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1、读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思绪论一 酶是生物催化剂酶是具有生物催化功能的生物大分子，按其化学组成的不同可以分为两类：蛋白类酶（P-酶）与核酸类酶（R-酶） 。理解： 1、酶是由生物细胞产生2、酶发挥催化功能不仅在细胞内，在细胞外亦可二酶学研究简史1897 年，Buchner 兄弟发现， 用石英砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液能和酵母细胞一样进行酒精发酵。标志着酶学研究的开始。说明： 酶分子不仅只是在细胞内起作用，而且在细胞外同样具有催化功能。这一发现开启了现代酶学，乃至现代生物化学的大门。三酶工程的现状：目前大规模利用和生产的商品酶还很少。第一章酶学概论第一节酶作为生物催化剂的显著特点一
2、 酶作为生物催化剂的显著特点：高效、专一二 同工酶（概） ：能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶。三共价修饰调节1 概念：通过其它的酶对其结构进行共价修饰，从而使其在活性形式和非活性形式之间相互转变。2 常见修饰类型：磷酸化与去磷酸化；腺苷酸化与脱腺苷酸化；尿苷酸化与脱尿苷酸化；泛素化；类泛素化3 例子：糖原磷酸化酶磷酸化形式有活性（葡萄糖）n+Pi （葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖4 常见磷酸化部位：丝氨酸/苏氨酸，酪氨酸和组氨酸四酶活性调节方式要能判断所举酶的例子是什么类型调节1. 别构调节2. 激素调节：如乳糖合酶修饰亚基的水平是由激素控制的。妊娠时，修饰亚基在
3、乳腺生成。分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。3. 共价修饰调节：如糖原磷酸化酶、磷酸化酶b 激酶4限制性蛋白水解作用与酶活性控制。如酶原激活5抑制剂和激活剂的调节6反馈调节7金属离子和其它小分子化合物的调节8蛋白质剪接精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思五反馈调节（概） ：催化某物质生成的第一步反应的酶的活性，往往被其终端产物所抑制。这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。A-J：代谢物实线箭头：酶促催化步骤虚线箭头：反馈抑制步骤代谢途径的
4、第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。六蛋白质剪接（概） ： 一个单一的前体蛋白通过剪接机制可以产生多种蛋白质（酶）分子，从而具有不同的功能或活性。蛋白质剪接中，被切去的肽段称为内含肽(intein )，连接起来形成成熟蛋白质的肽段称为外显肽(extein)。蛋白质剪接的机制目前仍然是不清楚的。第二节酶的组成、分类和命名一 酶的化学组成掌握酶蛋白和辅因子在酶促反应中的作用，一个决定了酶和底物结合的性质，即酶的专一性，还有决定了酶催化反应的类型。二国际系统分类法及编号1六大蛋白类酶氧化还原类酶AH2+B A+BH2转移酶AB+C A+BC水解酶ABH2O AOH+BH裂
5、合酶AB A+B异构酶连接酶或合成酶A+B+ATP AB ADP+Pi （或 ABAMP+PPi）在ATP供能下，将A 和 B结合在一起2 两个比较容易混淆的酶1）氧化磷酸化与光合磷酸化中，以跨膜质子动力势为动力推动ATP形成的酶是ATP合成酶还是ATP合酶？催化的反应：ADP+Pi ATP 裂合酶的逆向反应合成酶： synthetase; 合酶： synthase 答：应该叫做合酶2）DNA (RNA)聚合酶属于六大类酶中的什么类型？催化的反应： dATP+DNA DNA-dAMP+PPi dATP = dAMP+PPi 通式： AB+C AC+B 所以属于转移酶要记住各大类酶的编号，作用特
6、点，会判断反应类型第三节酶的活力测定一酶活力 (概 )：在一定条件下，酶所催化的化学反应速度，它可以用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思二酶活力测定方法的注意事项：1底物及底物浓度的选择a.根据其专一性选择底物；b.一般采用高底物浓度测定法(10-20 Km)，因为高底物浓度时反应速度无限接近于最大速度，10-20 Km，接近又不浪费注意： 不是所有酶测定酶活是都采用高底物浓度测定法，有底物抑制作用的酶（即在高底物浓度条件下活性降低的酶
