课件n谢谢！谢谢！高效液相色谱使用与维护课件