酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究

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1、分类号分类号 密级密级 UDC 编号编号 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 硕士学位论文硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 周周 玲玲 玲玲 指导教师指导教师 赵赵 海海 研究员研究员 中国科学院成都生物研究所中国科学院成都生物研究所 申请学位级别申请学位级别 理学硕士理学硕士 学科专业名称学科专业名称 环境科学环境科学 论文提交日期论文提交日期 2008 年年 5 月月 论文答辩日期论文答辩日期 2008 年年 5 月月 培养单位培养单位 中国科学院成都生物研究所中国科学院成都生物研究所 学位授予单位学位授予单位 中国科

2、学院研究生院中国科学院研究生院 答辩委员会主席答辩委员会主席 ETHANOL FERMENTATION FROM CASSAVA BY Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis A DISSERTATION SUBMITTED TO GRADUATE UNIVERSITY OF THE CHINESE ACADEMY OF SCIENCES IN CANDIDATE FOR MASTER DEGREE OF SCIENCE CANDIDATE: ZHOU LING LING ADVISOR: Prof. ZHAO HAI CENTER FOR

3、 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY CHENGDU INSTITUTE OF BIOLOGY THE CHINESE ACADEMY OF SCIENCES May，2008 II中文摘要 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 周玲玲(环境科学) 指导老师：赵 海 研究员 (中国科学院成都生物研究所，成都，610041) 摘 要：本文结合我国燃料乙醇发展的方针政策，以酿酒酵母和运动发酵单胞菌为菌种研究其在非粮能源作物木薯中乙醇发酵的情况， 为木薯原料更好地应用于生产中提供了理论依据。 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵的研究。实验采用的木薯干淀粉含量

4、约 70-75%。以酿酒酵母为菌种进行高浓度乙醇发酵的工艺条件研究，最佳条件为：木薯干粉碎细度为 35 目，料水比 1：2，-淀粉酶用量 0.09 KNU/g 淀粉，蒸煮温度 85 ，蒸煮时间 15 min。采用 30 同步糖化发酵工艺，糖化酶用量为 3.4 AGU/g 淀粉，发酵时间30 h。在 10 L 发酵罐中，乙醇质量比达 127.88 g/kg，发酵效率为 88.28%，发酵强度4.263 g/kg/h，100 L 中试研究中乙醇浓度为 127.75 g/kg，发酵强度 4.258 g/kg/h。利用高效液相色谱对发酵液中残糖进行了分析，证明葡萄糖、果糖等单糖已完全被菌体利用，剩余糖

5、为二糖，三糖等不可发酵的低聚糖。 运动发酵单胞菌快速乙醇发酵的研究。 对实验室保藏的 8 株运动发酵单胞菌进行比较，选择发酵速度最快的 Zymomonas mobilis232B 进行研究。该菌在纯葡萄糖中的最佳发酵条件为：葡萄糖浓度 18%，起始 pH 6-7，发酵温度 30 ，发酵时间 18 h，乙醇浓度 88 g/kg。在以木薯为底物同步糖化快速乙醇发酵中，采用 Full Factorial 设计和最速上升实验确定了培养基成分中的 2 个显著性因子及其最适浓度：酵母粉 4 g/kg，硫酸铵 0.8 g/kg。在最适培养基条件下，对木薯料水比和糖化酶用量进行了优化，得到 Z.mobilis

6、232B 木薯乙醇发酵最佳料水比 1：3，糖化酶浓度 4 AGU/g 淀粉，乙醇发酵 4.915 g/kg/h。利用高效液相色谱对发酵液中残糖进行了分析，剩余糖为二糖，三糖等，但成分较酵母发酵后复杂。 关键词：关键词：乙醇发酵；木薯；酿酒酵母；运动发酵单胞 I硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 II英文摘要 Ethanol Fermentation from Cassava by Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis Zhou Lingling (Environmental Science) Directed by

7、 Prof. Zhao Hai (Chengdu Institute of Biology, CAS, Chengdu, 610041) Abstract: According to the fuel ethanol development plans and policies in our country, the ethanol production from cassava by Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis was studied. It provided theoretical basis for ethanol fer

8、mentation by cassava in industry. Part 1 is the study of VHG (very high gravity) ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae. The content of starch in cassava was 70-75%. Compared with the performances under different experimental conditions, the following optimal conditions for VHG fermentatio

9、n were obtained: Granule size of dry cassava 35 mashes, hydromodulus of cassava to water at 1:2, -amylase enzyme dosage 0.09 KNU/g starch, cooking temperature 85 for 15 min, using the SSF process (simultaneous saccharification and fermentation) and the amount of glucoamylase 3.4 AGU/g starch. Accord

10、ingly, the final ethanol concentration was up to 127.88 g/kg; the ethanol yield reached 88.28%, and ethanol productivity was 4.263 g/kg/h after 30 h. When the fermentation scale expanded to 100 L, the final ethanol concentration was 127.75 g/kg, and the ethanol productivity was 4.258 g/kg/h in 30 h.

11、 The residual sugar was analyzed by high performance liquid chromatography, and proved that there was no glucose and fructose. The residual reducing sugar was some unfermentable oligosaccharide Part 2 is the study of the rapid ethanol production by Zymomonas mobilis. Compare with other seven stains,

12、 Zymomonas mobilis 232B was selected for research. The optimum condition in glucose medium was as follow: glucose concentration 18%, initial pH 6-7, and fermentation temperature 30 . The ethanol concentration was 88g/kg in 18 h. After that, rapid ethanol production from cassava in SSF by Zymomonas m

13、obilis 232B was studied. Through a series of experiments aided by Full Factorial Design and steepest ascent search, the optimal concentration yeast extract and ammonium sulfate were determined: 4 g/kg and 0.8 g/kg, each. Under optimum medium conditions, the optimal hydromodulus of cassava to water a

14、nd glucoamylase dosages were obtained: hydromodulus of cassava to water at 1:3 and glucoamylase dosages 4 AGU/g starch. The ethanol production reached 4.915 g/kg/h. The residual sugar was analyzed by HPLC, and proved that the residual reducing III硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 sugar was some unfermen

15、table oligosaccharide，but the components were more complex than that fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Keywords: ethanol fermentation; cassava; Saccharomyces cerevisiae; Zymomonas mobilis IV目 录 目 录 第一章 研究背景与研究内容 . 1 1.1 木薯的基本特性 . 1 1.2 木薯乙醇发酵的意义 . 2 1.3 研究内容 . 2 1.4 实验设计流程图 . 3 参考文献 . 4 第二章

16、酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 . 5 2.1 引言 . 5 2.2 材料与方法 . 5 2.2.1 菌种.5 2.2.2 培养基成分.5 2.2.3 主要试剂与仪器.6 2.2.4 培养方法.6 2.2.5 分析方法.7 2.2.5.1 菌体OD值的测定.7 2.2.5.2 还原糖浓度的测定.7 2.2.5.3 总糖浓度的测定.7 2.2.5.4 残糖成分分析方法.7 2.2.5.5 乙醇浓度的测定 .7 2.2.5.6 pH值的测定.8 2.2.5.7 粘度的测定.8 2.2.6 计算公式.8 2.3 实验结果与分析 . 8 2.3.1 DNS法测定还原糖标准曲线.8 2.3.2 气相色谱

17、法测定乙醇浓度的标准曲线 .9 2.3.3 发酵方式的选择.10 2.3.4 培养基成分的筛选 .11 2.3.5 木薯不同颗粒大小对乙醇发酵的影响.12 2.3.6 水热处理方式对发酵的影响 .13 i硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 2.3.7 液化酶浓度及加入方式对乙醇发酵的影响 .14 2.3.8 糖化酶浓度对乙醇发酵的影响 .15 2.3.9 料水比对发酵的影响 .16 2.3.10 10 L发酵罐实验.18 2.3.11 100L中试实验.18 2.3.12 残糖成分的分析.20 2.4 讨论 . 20 2.4.1 糖浓度对高浓度乙醇发酵的影响.21 2.

18、4.2 乙醇浓度对高浓度乙醇发酵的影响.21 2.4.3 氮源对高浓度乙醇发酵的影响.22 2.4.4 溶解氧对高浓度乙醇发酵的影响.22 小 结 . 23 参考文献 . 24 第三章 运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发酵特征研究 . 27 3.1 引言 . 27 3.2 材料和方法 . 27 3.2.1 菌种.27 3.2.2 培养基成分.27 3.2.3 菌种培养方法 .27 3.2.4 分析方法.28 3.2.4.1 菌体OD值的测定.28 3.2.4.2 酶谱试纸条鉴定胞外酶类.28 3.2.4.3 还原糖、乙醇浓度等的测定方法.28 3.3 结果与分析 . 28 3.3.1 不同菌株

19、乙醇发酵的比较 .28 3.3.2 菌体不同状态酶谱.29 3.3.3 种子培养时间的确定 .29 3.3.4 不同糖浓度对发酵的影响.30 3.3.5 温度对发酵的影响.31 3.3.6 pH值对发酵的影响.31 ii 目 录 3.3.7 缓冲液的筛选 .32 3.3.8 缓冲液浓度的筛选 .32 3.3.9 10 L发酵罐实验.33 3.4 讨论 . 33 3.4.1 菌体状态对发酵的影响.33 3.4.2 葡萄糖浓度对Z.mobilis发酵的影响.34 3.4.3 Z.mobilis乙醇耐受性机理.34 第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 . 35 4.1 引言 . 35 4.