7、不能用这种方法）三比活力（概） ：在特定条件下，每毫克(mg)酶蛋白所具有的酶活力单位数，即：酶比活力 =酶活力（单位）/mg 蛋白。它是酶纯度的一个指标。四酶的转换数（概） ：又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔 （或微摩尔） 酶每分钟催化底物转变为产物的摩尔（或微摩尔）数，是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示，单位为min-1。五. 酶的催化周期（概） ：是指酶进行一次催化所需的时间，单位为毫秒或微秒。在数值上等于酶的转换数的倒数。第四节酶的结构与功能一酶分子中的氨基酸残基对酶促反应的不同贡献四种残基，列出作用后要能判断是哪一种类型二
8、酶的活性部位（中心）掌握概念和结构组成的两部分1概念：酶分子中，显示酶的催化活性的特殊部位称为活性部位。2结构组成：*底物结合部位与催化部位并不是绝对的，活性中心的某些基团同时兼有这两种功能。三酶活性基团的鉴定：掌握两种物理方法的特点掌握酶分子三种失活所对应的集团)molIUKcat酶微摩尔数（）酶活力单位数（分钟酶摩尔数或微摩尔数尔数底物转变摩尔数或微摩精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思四 酶的结构改变对其催化功能的影响掌握：破坏了哪一种集团以后会引起怎样的结果（一）酶的一级
9、结构改变对其催化功能的影响1主链断裂切除非贡献残基几乎不影响酶活（但不能过长）切除接触残基、辅助残基和结构残基酶活性丧失酶原激活 显示出催化活性；实质：活性中心的形成和暴露。2二硫键断裂影响空间构象 酶活性丧失不影响空间构象不影响酶活性（二）酶的二、三级结构改变对其催化功能的影响酶活丧失（三）酶的四级结构破坏对其催化功能的影响第五节酶的作用机制一 酶和底物结合的作用力注意：它们都是非共价结合离子键：底物上的一个带电荷的基团与酶分子的另一种带相反电荷基团的作用。本质： 静电吸引力。氢 键：底物与酶蛋白的两个电负性较大的原子，如N, O 共同享有氢原子而形成的结合力。范德华力：底物与酶蛋白的两个原
10、子在相距0.3-0.4 nm 时存在的一种非专一性的吸引力，弱，专一性小。当酶与底物处于立体互补时，大量的范德华键的形成就导致了酶的专一性的出现。二 酶催化反应降低活化能的来源1 酶分子中的催化功能基团（特定的氨基酸残基侧链、金属离子和辅酶）与底物形成瞬时的共价键， 并激活底物参与化学反应，甚至有时底物分子上的某些基团还可以暂时性的转移到酶分子的功能基上。这些可以提供另外的低能途径来降低反应的活化能。（次要）2 酶促反应降低的活化能主要来源于酶与底物间的非共价相互作用（结合能）。ES复合物中每一个弱的相互作用的形成，都伴随有少量的能量释放。由于这部分结合能的释放，部分的抵消了非酶反应时所需要吸
11、收的能量，因此反应的活化能水平大大降低。而这种弱的相互作用在酶催化反应的过渡态时更为有效。三一个所谓进化完全的酶必须具备与基态底物弱结合而与过渡态底物强结合的性质。四能障1 概念： （大概理解一下，这个不准确）S与 P之间还存在有能障（energy barrier)，这个能障用于反应过程中基团的重新排列、不稳定的瞬时电荷的形成、化学键的重排，以及其它反应所要求的转变步骤等2 能障的意义： 如果没有能障， 细胞内复杂的大分子将会自发地回复到其较为简单的分子形式，细胞所具有的高度复杂有序的结构以及代谢过程都将不复存在。酶分子正是通过长期进化而来的用于选择性降低细胞生存所必须反应的活化能的。五趋近与
12、定向效应（概）：由于酶分子具有活性中心，活性中心上的基团可以与底物相互接近，并使底物集团与酶活性中心的催化集团按照正确的方位精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思几何定向，有利于种间产物的形成和催化反应的进行。六构象变化效应（概）：当酶分子与底物分子互相接近时，由于两者的相互作用，酶分子和底物分子都会发生构象变化，从而更有利于酶与底物的结合和反应，使反应速度大大提高。七多元催化（概） ：由于酶和底物的结合，在酶促催化过程中通常可以几个基元反应配合在一起共同作用，从而使酶反应加速。八