20、2 材料与方法 . 35 4.2.1 菌种.35 4.2.2 材料和分析方法 .35 4.3 结果与讨论 . 35 4.3.1 培养基成分的选择.35 4.3.2 培养基主要成分浓度的选择.37 4.3.3 料水比对Z.mobilis木薯乙醇发酵的影响 .38 4.3.4 糖化酶浓度对Z.mobilis木薯乙醇发酵的影响.39 4.3.5 培养基不灭菌对Z.mobilis232B快速乙醇发酵的影响.40 4.3.6 发酵液残糖成分的分析.41 4.4 讨论 . 42 4.4.1 营养物质的限制.42 4.4.2 快速乙醇发酵.42 4.4.3 残糖成分分析.43 小结 . 44 参考文献 .

21、45 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 . 47 5.1 前言 . 47 5.2 发展燃料乙醇的意义 . 47 5.3 国内外燃料乙醇发展概况 . 48 5.3.1 巴西燃料乙醇的发展.48 iii硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 5.3.2 美国燃料乙醇的发展 .49 5.3.3 欧盟燃料乙醇的发展.49 5.3.4 我国燃料乙醇的发展.49 5.4 乙醇发酵概论 . 50 5.4.1 乙醇发酵的机制 .50 5.4.2 乙醇发酵过程 .52 5.5 乙醇发酵工艺进展 . 53 5.5.1 原料的预处理.53 5.5.2 原料的水热处理.54 5.5.3 糖化.5

22、5 5.5.4 乙醇发酵 .55 5.6 燃料乙醇发展中存在的问题及对策 . 57 参考文献 . 59 附 录 . 63 发表文章 . 64 致 谢 . 65 iv 第一章 研究背景与研究内容 第一章第一章 研究背景与研究内容研究背景与研究内容 自十九世纪七十年代世界范围内发生第二次石油危机以来， 很多国家都通过立法积极推广燃料乙醇的应用，美国的“汽油醇计划”和巴西“乙醇汽油计划”走在了行业前列1。之后，法、加、西、英、荷、德、泰、印等国家都相继推行了类似计划。随着燃料乙醇的推广和大规模应用，乙醇的产量迅速增加，从 1975 年至 1995 年，世界乙醇产量净增近两倍。乙醇工业生产的方法主要有

23、发酵法和化学合成法两大类2。世界乙醇的 93%由发酵法生产，以甜菜和甘蔗为原料的占 60%，以玉米等谷物为原料的占 33%，目前燃料乙醇已占世界乙醇总产量的 66%3。我国年产乙醇 300 万吨以上，是世界第三大乙醇生产国，仅次于巴西、美国。95%的乙醇为发酵法生产，其中约 80%为淀粉质原料发酵。 用淀粉质原料发酵生产乙醇多采用玉米乙醇生产工艺， 但是随着乙醇产业的不断发展，以玉米等粮食作物为主的生产模式日现弊端。针对这一国情， 可再生能源发展“十一五”规划明确指出大力发展以非粮生物质为原料的燃料乙醇生产4，提出“因地制宜，非粮为主”的原则，在高度重视粮食安全的前提下，实施不与粮争地，不与人

24、争粮的策略，走工艺技术柔性化、原料多元化的路线。木薯作为一种极具潜力的不与粮争地的生物能源作物，是我国发展乙醇产业的重要资源5。 1.1 木薯的基本特性木薯的基本特性 木薯(Cassava)，学名Manihot esculenta Crantz，又名树薯，树番薯，是大戟科木薯属植物。原产于南美洲，是热带和亚热带多年生、温带一年生灌木，适宜在年平均温度为 25-29 、年均降水量 1000-1500 mm的低纬度地区生长6。大约在 1820 年前，木薯传入中国南方，主要在广东、广西和海南种植，现在逐渐扩大到云南、福建、贵州等省，目前在我国的种植面积已经超过 700 万亩。 木薯植株生长高度为 2

25、3 m，地下结块(根)，根粗而长，呈柱形或纺锤形，每株4-6 个，其根系发达，不仅能覆盖较大的范围，而且能扎入到耕作层深处吸收水分和养分，所以在一般作物很难生长的条件下也能获得一定的产量，被称为“先锋作物”7。木薯粗生易栽，病虫害较少，是高产薯类作物，最高产量可达 80 t/hm2。此外其种植和收获时间灵活，可在一年中的任何时间种植，便于与其他作物间种。 按毒素(氢氰酸HCN)含量的多少及形态生理特征， 木薯分为两类： 苦味木薯(有毒木薯)和甜味木薯(无毒木薯)。苦味木薯含有较多的氢氰酸，食用易造成中毒，故多供 1硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 饲用或提取淀粉用。

26、甜味木薯， 生长期短， 但块根产量较低， 毒性物质氰酸含量较少，处理后可以食用8。 新鲜木薯块根的主要化学成分是水(约 70%)， 其次是碳水化合物，还有一些含量较少的蛋白质、 脂肪、 果胶。 鲜木薯淀粉含量达到 25-30%(木薯干为 70%左右)。木薯干碳水化合物含量高，表皮含有的氢氰酸在生产过程中易被蒸发掉，因此木薯干是乙醇生产的优质原料。 1.2 木薯乙醇发酵的意义木薯乙醇发酵的意义 木薯是一种极具潜力的不与粮争地的生物能源作物， 是我国发展燃料乙醇产业的重要资源。以木薯为原料生产燃料乙醇，不仅能够满足原料长期稳定经济的供应，且不影响我国的粮食安全，同时可减少环境污染，提高农民收入9。

27、 1、 木薯是非粮食能源作物，对土质的要求低，耐旱、耐瘠薄，符合“不争粮，不争(食)油， 不争糖， 充分利用边际性土地(指基本不适合种植粮、 棉、 油等作物的 土地)”的国家粮食发展战略，有利于保障国家粮食安全和能源安全10。 2、与其他原料相比，利用木薯乙醇发酵成本低。 不同原材料单位面积产乙醇量11 土 地 产 量 (吨/公顷年) 糖或淀粉含量(%) 乙 醇 产 量 (公升/吨原料) 土地乙醇产量 (吨/公顷年) 木薯 40 25 150 6000 甘蔗 70 12.5 70 4900 玉米 5 69 410 2050 小麦 4 66 390 1560 稻谷 5 75 450 2250 3

28、、亚热带、热带地区四季都可种植，有利于全年原料供应。 4、木薯具有粗生易种的特性可在土壤条件较差的土地很好的生长。因此种植木薯对贫困地区发展具有重要的意义，可以促进农民增加收入，有利于缓解“三农”问题，促进经济协调发展，为新农村建设提供有效的产业支撑。 1.3 研究内容研究内容 自然界中， 包括某些梭菌(Clostridium sp)在内的多种微生物都能代谢产生乙醇，但酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌和兼性厌氧细菌运动发酵单胞菌2 第一章 研究背景与研究内容 (Zymomonas mobilis)则是目前乙醇生产菌的主要开发对象。酿酒酵母(S.cerevis

29、iae)是传统的乙醇生产菌株，具备良好的工业生产性状，耗糖快、乙醇耐受力高、对水解糖液中有毒物质抗性强；全序列已测定，遗传操作技术也已经成熟12。Zmobilis是一种生产乙醇的替代微生物，与酵母菌相比，具有以下优点：1. 生长速度快；2. 吸收糖效率高，乙醇产量可达理论最大值的 97%；3. 发酵过程不需要通气，生产设备工艺简单；4. 易于基因改造以获得耐高温、耐乙醇、能利用各种碳源的优良菌株等13,14 。 本文主要是围绕着酿酒酵母和运动发酵单胞菌乙醇发酵条件进行的初步研究。 针对菌种各自的特点分别进行高浓度乙醇发酵和快速乙醇发酵研究，主要研究内容如下： 1 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵工艺

30、的研究 2 运动发酵单胞菌在单一葡萄糖为底物的培养基中的发酵情况研究 3 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵工艺研究 1.4 实验设计流程图实验设计流程图 快速乙醇发酵 葡萄糖中发酵特征 木薯快速乙醇发酵 Z.mobilis 高浓度乙醇发酵 木薯高浓度乙醇发酵 S.cerevisiae 乙醇发酵 3硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 参考文献 1 章克昌. 发展燃料酒精是玉米深加工的良好途径C. 中国发酵工业协会理事会论文集. 无锡: 轻工业出版社, 2000, 97100. 2 Demirbas M.F, Mustafa Balat. Recent advances on

31、 the production and utilization trends of bio-fuels: A global perspectiveJ. Energy Conv Manag, 2006, 47:23712381. 3 高寿清. 我国酒精工业现状与玉米生产酒精展望C. 中国发酵工业协会理事会论文集. 无锡: 轻工业出版社. 2000, 9397. 4 可再生能源发展“十一五”规划.国家发展和改革委员会. 5 Adeniyi O.D, Kove A.S, Abdulkareem A.S, Chukwudozie C. Ethanol fuel production from cass

32、ava as a substitute for gasolineJ. J Dispersion Sci Technol, 2007, 28:501504. 6 Balagopalan C. Cassava in Food, Feed and Industry. In: Hillocks R. J, Thresh J. M, Anthony Bellotti. Cassava: Biology, Production and UtilizationM. Central Tuber Crops Research Institute, Kerala, India, 2002:301318. 7 罗培

33、敏.我国木薯现状分析与发展研究J. 耕作与栽培, 2002, 3:5152. 8 Okezie,B.O, Kosikowski, FV. Cassava as a foodJ. Crit Rev Food Sci Nutr, 1982,17:259275. 9 Leng Ru-bo, Dai Du, Chen Xiao-jun, Wang Cheng-tao. Uncertainty in life cycle economical analysis of cassava-based ethanol fuelJ. J Cent South Univ Technol, 2005, 12:6569

34、. 10 Zhiyuan Hu, Fang Fang, DaoFeng Ben, Gengqiang Pu, Chengtao Wang. Net energy, CO2 emission, and life-cycle cost assessment of cassava-based ethanol as an alternative automotive fuel in ChinaJ. Appl Energy, 2004, 78:24756. 11 http:/ 12 李代昆， 张德纯 酿酒酵母发酵糖类生产酒精现状J 中国微生态学杂志, 2005，17(2):160封三 13 Rogers

35、 P. L, Jeon, Y. J, Lee K. J, Lawford H. G. Zymomonas mobilis for Fuel Ethanol and Higher Value ProductsJ. Adv Biochem Engin/Biotechnol, 2007, 108: 263288 14 Rogers P L，Lee K J，Skomicki M LEthanol production by Zymomonas mobilisJAdv Biochem Eng, 1982, 23:3784. 4 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 第二章第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇

36、发酵研究酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 2.1 引言引言 传统的乙醇发酵工艺存在以下问题：发酵效率低，生产成本高，能耗大，产生大量的废液，造成环境污染。目前，以淀粉质原料作为底物，美国的乙醇厂乙醇浓度可以达到12%(V/V)左右。而我国的燃料乙醇生产中，发酵液中乙醇含量为8% 10%(V/V)，乙醇发酵效率为88%90%，低于国际先进水平。若以现有工艺生产燃料乙醇，成本太高，不具备市场竞争力。 高浓度乙醇发酵(Very High Gravity，简称VHG)就是将发酵醪中乙醇浓度尽可能提高，以达到减污降耗的目的。高浓度乙醇发酵是以发酵醪液中可溶性固形物含量来定义的，一般的乙醇生产企业淀粉质原料

37、糖化醪的可溶性固形物含量为 20%25%(w/v)， 因此有人将高浓度乙醇发酵定义为每 1 L发酵液中含 300 g (30%(w/v)或者更高的可溶性固形物的乙醇发酵1。此外还有人将VHG技术定义为含 27 g糖/100 g糖化液的乙醇发酵2。 从整个乙醇生产工艺来看， 实现高浓度乙醇发酵， 可以节约用水，提高设备的利用率，节约蒸馏费用，减少污染，降低能耗等，因而受到广泛的重视3。 本章以酿酒酵母为菌种，木薯为原料进行高浓度乙醇发酵研究。在摇瓶实验中研究了培养基成分、糖化酶量、颗粒大小等影响高浓度乙醇发酵的基本因素，得到了最佳发酵条件，并将发酵规模放大到10 L和100 L进行了验证实验。

38、2.2 材料与方法 材料与方法 2.2.1 菌种菌种 本实验室筛选保藏的酿酒酵母 S.cerevisiae CCTCC M 206111。 2.2.2 培养基成分培养基成分 保藏培养基(g/L)：葡萄糖 20， 酵母粉 10，蛋白胨 20，琼脂 15，自然 pH, 0.1MPa 灭菌 30 min 种子培养基(g/L)：葡萄糖 100， 酵母粉 8.5， (NH4)2SO41.3， MgSO47H2O 0.1，CaCl2 0.06，0.08 MPa条件下灭菌 15 min 发酵培养基：称取一定量木薯粉，按照发酵所需糖浓度加入一定比例的水调浆后，8085 低温蒸煮液化至碘反应无色(pH 5.35

39、.6)。液化后添加所需营 5硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 养物质即为发酵培养基。 2.2.3 主要试剂与仪器主要试剂与仪器 主要试剂：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、MgSO47H2O、CaCl2、醋酸铅、硫酸钠、氢氧化钠、水杨酸、肌醇、生物素(Sigma公司提供，纯度 99%以上)等。 液化酶：Liquozyme Supra。一种由具有热稳定性的 -淀粉酶的混合的液体酶制剂，用于淀粉的液化。标准酶活力 90 KNU/mL （KNU 为诺维信液化酶的专有单位)。1KNU 的定义在 37 ，pH 5.6 时，每小时水解 5.26 克淀粉的酶量。 糖化酶：

40、苏宏牌第二代高转化率糖化酶。采用丹麦诺维信公司提供的最新一代菌种及生产工艺精制而成的，可水解糊精和多糖中的 -1,4 及 -1,6 糖苷键。标准酶活 500 AGU/mL。(一个 AGU 单位(诺维信公司糖化酶标准单位)是指在标准条件下，每分钟水解 1 微克分子麦芽糖所需的酶量，测定标准条件为以麦芽糖为作用物，25、pH4.3、反应时间 30 分钟) 主要仪器：超净工作台、XSZ-D2光学显微镜、恒温摇床(200 r/min)、恒温培养箱、751GW紫外、可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)、JA2003 电子天平、 LD5-2A离心机(北京医用离心机厂)、 全自动蒸汽压力灭菌锅 （江苏

41、医疗设备厂） 、旋转式粘度计(上海精科天平)、 福立 9790 气相层析仪 （浙江福立分析仪器有限公司） 、Waters高效液相色谱、蒸发光检测器ELSD 2000、10 L全自动不锈钢发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)。 2.2.4 培养方法培养方法 菌种保藏方法：酿酒酵母 S.cerevisiae 菌种接种至麦芽汁斜面，30 培养 2 天，4 冰箱保存。 种子培养方法：接一环生长良好的斜面酵母于种子培养基中，30 ，100 r/min 摇床培养至 OD 值(10 倍稀释)达到 0.8 以上。 木薯乙醇发酵：以体积分数约 10%接种量将种子液接入发酵培养基中，30 培养。 6 第二章 酿

42、酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 2.2.5 分析方法分析方法 2.2.5.1 菌体 OD 值的测定 将发酵液稀释 10 倍后，以蒸馏水为空白，测波长 620 nm 处的吸光度。 2.2.5.2 还原糖浓度的测定 3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法4。 3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液：称取 6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量热水中，移入 1000 mL 容量瓶中， 加入 2 mol/L 氢氧化钠溶液 325 mL， 再加入 45 g 甘油， 摇匀，定容到 1000 mL。避光保存一周后使用，每次重配试剂需重做标准曲线。 还原糖量的测定：吸取 2 mL 样液，置于 25 mL 容量瓶中，

43、再加入 3，5-二硝基水杨酸溶液 3 mL，沸水浴显色 5 min，然后以流动水迅速冷却，蒸馏水定容至刻度，摇匀。以试剂空白调零，在波长 540 nm 处比色，得到吸光度 A 值，参照葡萄糖标准曲线，求出还原糖的量。 2.2.5.3 总糖浓度的测定4 酸水解法： 取样品 10 g 左右放入 250 mL 水解瓶中， 加入 100 mL 蒸馏水和 30 mL 6 mol/L 的盐酸溶液。沸水浴水解 2 h 后，流水迅速冷却，用 40%的氢氧化钠调 pH 值至中性， 加入20 mL 20%的醋酸铅溶液摇匀后静止10 min沉淀蛋白质， 加入20 mL10%的硫酸钠中和过量的铅，加水定容至 500m

44、L，过滤，弃去初滤液，收集滤液用 3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定含糖量。 2.2.5.4 残糖成分分析方法 高效液相色谱法。色谱条件：水为流动相，流速 0.6 mL/min， Bio-Red Aminex HPX-87P 糖分析柱，3007.8 mm，柱温 85 ，进样量 10 L，蒸发光检测器 ELSD 2000，漂移管 110 ，载气为氮气，气压 3.2 Bar。 2.2.5.5 乙醇浓度的测定 气相色谱法:福立气相色谱仪，氢火焰离子化检测器。色谱条件：柱箱温度为 95，检测器温度 150 ，进样器 150 ，进样量 0.3 L。 7硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇

45、发酵条件研究 标准溶液的配制：正丙醇和乙醇 20 水浴 30 min，以正丙醇添加量 2%(V/V)，配制一系列标准乙醇浓度(V/V)，以乙醇峰面积与正丙醇峰面积比值 y，乙醇浓度 x，绘制标准曲线。样品同样在 20 水浴 30 min 后，按正丙醇添加量 2%(V/V)配制，以相同方式测定。 2.2.5.6 pH 值的测定 pHS3C 型数字酸度计 2.2.5.7 粘度的测定 NTJ 旋转粘度计 2.2.6 计算公式计算公式 发酵效率(%)=乙醇总质量(g)/ 0.511总糖质量(g)100 (无水乙醇相对密度(d420) 为 0.789) 糖利用率(%)乙醇总质量(g)/0.511消耗总糖