13、酸碱催化1 概念：酶和底物分子之间通过质子(H+)传递作用，即酸和碱的相互转变，从而有利于过渡态的形成和稳定，使得反应所需的活化能降低，使反应加速进行2 影响因素：a. 酸碱强度b. 供出或接受质子的速度为什么组氨酸含量少，但却很重要， 主要从上面两个角度进行探讨，它在这两个方面有什么优势九共价催化概念： 在酶的催化作用中，底物和酶形成一个反应活性很高的共价中间产物，这可以通过提供另外的低能途径而降低反应所需的活化能，使反应加速进行。分类以下两种催化，到底是酶上还是底物上有亲电集团酶底物亲核催化亲核基团（富电子）攻亲电基团（缺电子）亲电催化亲电基团（缺电子）击亲核基团（富电子）十微环境效应（概
14、） ：酶的活性中心上的催化基团处于一种特殊的疏水反应环境，使得酶的催化基团被低介电环境所包围，并可以排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，从而加速酶反应。这种作用称为微环境效应。十一 .酶活性部位的柔性（我国科学家邹承鲁先生首次提出）1 概念：天然状态的酶具有完整的三维空间结构，其中活性部位跟其它结构部位相比，具有较大的柔性，也就是说酶活性部位基团的运动性较大。因此，当低浓度的变性剂作用时，酶分子整体刚性部分构象保持完整，而较柔性的活性部位的局部结构已发生明显变化，如活性基团的相互靠近和立体取向受到破坏，导致酶活性的丧失。2 意义：酶活性部位的柔性是酶
15、充分表现其活性所必需的满足底物结合诱导的构象调整（诱导契合），使得活性部位的活性基团形成一定的空间取向，以保持一个适应催化反应的空间微环境；残基侧链活性基团的运动更加有利于催化的高效性；很多酶的催化效率和底物专一性受到其它因素的调节，这就要求酶的活性部位保持一定的柔性，使其局部环境受到调节因素的影响后能发生细微的构象变化，从而调节酶的活性和底物专一性。3 柔性与刚性之间的辩证关系酶的柔性和刚性是局部的，也是相对的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思对于局部柔性部位的维持必须要有刚
16、性部分来支撑；酶分子既要保持相对稳定的整体结构，又必须要有相对柔性的微环境状态。正是这种刚柔相济的独特酶分子结构，构成了酶的催化作用高效性和可调节性的结构基础。十二 .辅因子在酶促反应中的作用之金属离子不会出问答题，但5 个作用一定要理解使酶稳定于催化活性构象；金属离子本身可得到电子或失去电子而发生价态的变化，因而可以作为亲核剂或亲电剂；金属离子还可以通过接受或供出电子，激活亲电剂或亲核剂；金属离子带正电荷，因此可以掩蔽亲核剂，以防止不需要的副反应发生；通过配位键，将酶和底物结合在一起，使底物趋近酶分子，并促使酶的活性中心与底物之间的反应基团具有正确的空间定向。第六节酶催化反应动力学一根据中间
17、产物学说推导米氏方程根据中间产物学说，单底物单产物酶促反应可以表示为：由于 E+S ES的速度极小，尤其是在反应处于初始阶段时，故k-2 可忽略不计。因而酶催化反应方程可以简化为；根据稳态学说，有：即：由于 E0=E+ES，因此上式可以表示为：KmESSESE)(0则： KmES=E0S-ESS 因此0SKmSEES由于 v0=k2ES，vmaxk2E0，所以max020SKmSvSKmSEkvPEESSEkkkk2211PEESSEKKK2110ESkk-ESkdtd21-1）（ESESkESkESk21-1mkkk121-KESSE精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳
18、总结 - - - - - - -第 6 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思一般反应体系中，底物浓度远大于酶的浓度，故酶底物络合物ES的形成对底物浓度而言可以忽略不计，故可以用S0代替 S，于是上式可以写为：00max0SKmSvv二米氏方程的讨论1 Km的意义：达到1/2 最大反应速率时的底物浓度2 Km是酶的特征常数，它可以表示酶同底物的亲和力Km大，亲和力小；Km小，亲和力大3 Km是酶的特征常数，它是针对特定的反应与特定的反应条件而言的。不同的酶，具不同的 Km值；同一种酶作用于不同的底物，具有不同的Km值；同一种酶，催化同一种底物反应，但反应条件不同，也具有不同的K