46、质量(g)100 发酵效率(%)乙醇总质量(g)/0.511总糖质量(g)100 发酵强度(g/kg/h)乙醇总量(g)/发酵液质量(kg)/发酵时间(h) 2.3 实验结果与分析实验结果与分析 2.3.1 DNS 法测定还原糖标准曲线 DNS 法测定还原糖标准曲线 标准葡萄糖浓度在 4 mg/mL以下具有良好的线性关系，见图 1。葡萄糖标准曲线为：y = 0.2838x + 0.0009，R2=0.9999。 8 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 y = 0.2838x + 0.0009R2 = 0.99990 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

47、 0 12345 葡萄糖含量Gglucose concentration (mg/mL)吸光度 A 图 1 葡萄糖标准曲线 Fig.1 Glucose standard curve 2.3.2 气相色谱法测定乙醇浓度的标准曲线 气相色谱法测定乙醇浓度的标准曲线 在 2.3.1 所述气相条件下乙醇与正丙醇能够完全分离，无干扰峰，且峰形好。乙醇的保留时间为1.851 min， 正丙醇的保留时间为3.511 min， 见图2(乙醇浓度为9%)。 1.8513.511 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 0.8 1.2 1.622.42.83.23.64 4.4 4.8 Time (m

48、in) 峰高（mV） 图 2 乙醇、正丙醇气相色谱图 Fig.2 Gas chromatography of ethanol and 1-propylalcohol 标准曲线方程为y = 0.4587x0.0077，R20.9995。乙醇浓度在 111%范围内具有良好的线性关系。 9硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 2.3.3 发酵方式的选择 发酵方式的选择 目前在乙醇发酵中主要存在两种发酵方式，先糖化后发酵(SHF：separate hydrolysis and fermentation)和同步糖化发酵(SSF：simultaneous saccharificati

49、on and fermentation)。 SHF是早期木薯原料发酵生产乙醇普遍采用的模式， SHF模式发酵速度较慢，主要是由于发酵初期高的糖浓度对酵母发酵产生抑制。20 世纪 70 年代，一些学者在研究纤维素发酵转化乙醇的过程中，为了防止糖积累和最终产物抑制，从而提高纤维素酶的催化水解效率，提出了同步糖化发酵(SSF)模式5，受到了广泛的重视。SSF是指在原料液化后在发酵过程中加入糖化酶使发酵和糖化同步进行，该方法具有很多的优点，如节约时间、降低能耗、减少高浓度糖的抑制作用等。但是SSF同样也具有一定的不足之处，如它不能同时兼顾酶和菌种发酵的最佳温度和pH值。因酿酒酵母对pH要求较宽泛，可在

50、酶的最适pH生长较好，所以本实验不考虑pH的影响6，主要研究了温度对糖化酶的影响。 糖化酶的最适温度为 55-60 ， 而发酵的最适温度为30 。 所以我们比较了在30 和60 糖化酶的作用效果。 由图3可知虽然60 糖化速度快，2 小时达到最大值，但是 30 条件下糖化 12 小时具有与之基本一致的效果。而木薯高浓度乙醇发酵时间要大于 20 小时，所以在 30 同步糖化发酵过程中，糖化酶不会影响发酵效果。此外同步糖化发酵糖化过程和发酵过程同时进行，提高了反应器利用率并节约了 60 糖化过程的能耗。 020406080100012345678910 11 12 13Time(h)DE3060

51、图 3 不同温度对糖化酶作用效果的影响 Fig.3. Effect of temperature on saccharification of cassava 进一步实验证明在发酵过程中 SSF 因为起始糖浓度低，菌体生长快，在 30 h 乙醇浓度达 12.475%而 SHF 过程中，起始糖浓度约 25%，菌体生长缓慢，同样发酵时10 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 间内乙醇浓度仅 7.26%(表 1)。所以 SSF 更有利于酿酒酵母木薯高浓度发酵。 表 1 SHF 和 SSF 发酵方式的比较 Table 1 The comparison of SHF and SSF on ethan

52、ol fermentation 发酵时间 Fermentation time 残还原糖% Reducing sugar 残总糖% Residual total sugar% 乙醇浓度%Ethanol concentration SHF 30 4.820 7.380 7.26 SSF 30 0.709 2.208 12.475 2.3.4 培养基成分的筛选 培养基成分的筛选 在高浓度乙醇发酵过程中，培养基成分对菌体生长有着重要的影响。研究表明肌醇、生物素、泛酸和Mg2+对酵母生长和代谢过程都起着一定的作用7-10。本实验主要研究了酵母粉(yeast extract)、营养盐(essential

53、minerals)、蛋白胨(peptone)、氯化钙(CaCl2)、生物素(biotin)、肌醇(inositol)对木薯乙醇发酵的影响。采用部分因子设计方法(Fraction Factorial Design)进行实验，实验结果见表 2。添加成分浓度为(g/kg): 酵母粉 5，营养盐 (KH2PO4 1.5, (NH4)2SO4 1.5，MgSO4 0.65)，蛋白胨 1.5, CaCl2 2.8，生物素 4.810-5和 肌醇 0.15。通过SPSS软件分析，酵母粉和营养盐是决定乙醇发酵的显著因素(sig121 )、中温蒸煮(100-121 )和低温蒸煮(80-95 )。选择 126 ，

54、115 ，100 ，85 四个蒸煮温度，处理时间为 10 分钟。由图可知，四种不同的处理对乙醇发酵过程几乎无影响，四个处理组在同步糖化发酵中发酵时间和乙醇浓度基本一致。 而低温蒸煮可节约蒸汽消耗 2030%，且操作简单，所以从经济和操作角度考虑，选择 85 低温预处理。 13硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 020406080100120140160180200051015202530Time（h）Reducing sugar concentration（g/kg）020406080100120140Ethanol concentration（g/kg）8510011

55、5126 图 4 预处理对乙醇发酵的影响 Fig.4 The effect of pre-saccharification for ethanol fermentation 2.3.7 液化酶浓度及加入方式对乙醇发酵的影响 液化酶浓度及加入方式对乙醇发酵的影响 液化酶浓度分别设定为 0.045，0.09，0.18 KNU/g 淀粉，加入方式分木薯淀粉糊化前加入和糊化后加入两种， 实验结果见表 5。 在同样的初始总糖浓度和发酵时间内，液化酶量为 0.045 KNU/g 时，发酵效率略低。液化酶浓度为 0.09，0.18 KNU/g 淀粉时，发酵结果基本一致。在同样的处理时间和处理温度下，液化酶加

56、入方式对乙醇发酵浓度无影响。但是糊化前加入液化酶可以使淀粉糊化释放时被快速分解，避免了受热不均时淀粉形成团块，并且可以有效的降低料液的粘度，提高流动性，有利于大规模发酵时管道的运输。所以在以下实验过程中采用液化酶浓度为 0.09 KNU/g 淀粉，糊化前加入的方式进行。 表5 不同液化酶添加量对乙醇发酵特征参数的影响 Table 5 Growth characteristics of SSF using different Liquozyme Supra dosage 糊化前加酶 糊化后加酶 液化酶量 Liquozyme Supra dosage KNU/g 淀粉0.0450.09 0.18

57、0.045 0.09 0.18 起始总糖浓度% Initial total substrate concentration 28.18628.18628.18628.186 28.186 28.186发酵时间 Fermentation time(h) 32 32 32 32 32 32 残还原糖浓度% Residual reducing sugar% 0.8460.8700.8930.840 0.825 0.90914 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 残总糖浓度% Residual total sugar% 2.2862.2092.3252.308 2.108 2.351乙醇浓度%(w

58、/w) Ethanol concentration 13.19813.33413.28613.283 13.409 13.317发酵终点质量 g Weight of medium 96.04396.55596.56394.46 95.843 96.288发酵效率% ethanol yield% 88.00789.38889.07487.114 89.229 89.0282.3.8 糖化酶浓度对乙醇发酵的影响 糖化酶浓度对乙醇发酵的影响 木薯的糖化过程是其乙醇发酵过程中的关键部分，糖化不完全是造成发酵终点残糖高、效率低的原因之一。糖化是一个复杂的生物化学变化过程，受糖化酶添加量、时间、 温度等多

59、种因素的影响。 本实验选择糖化酶浓度分别为 0.8, 1.67, 3.4, 6.7 AGU/g淀粉，实验数据见图 5 和表 6。由表中数据可知当初始糖浓度相同时，当糖化酶浓度为 3.4 AGU/g 淀粉乙醇浓度最高为 136.44 g/kg，残糖最低为 2.412%，发酵液的粘度最低。从乙醇发酵浓度、发酵时间以及糖的利用率综合考虑，最佳糖化酶浓度为 3.4 AGU/g 干物质。 0 306090120 150 180 210 240 03 691215182124273033Time (h)Reducing sugar concentration (g/kg) 020406080100120

60、140Ethanol concentration (g/kg) 0.67AGU 1.67AGU3.4AGU6.7AGU 0.67AGU 1.67AGU3.4AGU6.7AGU 图 5 不同糖化酶浓度对乙醇发酵的影响 Fig.5 Representative time courses of sugar and ethanol concentration with different glucosidase dosage. 15硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 表 6 不同糖化酶添加量对乙醇发酵特征参数的影响 Table 6 Growth characteristics