19、m值。一般而言，Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。4 判断酶的最适底物：Km最小，也叫天然底物5计算一定速度下的底物浓度或一定底物浓度下的反应速度。（即记熟米氏方程）6了解酶的底物浓度在体内具有的浓度水平：（即在 Km值附近）一般说来， 作为酶的最适底物，其在体内的浓度水平应接近于它的Km值。如S体内Km，则 vKm， vvmax,这种底物浓度就失去其生理意义，也不符合实际情况。7 区分 Km与 Km/ 不能简单的把Km看作没有抑制剂时的米氏常数，而把Km/看作有抑制剂时的米氏常数8 Kcat/Km可用于a.比较不同的酶或同一种酶催化不同底物反应的催化效率， Kcat/Km值越大，酶的催
20、化效率越高。b.检验反应是否达到稳态或平衡态快速反应研究证明酶和底物结合的速度常数为109 s-1 mol-1 L 数量级，如果Kcat/Km为同样的数量级就可以假定为稳态。9 米氏方程中Km及 vmax的求法双倒数方程要注意底物浓度的选择，不能过大也不能过小，要在 Km附近， 为什么要在Km附近？结合米氏方程来讨论三 抑制作用1 概念：酶蛋白分子上的必需基团受化学物质的影响而发生化学性质的变化，并由此引起酶活力的降低或丧失。这种现象称为抑制作用。能引起抑制作用的物质称为酶的抑制剂，包括药物、毒物、抗生素、抗代谢物，以及大分子蛋白质，小分子化合物（CO, N3-,CN-等非金属离子，重金属离子
21、）。2 如何用动力学方法区别可逆与不可逆抑制具体解释见讲义P21 一定量的抑制剂与酶混合，预保温一定时间后，取不同量的混合液测定其在固定体积的反应体系中的初速度。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（一）1， 无抑制剂；2， 有不可逆抑制剂；3， 3，有可逆抑制剂。固定反应体系的体积，先在其中加入一定量的抑制剂，再加入不同浓度的酶，测定酶活。可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（二）1， 无抑制剂；2， 有不可逆抑制剂；3， 3，有可逆抑制剂。3 不可逆抑
22、制剂以下两种 Ks型和 Kcat 型它们的特点， 为什么叫做Ks型？它指的是酶分子和抑制剂还是有一种亲和性；而Kcat 型，就是结合上去之后，有一个催化反应，把它的潜伏反应集团活化。Ks 型不可逆抑制剂结构特征：a.具有和底物相类似的结构，可以与相应的酶的底物结合部位结合；b.带有一活泼的化学基团，可以和酶分子中的必需基团起反应，对之进行化学修饰，从而抑制酶的活性。作用特点：a.抑制作用是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，故又称亲和标记试剂。b.该种试剂一般只对底物结构和其相似的酶有抑制作用，故有一定的专一性。c.该种试剂的专一性有一定的限度，因其活泼基团还可以修饰酶分子其它部位的同一类基团
23、。 其选择性取决于抑制剂与活性中心必需基团形成非共价络合物的解离常数以及非活性中心同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即 Ks的比值。 如果相差 3 个 数量级以上，就可以忽略副反应。应用：研究酶活性中心的结构。在抑制剂上引入某种具有特殊光学性质的基团，而这些基团又可以随着酶分子局部微环境的不同而改变，这种基团就可以作为“ 报告 ” 基团报告活性部位微环境的性质。Kcat 型不可逆抑制剂结构特征：具有一潜伏反应基团。作用特点：a.当酶对抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被反应而活化，与活性中心发生共价结合，并使得结合物停留在这种状态，不能再分解生成产物，酶因而致“死”。b.抑制作用的效率
24、及专一性不但与Ks有关， 更重要的是取决于Kcat。Kcat愈大， Is 生成的速度愈快，抑制作用也愈强。应用：医药及生物防治。将酶作为靶子，通过设计特定的化合物抑制其活性或使其失活。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思4 可逆抑制每种可逆抑制作用的特点。竞争性抑制：不会有三元络合物形成；非竞争性抑制： 有三元复合物形成；反竞争性抑制：抑制剂只可能与结合有底物的酶分子进行结合各种抑制的例子。竞争性抑制：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制；非竞争性抑制：金属离子与巯基结合以后，再来改变活性
25、中心的构象5 混合型抑制它是一个一般的情况，之前三种都是特殊情况。四 双底物双产物反应动力学分类掌握下面三个机制的特点，到底有没有三元络合物的形成，乒乓机制没有， 前面两个有；序列有序和序列随机到底是怎样的方式反应通式： E+A+B E+P+Q（1）反应过程中形成三元络合物E+A+B EAB EPQ E+P+Qa序列有序机制：两种底物按一定的顺序与酶结合，只有当第一个底物与酶结合后，第二个底物才结合上去，产物P和 Q 的释放也按照一定顺序进行，也即：b序列随机机制：两种底物不按一定的顺序与酶结合，产物也为随机释放，也即：（2）反应过程中不形成三元络合物乒乓机制酶首先与一个底物结合，释放一个产物
26、，而后再与另一个底物结合，再释放出产物，即底物和产物交替地与酶结合或从酶释放，反应过程中无三元络合物形成。第七节别构酶及其反应动力学一别构酶（概） ：由多个亚基组成的，分子中除结合底物并催化底物转化的活性部位外，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思还有结合别构效应物（别构配体）的部位。这两个部位位于不同亚基上，也可能位于同一亚基的不同部位。别构配体与酶结合后，可改变酶分子亚基间的结合状态（疏松或紧密），从而影响酶对底物的结合及酶的催化能力（正或负） 。二别构酶的结构特点之一：有时
27、因物理或者化学的变化（如加热、冷冻、尿素等处理），酶会失去对效应物的敏感性，但是催化活性并未失去。这种脱敏的酶表现出正常的双曲线动力学特征。脱敏感酶： 别构酶由于构象的改变，对于效应物不在敏感，但本身的催化活性并未失去，正常的双曲线特征是完整的保留着的三别构效应类型的判断1协同指数： Rs反应速度分别达到最大反应速度90%和 10%的时候所对应的底物浓度的比例。 Rs81为负协同效应；Rs 12 15 营养要求简单简单复杂光照要求不要求大多数要求光照不要求对剪切力大多数不敏感敏感敏感主要产物醇类， 有机酸， 氨基酸，抗生素，酶，核苷酸色素，香精，药物，酶激素，疫苗，但克隆抗体，酶动植物细胞与微
28、生物细胞相比较而言最重要的两个特点：动物和植物细胞的体积比微生物细胞至少大1000 倍，而且动物细胞没有细胞壁，因此对于搅拌等剪切力特别敏感，很容易由于搅拌的原因造成细胞破裂植物细胞和动物细胞本身的代谢速率和生长速率都要比微生物细胞低，这就使得它们的倍增时间比较长，这也就使得它们的发酵周期比微生物细胞长很多第六节酶制剂的工业制备法七发酵液的预处理的目的（四点都记）：1改变悬浮液中固体离子的物理特性，如提高硬度，加大颗粒尺寸，改变其表面类型等；2使某些可溶的胶粘物质变成不可溶；3改变液体的某些物理性质，如降低粘度和密度。总之，预处理的目的是使发酵液中的酶易于通过分离和过滤与发酵液中的其它成分分开
29、。方法：一般是加絮凝剂或凝固剂。如，聚丙烯酰胺，聚谷氨酸，右旋糖酐，一些廉价的无机盐等。4产胞内酶的细胞还需对细胞进行处理，以使胞内内酶最大限度地释放。方法：细胞自溶，增加壁膜透性或使细胞破碎。也可使用专用设备，如超声波振荡器、高压喷挤设备、匀浆装置及振动球磨。共同的是前面的三点，主要是使发酵液中的酶与周围粘稠的液相相分开，便于分离纯化，而且产胞内酶的还必须经过细胞的破碎的过程，使胞内酶最大限度的释放第四章酶的分离工程第一节酶分离纯化的一般原则精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精
30、思一评价分离提纯方法的指标总活力的回收率，反映了提纯过程酶活力的损失情况；比活力提高的倍数，反映了纯化方法的效率。这两个指标分别反映了什么情况，且要记住这两者不可兼得。第二节细胞的破碎及酶的提取一酶液的提取1典型的提取液的组成提取液 =离子强度调节剂+ pH 缓冲剂+ 温度效应剂+ 蛋白酶抑制剂+ 抗氧化剂+ 重金属络合剂+ 增溶剂要全部记住比较困难，所以不会出问答题，但要记住每一种试剂的作用，即要明白为什么要使用这些试剂。如，抗氧化剂：防止酶的氧化失活，为什么酶在分离纯化过程中易氧化失活？最主要是因为体内天然抗氧化剂的减少，且分离过程中多与氧接触。简单看一下各种试剂的例子，及它们的作用增溶剂
31、中的三种类型它们本身的分子特点，离子型的有一个带电荷的头部，非离子型它亲水性的头部不带有电荷；两性， 它带有电荷同时带有正负离子。以及这三种在蛋白质研究过程中的作用是什么，离子型常常可以使得蛋白质高度变性，非离子型特别适合于分离功能性的复合物，。2提取液各组分的作用：（1）离子强度调节剂与缓冲剂：作用：使酶尽可能的处于体内环境的离子强度和pH 值条件。试剂： 0.10.2 M 的 NaCl或 KCl ；PBS(phosphate buffer saline) 或 TBS(Tris buffer saline) （2）温度效应剂：作用：防止过冷、过热引起的酶分子变性失活。试剂：甘油，二甲亚砜(D