61、of SSF using different amyloglucosidase (AMG) dosage by Saccharomyces cerevisiae. 糖化酶浓度 Amyloglucosidase dosage(AGU/g starch) 0.8 1.67 3.4 6.8 起始总糖浓度 Total sugar concentration (%w/w) 31.57 31.57 31.57 31.57 乙醇浓度 Maximum of ethanol (g/kg) 134.04 136.24 136.44 134.02 残总糖 Residual total sugar(%w/w) 4.0

62、7 2.61 2.412 4.06 发酵强度 P(g/kg/h) 3.72 4.10 4.13 4.12 终点pH Final pH value 4.38 4.43 4.48 4.57 粘度 Final viscosity (mPa.s) 180 190 140 240 2.3.9 料水比对发酵的影响 料水比对发酵的影响 料水比不仅影响木薯的糖化，而且影响菌体的发酵。选择料水比 1：4，1：3，1：2.5，1：2，1：1.5 五个梯度，对应的总糖浓度分别为 16.57, 20.71, 23.67, 27.61, 33.14 %( w/w)。表 7 的实验结果表明当料水比从 1：4 到 1：2

63、逐渐增加时，乙醇浓度逐步增加，同时发酵时间也从 15 h 增加到 33 h。而料水比 1：1.5 时，液化过程中淀粉吸水膨胀不充分，醪液粘度大，无法充分搅拌，酶作用效果差，因此发酵后残糖过高。综合考虑选择料水比 1：2(总糖浓度 27.6%)为最佳料水比。 16 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 0 306090120 150 180 210 240 0 81624324048Time (h)Reducing sugar concentration (g/kg) 0 306090120 150 180 210 Ethanol sugar (g/kg) 1:41:31:2.51:21:1.

64、51:41:31:2.51:21:1.5图 6 不同料水比对乙醇发酵的影响 Fig.6 Representative time courses of sugar and ethanol concentration during fermentation with different initial substrate 表7 不同料水比对乙醇发酵特征参数的影响 Table 7 Growth characteristics of SSF in different initial substrate by Saccharomyces cerevisiae. 料水比 Hydromodulus 1:4

65、1:3 1:2.5 1:2 1:1.5 初始总糖浓度 Total sugar concentration (%w/w) 16.57 20.71 23.67 27.62 33.14 乙醇浓度 Ethanol concentration (g/kg) 73.43 94.49 108.6 130.85 129.62 发酵时间 Fermentation time (h) 16 20 25 33 48 残总糖浓度 Residual total sugar (%w/w) 1.276 2.156 2.589 2.813 5.171 发酵效率 Fermentation yield (%) 86.72 89.2

66、9 89.79 90.86 74.02 发酵强度 P(g/kg/h) 5.25 4.97 4.53 3.97 3.26 pH值 Final pH value 3.98 4.05 4.10 4.58 4.85 粘度 Final viscosity (mpa.s) 20 56 105 165 / 17硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 2.3.10 10 L 发酵罐实验 10 L 发酵罐实验 以优化后的培养条件进行10 L发酵实验，由图7可知，在10 L发酵罐中，该菌种仍有很好的发酵效果，还原糖和乙醇的变化趋势与摇瓶实验一致，30 h乙醇浓度可达约128.78 g/kg，发

67、酵强度为4.263g/kg/h。 0 20406080100 120 140 160 180 0 51015202530Time (h)Reducing sugar and ethanol concentration (g/kg) 012345pH valueSugarEthanolpH 图 7 10 L 发酵罐中还原糖、乙醇浓度和 pH 值的变化曲线 Fig.7 Reducing sugar, ethanol concentration and pH value during fermentation in 10 L fermentor: 2.3.11 100L中试实验 100L中试实验 考

68、虑到大规模实验中酵母粉的成本较高，试图选择其他营养成分来替代酵母粉，根据参考文献12，选择尿素、玉米浆两种工业上常用的氮源进行研究(表 8)。玉米浆浓度梯度为 1%、2%、4%，尿素浓度梯度为 0.1%、0.2%、0.3%。由实验结果可知 2%玉米浆和 0.2%尿素对酿酒酵母木薯乙醇发酵基本一致， 乙醇浓度大于 126 g/kg。由于玉米浆成分复杂且批次购买质量差异较大，为了便于分析和控制发酵过程，选用0.2%的尿素进行 100 L中试实验。 18 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 表 8 不同玉米浆和尿素浓度对发酵的影响 Table 8 The effect of different

69、concentration of corn steep liquor and urea on ethanol fermentation 玉米浆浓度% 尿素浓度% 1 2 4 0.1 0.2 0.4 乙醇浓度 Ethanol (g/kg) 115.63126.58126.20117.56127.66 127.56 残还原糖 Reducing sugars (g/kg) 8.63 6.63 6.60 7.56 6.22 5.96 残总糖 (g/kg) residual total sugars 2.8132.5892.6512.6562.412 2.532 发酵效率 Fermentation yi

70、eld(%) 81.8988.8188.5582.4989.57 89.50 采用优化后的工艺条件进行 100 L 中试实验，实验结果见图 8。本实验采用自然pH 发酵，发酵液初始 pH 为 6.5，接种后为 6.0，随着酵母的生长、繁殖，pH 迅速下降，到 12 h 下降至 4.1，随后维持在这一水平。发酵过程中粘度的变化不大，基本维持恒定状态。经 30 h 发酵后乙醇浓度达 127.75 g/kg，残还原糖 9.44 g/kg, 发酵强度4.258 g/kg/h。 0 2 4 6 8 10121416182003 6 912151821242730Time (h)Viscosity (mp

71、a.s)and pH 020406080100120140160180200Reducing sugar and ethanol concentration(g/kg) 粘度*100mpspHsugarethanol 图 8 100 L 发酵罐中乙醇浓度、还原糖、pH 值和粘度的变化曲线 Fig.8 Representative time courses of ethanol, reducing sugar concentration,viscosity and pH value during fermentation in 100 L fermentor: 19硕士学位论文 酿酒酵母和运动发

72、酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 2.3.12 残糖成分的分析 残糖成分的分析 利用高效液相色谱对酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵液残糖进行进行分析，图谱见图 2。谱图 A 为标准样品，1-6 依次为麦芽糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和果糖。谱图 B 为发酵结束时发酵液经过酸水解处理后的总糖样。谱图 C 为发酵终点的还原糖样。发酵结束后，经 DNS 法测定残还原糖为 0.944%、残总糖有 2.379%。经高效液相色谱分析，残还原糖中无葡萄糖、果糖等常见单糖。发酵液残糖经酸水解后在进行 HPLC 测定又有葡萄糖存在，浓度为 1.2%左右，高于 DNS 法测定的还原糖量， 约占测定总糖量的 50%。

73、这说明发酵后残糖中含有葡萄糖和其他糖由特殊糖苷键相连的二糖或二糖以上的低聚糖结构，但是糖化酶不能作用于该结构，使其释放葡萄糖。 图 9 酿酒酵母木薯乙醇发酵液残糖的 HPLC 分析图谱(A 为糖的标准品：1 麦芽糖，2 葡萄糖，3木糖，4 甘露糖，5 阿拉伯糖，6 果糖；B 为酸水解后的残糖；C 为发酵后残糖) Fig. 9 The chromatograms of residual sugar of ethanol fermentation from cassava by Saccharomyces cerevisiae (A: standard solution 1 Maltose 2 G

74、lucose 3 Xylose 4 Galactose 5Arabinose 6 Fructose; B:The reducing sugars by acid hydrolyzing; C: Reducing sugar) 2.4 讨论 讨论 实现高浓度乙醇发酵除了选育优良的酵母菌种外，发酵条件的研究对实现高浓度发酵也十分重要。酵母发酵条件包括营养因子和限制因子两个方面。营养因子主要20 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 包括氮源、分子氧、无机元素和各种金属离子等。抑制因子主要来源于高浓度的底物(如糖浓度)、代谢产物(如乙醇)、物理因素(温度、pH)等。在高浓度发酵工艺中，既要保证酵母

75、有足够的营养成分，又要保证发酵过程中抑制因子的水平近可能的低。 2.4.1 糖浓度对高浓度乙醇发酵的影响糖浓度对高浓度乙醇发酵的影响 碳源是酵母发酵最重要的营养物质，它是构成发酵终产物乙醇的骨架。发酵初期糖浓度对酵母发酵活力的影响很大。实验证明当葡萄糖浓度小于 10 g/L时，糖的消耗速度与糖浓度呈均匀的直线关系，当糖浓度大于 150 g/L时，糖对酵母的呼吸和发酵都产生抑制作用。高糖浓度对酵母的抑制主要分为两类：葡萄糖抑制和葡萄糖阻遏14。葡萄糖抑制是指在较高的糖浓度下，同时有多个分子倾向于与转移酶结合，从而抑制了结合效果和底物的吸收速度。葡萄糖阻遏是指阻止了mRNA的生成，导致相关代谢酶的