32、MSO) （3）蛋白酶抑制剂：作用：抑制细胞破碎释放出来的内源蛋白酶试剂：苯甲基磺酰氟(PMSF) ，各种蛋白酶抑制剂（4）抗氧化剂：作用：防止酶被氧化而失去活性。在酶的提取过程中，酶容易氧化变性失活是由于氧的接触以及体内原有抗氧化成分的稀释而减少。试剂： -巯基乙醇 (ME)，二硫苏糖醇(DTT) （5）重金属螯合剂：作用：避免金属离子引起的酶蛋白变性失活，但应注意螯合剂同时也能使金属蛋白酶失活。试剂： EDTA( 对大多数金属离子有非特异性的亲和力)， EGTA( 对 Ca2+有很强的亲和性) （6）增溶剂（去垢剂） ：使膜蛋白溶解。结构：由疏水性尾部和亲水性头部组成；特性： 形成亲水性头
33、部向外的分子团结构，溶解的膜蛋白与去垢剂分子结合成团，膜蛋白的疏水区或穿膜区被去垢剂分子所覆盖，使其能与水性缓冲液相溶。分类：a.离子型去垢剂：又分为阳离子去垢剂（带阳离子电荷）和阴离子去垢剂（带阴离子电荷）。常用的有SDS和 LDS （阴离子去垢剂） ， 胆酸钠和脱氧胆酸钠 （阴离子去垢剂） ；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 18 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思特点：能使蛋白质高度变性， 但使用这种类型的去垢剂可使蛋白以单体的形式分离，对于测定蛋白的分子量较为方便。b.非离子型去垢剂：带有非极性的亲水头部。
34、常用的有Triton, Tween, NP-40 和 OG等；特点：对蛋白与蛋白间的相互作用干扰较弱，对于分离功能性的蛋白复合物较为有利。与离子型去垢剂相比对蛋白的变性作用较弱，然而在这种去垢剂中蛋白易发生聚集。c.两性去垢剂：带有正、负离子的头部。CHAPS 特点：与非离子型去垢剂相比可以减少蛋白与蛋白之间的相互作用，与离子型去垢剂相比可以减少对蛋白的变性作用。3 酶提取过程的注意事项温度为防止酶的变性失活，提取时的温度不宜过高。特别是采用有机溶剂提取时，温度应控制在 0-10。但对某些温度耐受性较高的酶，则可以在37或更高一些温度下提取。提取时并不是温度越低越好，我们之所以要采取低温提取，
35、主要是为了防止酶分子的变性失活， 如果酶分子本身的稳定性比较好，这个时候可以在高温下提取，因为在高温下扩散速率比较快、溶液粘度比较低、溶解度比较大。第三节酶的纯化一调节溶解度最常用方法：1 盐析：常用盐(NH4)2SO42 有机溶剂沉淀：常用有机溶剂乙醇二凝胶过滤1 原理：凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢， 而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快， 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中
36、的物质就按不同分子量筛分开了。2 是大分子的先洗下来，小分子的后洗下来三离子交换层析1概念：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。2离子交换剂：标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。阴离子交换树脂侧链电荷为正，阳离子交换树脂侧链电荷为负。3原理：利用不同蛋白质和酶分子表面电荷性质的不同而达到分离、纯化蛋白的目的。进行离子交换层析的最佳溶液pH 值一般与蛋白质或酶的等电点相差一个单位。原因：确保蛋白质或酶能与离子交换剂结合，即结合可以比较牢固；洗脱时，由于所带电荷不多，所以不需要很苛刻的条件就能使之解离下来，即不需要在后续的洗脱中
37、采取高盐或高pH 等可能导致蛋白变性的因素。四等电聚焦1原理：每一种蛋白质都有其特定的等电点(pI)，如果电场中某一处的pH 值等于某一蛋白质的等电点，此时该蛋白质所带电荷为零，不再移动。分离时蛋白质是按照等电点排列的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 19 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思五层析聚焦原理比较复杂，但最后蛋白质也是按等电点排列的六亲和层析1概念：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使蛋白质或酶等生物分子分离纯化的技术。2.原理：过层析柱时，目标分离物与柱上配体结合，其余的被洗下来，之