76、合成受阻。 为了避免底物的阻遏作用和抑制作用需要使乙醇发酵过程中维持较低的糖浓度。 本研究采用了边糖化边发酵工艺在一定程度上降低了发酵初始阶段的糖浓度，促进了菌体的生长。 2.4.2 乙醇浓度对高浓度乙醇发酵的影响乙醇浓度对高浓度乙醇发酵的影响 乙醇是酵母的代谢产物，低浓度的乙醇有助于酵母在培养基中形成竞争优势，但是高浓度的乙醇对酵母本身的生长和代谢也有抑制作用。主要表现在：破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，导致细胞内成分的流失；抑制乙醇脱氢酶的活性，增加了乙醛的形成；降低了ATP酶的活性等；增加质子向酵母细胞迁移的速率，抑制对氨基酸的吸收。适当的营养调节有助于提高酵母的对乙醇的耐受力15,16。

77、Kajiwara证明不饱和脂肪酸可以时酵母在高浓度乙醇的环境下保持较高的活性17。 Novoty等人认为麦角固醇有利于提高酵母耐乙醇能力18。 池振明等研究发现， 当细胞内磷酸酰肌醇含量较高时，可保护质膜的完整性，酵母菌产乙醇的速率和培养基中累积的最终乙醇产量都较高19。Odumeru等人认为海藻糖是衡量酵母菌乙醇耐受力的一个指标20。Mansure等人发现当酵母菌细胞含有高浓度海藻糖可以抑制乙醇引起的细胞内含物的泄漏， 提高菌体的存活率21。本研究表明添加肌醇、维生素、氯化钙等对酿酒酵母CCTCC M 206111 木薯乙醇发酵的影响不大，而实验室前期研究证明在单一葡萄糖培养基添加这些成分可

78、以提高菌体乙醇耐受性，这说明木薯本身还有少量的微量成分，可以满足 21硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 酵母高浓度乙醇发酵的要求。 2.4.3 氮源对高浓度乙醇发酵的影响氮源对高浓度乙醇发酵的影响 氮源对乙醇发酵十分关键，氮源的供给量可以影响糖酵解途酵母细胞物质的合成， 从而影响到发酵速率。 在高浓度乙醇发酵过程中， 氮源的缺乏通常引起发酵迟缓，发酵速率显著降低，发酵时间延长，发酵结束时残糖高22。研究表明造成这种现象的机制有两种：一是铵离子作为一个变构效应子调节磷酸果糖激酶的活性，影响到葡萄糖(果糖)的运输；另一种是氮源缺乏降低了葡萄糖通透酶的效率，导致发酵能力下降

79、23-24。Thomas等人发现，在高浓度发酵条件下，加入甘氨酸和脯氨酸等渗透压保护剂，有助于增加乙醇产量和酵母菌存活率，提高糖的利用率25。Jones认为补充氮源可以缩短高浓度乙醇发酵周期，提高最终产量26。Ingledew也证实，在高浓度乙醇发酵中，主要由于营养缺乏，如果在酵母菌生长 12h后，补充氮源，丰富培养基营养，酵母菌就可以再次大量生长繁殖， 乙醇浓度可大幅度提高27。 本研究也表明氮源对酿酒酵母CCTCC M 206111 发酵有重要作用，补充氮源可以缩短发酵时间，提高发酵强度。 2.4.4 溶解氧对高浓度乙醇发酵的影响溶解氧对高浓度乙醇发酵的影响 氧的供应除了作为电子受体、促进

80、细胞生长外，还促进存活因子的合成。存活因子(肌醇和长链不饱和脂肪酸)对保持细胞膜的完整性对抵抗发酵后期乙醇毒性方面有重要意义。存活因子只有在氧存在的情况下才能合成，因此在高浓度乙醇发酵中不能保持绝对厌氧。适度供氧可以减轻乙醇对膜通透性的破坏，保证细胞的完整性，有利于乙醇发酵。与摇瓶实验相比， 10 L 和 100 L 发酵罐中前期通气 2 h，满足了酵母生长对氧气的需求，菌体积累迅速，延滞期相对较短。 22 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 小小 结结 经过对酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵的研究，得到最佳条件为：木薯干粉碎度35 目左右，料水比 1：2，淀粉酶用量 0.09 KNU/g 淀粉

81、，蒸煮温度 85 ，蒸煮时间 15 min。采用 30 同步糖化发酵工艺，糖化酶用量为 3.4 AGU/g 淀粉，发酵时间 30 h。在实验室 10 L 发酵罐中，乙醇质量比达 127.88 g/kg，发酵效率为 88.28%，发酵强度4.263g/kg/h,100 L中试研究中乙醇浓度为127.75 g/kg,发酵强度4.258 g/kg/h。 采用高效液相色谱对发酵液中残糖成分进行分析，可知酿酒酵母已经将葡萄糖、果糖、蔗糖等可发酵糖全部利用完，剩余糖为不能被糖化酶分解的低聚糖。针对这些低聚糖研究能水解该结构的水解酶系是降低发酵液残糖，提高底物利用率的有效手段。 23硕士学位论文 酿酒酵母和

82、运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 参考文献 1 侯保朝，杜风光，郭永豪，贾新成，刘代武.高浓度酒精发酵J.酿酒科技，2005,4:9396. 2 Petra Bafrncova, Daniela mogrovicova, Iveta Slavikova, Jaroslava Patkova& Zoltan Dmeny. Improvement of very high gravity ethanol fermentation by media supplementation using Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol lett, 1999,21:33

83、7-341. 3 S.Alfenore, X.Cameleyre, L.Benbadis, et al. Aeration strategy: a need for very high ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch processJ. Appl Microbiol Biotechnol., 2004(63): 537 542. 4 宁正祥. 食品成分分析手册M. 北京:中国轻工业出版社，1998. 5 Takagi M, Abe S, Suzuki S, Emert G.H, Yata N. A method

84、 for production of alcohol direct from cellulose using cellulase and yeastM. In: Process bioconversion symposium 1977; p:55171. 6 Wingren A, Galbe M, Zacchi G. Techno-economic evaluation of producing ethanol from softwood: comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecksJ. Biotechnol Prog

85、r, 2003, 19(4):11091117. 7 Alfenore S, Molina-Jouve C, Guillouet SE, Uribelarrea JL, Goma G, Benbadis L Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch processJ. Appl Microbiol Biotechno, 2002, 60:6772. 8 Fan-Qiang Wang,Cui-Juan G

86、ao Chn-Yu Yang et al. Optimization of an ethanol production medium in very high gravity fermentationJ. Biotechnol Lett, 2007, 29: 233236. 9 Hu CK, Bai FW, An LJ. Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusant of Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via reduction

87、in plasma membrane permeabilityJ. Biotechnol Lett, 2003, 25:11911194. 10 Bafrncova P, Smogrovicova D, Slavikova I, Patkova J, Domeny Z. Improvement of very high gravity ethanol fermentation by media supplementation using Saccharomyces cerevisiaeJ. Biotechnol Lett, 1999, 21:337341. 11 Rhee.SK, Lee.GM

88、, Han.YT. Ethanol production from cassava and sago starch using Zymomonas mobilisJ. Biotechnol lett,1984, 6:615620. 12 吕欣，段作营，毛忠贵. 氮源与无机盐对高浓度酒精发酵的影响J. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2003,31(4):159-162. 13 Nikolov Zivko L, Jakovljevlc Jovan B, Boskov Zarke M. High performance 1iquid 24 第二章 酿酒酵母木薯高浓度乙醇发酵研究 chroma

89、tographic separation of oligosaccharides using amine modified silica columnsJ. Starch/Starke, 1984, 36(3):97-100. 14 Boulton, R. B., Singleton V. L., Bisson L. F. etc. Principles and Practices of WinemakingM. Aspen Publishers, Inc. 2001. 15 Petra Bafrncova, Daniela mogrovicova, Iveta Slavikova, Jaro

90、slava Patkova& Zoltan Dmeny. Improvement of very high gravity ethanol fermentation by media supplementation using Saccharomyces cerevisiaeM. Biotechnology Letters, 1999, 21:337-341. 16 Monteriro, F. F., and Bisson, L. F. Amino acid utilization and urea formation during vilificationJ. Am J Cnol Vitic

91、, 1991, 42: 371-394. 17 Kajiwara S. Polyunsaturated fatty acid biosynthesis in Sa.ce expression of ehtenol tolerance and the FAD2 gene from Arabidopsis thaliana J. Applied And Environmental Microbiology, 1996, 62: 43094313. 18 Arneborg N, Chi Z M. Saccharomyces cerevisiae strains with different degr

92、ees of ethanol tolerance exhibit different adaptive responses to produced ethanolJ. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2000, 24(1):7577. 19 池振明，张厚程，赵双枝酵母菌磷脂酰肌醇（PI）的生物合成及其重要的生理学功能生物工程进展，2002，22（2）：4143. 20 Odumeru J A, Amore D.Protection of interacellular trehalose content by corn a

93、nd soy flours in alcohol fermentationJ. Journal of Industrial Microbiology, 1993, 1:1319. 21 Mansure J C, Panek A D, Crowe L M, et al. Trehalose accumulation from soluble strarch by Sacc.ceJ. Biochimica Biophysica Acta, 1994, (2): 309316. 22 A. Mendes-Ferreira, M. del Olmo, J. Garca-Martnez et al. S

94、accharomyces cerevisiae Signature Genes for Predicting Nitrogen Deficiency during Alcoholic FermentationJ. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16): 53635369. 23 BUSTURIA, A. and R. Lagunas. Catabolic inactivation of the glucose transport system in Saccharomyces cerevisiaeJ. J Gen Micro, 1986, 132: 3793

95、85. 24 Lagunas, R., C. Dominguez, A. Mechanisms of appearance of the Pasteur effects in Saccharomyces cerevisiaeJ. Inactivation of the sugar transport systems. J. Bacteriol, 1982, 152: 1925. 25 Thomas K C, Hynes H S, Ingledew W M. Effect of particulate materials and osmoprotectants on very hegh grav

96、ity ethanlic germentationJ. Applied and Environmental Microviology, 1994, 15: 15201524. 25硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 26 Jones A M, Ingledew W M, Fuel alcohol production: optimization of temperature for efficient very high gravity fermentationJ. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(3):

97、 10481051. 27 Thomas K C, Ingledw W M. Production of 21% (v/v) ethanol by fermentation of very high gravity mashesJ. Journal of Industrial Microbiology, 1992, 10: 6168.26 第三章 运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发酵特征研究 第三章第三章 运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发酵特征研究运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发酵特征研究 3.1 引言 运动发酵单胞菌(Zymomonas.mobilis)，最早是Linder于 1924

98、年从龙舌兰酒中分离得到的，属于革兰氏阴性、兼性厌氧菌，大多是直杆状以及有圆形或卵形的尾端，有 1-4 根鞭毛，宽 1.4-2.0m，长 4.0-5.0m，经常以一对的形式存在，但很少集结成短链状1。泛酸盐是唯一需要的生长因子。在加入泛酸盐的合成培养基内生长，产量仅约为在酵母膏培养基中获得的一半2。运动发酵单胞菌只能利用三种碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗糖，其中每种糖的代谢都有显著的特征3。利用葡萄糖和果糖时，能够得到近似理论产量的乙醇。但是以蔗糖为底物时，由于副产物果聚糖和山梨醇等的形成，转化效率降低到 70%4。本部分主要研究运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的基本发酵特性。 3.2 材料和方法

99、3.2.1 菌种菌种 运动发酵单胞菌 225，225B，232，232B，473，560，596，814，本实验室保藏菌种。 3.2.2 培养基成分培养基成分 保藏培养基(g/L)：葡萄糖 100，酵母粉 5，(NH4)2SO4 1，KH2PO4 1，MgSO4 0.5 种子培养基(g/L)：同上 发酵培养基：除葡萄糖浓度不同外，其他成分同上 3.2.3 菌种培养方法菌种培养方法 菌种保藏方法：运动发酵单胞菌 Z.mobilis 菌种接种至种子培养基，30 培养 12 h，分装到试管中，4 冰箱保存，菌种保藏 1 月后要重新活化。 种子培养方法：Z.mobilis：接 5 mL 菌种于 100

100、 mL 种子培养基中，30 ，100 r/min摇床活化 20 h。取活化后菌种 5 mL 于 100 mL 种子培养基中，30 ，100 r/min 摇床培养 12 h。 发酵：以体积分数约 10%接种量将种子接入发酵培养基中，30 培养。 27硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 3.2.4 分析方法分析方法 3.2.4.1 菌体 OD 值的测定 以蒸馏水为空白，测波长 540 nm 处的吸光度。 3.2.4.2 酶谱试纸条鉴定胞外酶类 吸取 60 L 发酵液于每个杯盒中，试纸条槽内放少许的水，盖上盖子，在恒温箱内 37 反应 4 h。然后在每个杯盒中各滴加一滴辅助试

101、剂 A 和 B，反应 5 min 后显色。 3.2.4.3 还原糖、乙醇浓度等的测定方法 还原糖、乙醇浓度等的测定方法同 2.2.5。 3.3 结果与分析 3.3.1 不同菌株乙醇发酵的比较不同菌株乙醇发酵的比较 比较实验室保藏不同运动发酵单胞菌菌株在 18%葡萄糖培养基中的发酵情况(表1)。不同菌株发酵特性有很大差别，其中以 232B 和 560 发酵速度较快，乙醇产率较高。以下实验我们选择 232B 菌株进行进一步发酵条件研究。 表 1 不同运动发酵单胞菌菌株乙醇发酵的比较 Table 1 The comparison of different Z. mobilis strain on e

102、thanol fermentation 菌株编号 基本特点 发酵时间(h) 发酵结束 pH 乙醇 产率%225 菌体生长缓慢；絮状沉淀，结成较大块能摇散；适于静置培养，振荡效果差 / / / 225B 絮状沉淀，结成较大块，粘附管壁，能摇散 24 / 92.3%232 适于振荡培养，静置培养生长极差 23 4.56 91.1%232B 菌体生长迅速；适于振荡培养，静置效果差 18 4.59 94.3%473 在种子液中生长极缓慢，但快于 225；适于静置培养，振荡效果差；有少量絮状沉淀 48 4.86 93.3560 生长迅速；适于振荡培养，静置效果差 20 4.70 95.7%28 第三章

103、运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发酵特征研究 596 絮状沉淀多，但较分散；生长较缓慢 35 4.53 90.7%814 在发酵液中生长极其缓慢，几乎无法生长 40 4.96 55.7%3.3.2 菌体不同状态酶谱菌体不同状态酶谱 运动发酵单胞菌 232B 在冰箱放置时间超过 30 天后生长速度缓慢，为了找出造成这种发酵现象的原因，对冰箱冻存种子液(35 天)，活化种子液，发酵液进行酶系酶活鉴定(图 1)。该酶系鉴定试纸条 Api ZYM 共有 20 个杯，1 号为对照，其余可同时鉴定 19 种酶(各个杯所检测的酶种类见附录)。从该酶谱图可以看出，不同条件下，所检测的这 19 种酶，表现出活性

104、的酶种类不同。冻存种子液与活化后种子液、发酵液相比酶的种类缺少 6，9 号酶，这可能是造成冰箱长时间(30 d)后，菌体生长延滞期长的原因。 图1 不同状态下酶谱 Fig.1 Enzyme in different conditions 3.3.3 种子培养时间的确定种子培养时间的确定 种子的培养时间即种龄，以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长中后期为宜，这时接入培养基有利于缩短发酵周期，提高发酵产乙醇能力。每隔一定时间测定种子液的吸光度，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线(图 2)。从运动发酵单胞菌 232B 在种子培养基中的生长曲线图可以看出， 16-20 h 的种子处于对数生长

105、期，OD 值大于 1.0，菌体活性较好。 29硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 00.20.40.60.811.21.41.61.80481216202428323640Time (h)OD 图 2 运动发酵单胞菌 232B 对数生长曲线 Fig 2 The logarithm growth curve of Zymomonas mobilis232B 3.3.4 不同糖浓度对发酵的影响不同糖浓度对发酵的影响 初糖浓度的高低可直接影响运动发酵单胞菌的生长与发酵。 本实验主要研究不同初始糖浓度对乙醇发酵的影响。从表2的数据可以得出：低浓度15%时，运动发酵单胞菌能快速地

106、将葡萄糖转化成乙醇，发酵效率高，达94.43%。当葡萄糖的浓度超过一定浓度值时，运动发酵单胞菌的生长受到抑制，发酵时间延长，发酵效率降低。当底物浓度为30%时，在84 h后残糖仍然很高(4.96%)。由表中数据可知初糖浓度18-20%左右是该菌发酵的最佳初始糖浓度。 表2 运动发酵单胞菌232B在不同初糖浓度下的发酵情况 Table 2 Results of ethanol fermentation in different initial glucose concentrations by Z.mobilis232B 葡萄糖浓度 Glucose concentration(w/V) 15%

107、18% 20% 22% 24% 26% 30% 发酵时间 Fermentation time(h) 17 20 24 36 72 84 84 乙醇浓度 Ethanol concentration%(w/w) 7.32 8.26 10.02 10.89 11.3 11.04 11.54 残葡萄糖% Residual glucose concertration 0.24 0.325 0.346 0.364 0.62 1.98 4.96 发酵效率 Ethanol yield % 94.43 93.1 94.5 92.3 91.8 88.2 85.65 30 第三章 运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发

108、酵特征研究 3.3.5 温度对发酵的影响温度对发酵的影响 选取 25 ，28 ，30 ，33 ，35 五个温度梯度进行实验(图 3)。由图可知 Z.mobilis 232B 在 30-33 发酵时乙醇浓度较高，达到 8.7%(w/w)，而温度过高或过低都会影响菌体的发酵。 4 6 8 10 2025303540 温度（）乙醇浓度% 图 3 温度对乙醇发酵的影响 Fig 3 The effect of temperature on Z.mobilis 232B ethanol fermentation 3.3.6 pH 值对发酵的影响值对发酵的影响 与酿酒酵母相比，运动发酵单胞菌对培养基的 pH

109、 要求较严格，pH 的高低对菌体的生长和发酵起重要作用。本实验主要研究 Z.mobilis 232B 发酵产乙醇的最适 pH，选取起始 pH 为 4，5，6，7，8 进行实验(图 4)。由图可见，pH 在 6-7 范围内，菌体生长良好，乙醇浓度较高。 246810456789pH乙醇浓度 图 4 pH 值对 Z.mobilis 232B 乙醇发酵的影响 Fig 4 The effect of pH on Z.mobilis 232B ethanol fermentation 31硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 3.3.7 缓冲液的筛选缓冲液的筛选 运动发酵单胞菌乙醇