38、后在把结合的东西洗下来。3 类型：不要求记住每种的含义，但举例后要能判断类型（1）共价亲合层析： 利用亲和层析介质与被分离物质间形成可逆共价键的方式来进行分离。例子：分离含巯基的化合物（2）疏水层析：利用被分离物质中的疏水集团与亲和层析介质上的疏水集团进行可逆性疏水结合反应的分离方法例子：酶蛋白分子中含有疏水性较强的氨基酸残基（如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸）与亲和层析介质上改性琼脂糖的烷基发生疏水结合反应（3）金属离子亲和层析：酶蛋白分子中的一些氨基酸残基与亲和层析介质上的金属离子进行可逆螯合反应的亲和层析方法例子：组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基可与金属离子（如铜锌镍钴）等亲和结
39、合（4）免疫亲和层析：抗原与抗体之间发生专一而又可逆的亲和反应的一种分离方法亲和配体：抗原或抗体、蛋白A 或蛋白 G （5）染料配体亲和层析：利用酶分子与一些染料上的基团进行可逆的亲和反应的分离方法例子：一些有机染料，如蒽醌化合物、偶氮化合物等具有类似于NAD+的结构。一些需要核苷酸类物质，如NAD(P)+、ATP为辅酶的酶，对这些染料有一定的亲和力，可用于这些酶的纯化（6）凝集素亲和层析：利用酶蛋白与凝集素之间进行可逆亲和反应的一种分离方法例子：凝集素能与糖的残基专一而又可逆的结合，可以用于各种糖蛋白的分离纯化七超临界萃取：1）概念：又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中
40、的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。八酶结晶方法的共同特点：使酶液中酶的溶解度慢慢降低，使之处于稍为过饱和状态，而使酶慢慢析出结晶。第四节酶纯度的检验一聚丙烯酰胺凝胶电泳有四种试剂，它们的作用：丙烯酰胺单体甲叉双丙烯酰胺交联剂TEMED加速剂过硫酸铵（简称AP）催化剂二 SDS-PAGE 测定亚基分子量的原理原理：在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 20 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，所带的负电
41、荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS 胶束在水溶液中的形状象一个长的椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的，约为14 埃。但长轴的长度则与亚基分子量的大小乘正比。因此这种胶束在SDS-PAGE 凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。三电泳：必须在多种pH 条件下进行，在单一pH 值下，两种酶可能一起移动。即在单一PH条件下电泳得到一条带不能证明是纯的，只有在多种PH 条件下都只得到一条带才能证明是纯的。第五节浓缩与干燥第五章酶与细胞固定化第一节酶的
42、固定化一固定化酶的定义指固定在一定的载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用二酶的固定化方法固定化方法分类固定化方法分类非共价结合法结晶法分散法物理吸附法离子键结合法化学结合法共价结合法交联法包埋法微囊法网格法其中，结晶法对于固定活力较低的酶非常有用，但在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低；而交联法是活力损失最大的；共价结合法的活力损失也比较大，但没有交联法严重三固定化酶的性质1 最适 pH 值记住花括号里面的每一种变化过程影响因素a.载体性质对最适pH 的影响：原因：载体对反应液中H+或 O
43、H-的选择性吸引作用。b.产物性质对最适pH 的影响：原因：固定化载体成为扩散障碍，致使固定化酶所处催化区域的pH值发生改变，故周围反应液的pH 值也应发生变化，才能达到酶所要求的pH 值。2 米氏常数：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 21 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思记以上两种载体到底使Km 值怎么变第二节辅酶的固定化一辅酶和辅基的区分第三节细胞的固定化一固定化增殖细胞（概）：将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长繁殖能力的一种固定化方法。特点： 细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也可
44、以不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定。因此，更适宜于连续使用。第四节原生质体的固定化在固定化原生质体的过程中要先制备原生质体，原生质体的制备只能采用酶解的方法去掉细胞壁第六章酶的分子工程第一节概述一酶的分子工程（概）：主要指用化学或分子生物学方法对酶分子进行改造。使其增加稳定性或减低抗原性等。第二节酶分子的化学修饰一酶的化学修饰（概）：在分子水平上对酶进行改造，即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶的酶学性质的技术。二酶化学修饰的目的（应该会出大题，讲义p81-82）为什么要对酶进行化学修饰？或者通过对酶分子进行化学修
45、饰，我们主要是要在酶的理论与应用研究中解决哪些问题？三酶蛋白功能基的超反应性（概）：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂所发生的非常迅速的反应称为酶蛋白功能基的超反应性。酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。四亲和标记试剂（概）：与酶分子的某一特殊部位（通常是酶的活性部位）有亲和力，可以与这个特殊部位结合并对酶分子进行修饰的试剂。第三节酶分子修饰一酶分子修饰（概） ：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。酶分子的化学修饰仅仅只是涉及到酶分子侧链基团的改变，而酶分子修饰的含义更广，包括了精选学习资料 - - -
46、 - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 22 页，共 23 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思酶分子侧链和主链化学结构的改变，还包括对其空间结构的改变。一定不要和酶分子化学修饰混淆。酶分子化学修饰主要是针对它的侧链集团；而酶分子修饰的含义更加广泛。二酶分子的主链修饰之切断修饰会产生以下三种结果，掌握它们在实际中有什么应用1酶的活性中心受到破坏，酶丧失其催化功能。用于探测酶的活性中心的位置。2 酶的活性中心仍然可以维持，酶的催化功能可保持不变或者损失不多，但酶的抗原特性将发生改变。用于提高某些酶特别是药用酶的使用价值。3 使酶的活性中心形成或暴露，则酶分子可以
47、显示出催化功能或者酶活力提高。如酶原激活。三酶分子的物理修饰（概）：通过各种方法，使酶分子的空间构象发生某些变化（但不涉及酶分子一级结构的改变），从而使酶的某些特性和功能发生改变的方法称为酶分子的物理修饰。第四节酶的人工模拟一模拟酶（概） ：模拟酶又称人工酶或酶模型，它是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。它是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘学科。二超分子化学（概） ：研究两种以上的化学分子通过分子间力相互作用缔结成为具有特定结构和功能的超分子体系的科学。简言之： 超分子化学是研究多个分子通过非共价键作用而形成的功能体系科学。超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用。当接受体与络合离子或分子结合成具有稳定结构和性质的尸体，即形成 “超分子” ，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。三杂合酶（概） ：把来自不同酶分子中的结构单元或是整个分子进行组合和交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 23 页，共 23 页