110、发酵的起始最适 pH 为中性范围，当 pH 低于 4 时，菌体很难生长。进一步实验比较了几种缓冲液的效果。以柠檬酸为缓冲液时，菌体几乎不生长。以醋酸和碳酸钙为缓冲液时，发酵效果较好，发酵效率达 90%以上。从缓冲效果和经济性两方面考虑我们选择碳酸钙做缓冲液。 表 3 缓冲对的筛选 Table 3 Results of different buffer for ethanol fermentation 缓冲液种类 柠檬酸 pH5.4磷酸pH 6.5醋酸pH 5.4 碳酸钙发酵时间 Fermentation time(h) 20 20 20 20 乙醇浓度 Ethanol concentratio

111、n %(w/w) / 8.01 8.81 8.87 残糖 Residual glucose concertration%14.8 1.733 0.254 0.62 发酵效率 Ethanol yield % / 89.36 92.73 92.27 3.3.8 缓冲液浓度的筛选缓冲液浓度的筛选 对碳酸钙缓冲液的浓度进行进一步的筛选，设置浓度依次为 0.25，0.54，0.75，1.0进行实验。由表可知碳酸钙浓度为 0.5%和 0.75%时，乙醇浓度（9.3%）和发酵效率(95%)明显好于碳酸钙 0.25%和 1%实验组，从经济角度选择最佳缓冲液浓度为 0.5%进行以下实验。 表 4 碳酸钙浓度的筛

112、选 Table 4 The choice of CaCO3 concentration 碳酸钙浓度% Concentration of CaCO30.25 0.5 0.75 1.0 发酵时间 Fermentation time(h) 20 20 20 20 发酵终点pH Final pH value 4.74 4.90 5.01 4.98 乙醇浓度 Ethanol concentration %(w/w) 8.679 9.367 9.323 8.891 32 第三章 运动发酵单胞菌在葡萄糖培养基中的发酵特征研究 残糖 Residual glucose concertration% 0.37 0

113、.40 0.39 0.40 发酵效率 Ethanol yield % 90.36 96.9 95.82 91.96 3.3.9 10 L 发酵罐实验发酵罐实验 在 10 L 发酵罐中对上述优化条件进行验证，初始葡萄糖浓度 18%，自然 pH 值，碳酸钙浓度为 0.5%，发酵温度 30 。发酵 18 h 后乙醇浓度为 88.51 g/kg，发酵效率为 93.59%。 0 5 10 15 20 25 03 6912151821 Time (h)Glucose concentration % 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 OD葡萄糖浓度OD 图 5 10 L 发酵罐中葡萄糖浓度和菌

114、体密度的变化曲线 Fig.5 The curve of glucose concentration and optical density in10 L fermentor 3.4 讨论讨论 3.4.1 菌体状态对发酵的影响菌体状态对发酵的影响 运动发酵单胞菌菌体状态对乙醇发酵的影响很大。实验中发现 Z.mobilis 冰箱 4 保藏 30 天后接入培养基中，菌体生长延滞期明显延长。用酶谱测定溶液中胞外酶发现，与活化后种子、发酵液相比，冰箱保藏超过 30 d 后，酶的种类较少，这可能是造成菌体启动慢的主要原因之一，具体机理有待于进一步研究。实验中采用二次转种可以很好的控制接入发酵液中种子的状态

115、，发酵速度快。 33硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 3.4.2 葡萄糖浓度对葡萄糖浓度对 Z.mobilis 发酵的影响发酵的影响 培养基中葡萄糖浓度对运动发酵单胞菌的生长影响较大，糖浓度的提高使生长延滞期延长。当糖浓度为 20时延滞期约为 10 小时，而糖浓度为 24时延滞期则为16 小时。当糖浓度进一步提高，菌体生长更加缓慢，且后期延长发酵时间，残糖基本不变。这主要是因为糖浓度增加了溶液的渗透压，使细菌生长的环境恶劣，同时由于后期乙醇的生成，细胞膜的稳定性进一步受到影响，抑制了菌体的生长。 3.4.3 Z.mobilis 乙醇耐受性机理乙醇耐受性机理 Z.mob

116、ilis 能耐受基质中较高浓度的乙醇(约 13%)， 这与其特殊的细胞膜构成及组分的变化有密切的关系。在 Z.mobilis 上还有丰富的磷脂酰乙醇胺和十八碳烯酸，另外存在类何帕烷类物质。通过改变这些物质的相对数量可以有效降低膜的流动性，以抵消高浓度乙醇对膜的影响，提高乙醇耐受性。 参考文献参考文献 1 A.N.格拉泽等. 微生物生物技术:应用微生物学基础原理M. 北京：科学出版社,2002.2 RE布坎南等，中国科学院微生物研究所伯杰氏鉴定手册翻译组伯杰氏鉴定手册(第八版)M北京：科学出版社，1984. 3 Georg A. Sprenger. Carbohydrate metabolism

117、 in Zymomonas mobilis: a catabolic highway with some scenic routes. Fems Microbiology Letters,1996,145:301307. 4 Baratti J ， BuLock J. Zymomonas mobilis ： A bacterium for ethanol productionJBiotechnol Adv，1986，4：95115. 34 第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 第四章第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 4.1 引言 运动运动

118、发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)具有很强的乙醇发酵能力，与酿酒酵母相比具有以下优点：1. 生长速度快，利用葡萄糖生产乙醇的速度是酿酒酵母的34倍；2. 吸收糖效率高，乙醇产量可达理论最大值的97%；3. 发酵过程不需要通气，生产设备工艺简单；4. 易于基因改造以获得耐高温、耐乙醇、能利用各种碳源的优良菌株等1,2。运动发酵单胞菌以其独特的优点，引起了研究者的关注，在糖蜜、玉米，早籼稻3-6等天然原料上都有所研究。但是在非粮作物，尤其是木薯中的系统研究还很少。本研究在实验室前期工作的基础上，以木薯粉原料，深入的研究了各种因素对运动发酵单胞菌乙醇发酵的影响，确定了其发酵的最佳条件，

119、以实现快速乙醇发酵，并利用高效液相色谱对发酵液残糖成分进行了分析。在研究过程中采用低温蒸煮和同步糖化发酵技术，免去了高温蒸煮和60 糖化过程，可节约大量的能源。 4.2 材料与方法 4.2.1 菌种菌种 运动发酵单胞菌 232B。 4.2.2 材料和分析方法材料和分析方法 同 2.2.5 4.3 结果与讨论 4.3.1 培养基成分的选择培养基成分的选择 运动发酵单胞菌乙醇生产能力受培养基成分影响较大，如氮源、磷酸盐和酵母膏等7。而在木薯干物质中，大约 90%为无氮浸出物，且绝大部分是淀粉，蛋白质含量很低，为 1.5%4%之间，且品质较差，其中 50%左右为非蛋白氮，以亚硝酸和硝酸态氮居多8。实

120、验中发现Z.mobilis在不添加任何营养物质的木薯糖化液中无法正常生长。根据前期实验和文献介绍9,10，本实验主要研究与Z.mobilis生长密切相关的四种营养成分对发酵的影响。 以Yeast extract(X1)， (NH4)2SO4(X2)， KH2PO4(X3)， 和MgSO4(X4)为研究因子，各因子的中心点依次为：X1=5g/kg, X2=1g/kg, X3=1g/kg, X4=0.5g/kg，选 35硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 用全因子实验设计，实验设计见表 1，实验结果见表 2。 表 1 全因子实验设计表 Table 1 Rang of val

121、ues for Full Factorial Design 水平 level 变量 variable -1 0 1 X1(g /kg) 2.5 5 7.5 X2(g /kg) 0.5 1 1.5 X3(g /kg) 0.5 1 1.5 X4(g /kg) 0.25 0.5 0.75 表 2 全因子实验设计结果 Table 2 The results of full factorial designs X1X2 X3 X4 Ethanol productivity (g/kg/h) 1 1 -1 -1 -1 4.397 2 0 0 0 0 5.297 3 -1 1 1 1 3.918 4 -1

122、-1 -1 -1 3.285 5 -1 1 -1 1 5.204 6 1 1 1 1 5.146 7 1 -1 1 -1 3.978 8 1 -1 1 1 5.063 9 -1 1 1 -1 3.935 10 1 1 1 -1 4.788 11 1 1 -1 1 4.915 12 -1 1 -1 -1 4.886 13 -1 -1 1 -1 3.367 14 0 0 0 0 4.831 15 1 1 -1 -1 4.839 16 -1 -1 -1 1 3.238 17 0 0 0 0 5.270 18 0 0 0 0 4.498 19 1 -1 -1 1 5.158 20 -1 -1 1 1

123、3.240 每组实验设计两个平行，以乙醇发酵强度P(g/kg/h)的平均值为独立变量，SPSS软件进行方差分析， 结果见表3。 Sig0.05， 表示该因素是显著因素。 由表3可知在0.05置信水平上，四个因素中，X1(酵母粉)，X2(硫酸铵)的浓度对Z.mobilis木薯乙醇发酵36 第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 强度具有显著性影响。这是因为酵母粉含有该菌生长的唯一生长因子泛酸盐，Othumpangat S等研究也表明酵母粉对Z.mobilis生物量的积累有着重要的作用7。而木薯本身氮源含量少，不能满足发酵需要，酵母粉和硫酸铵则为菌体生长提供了氮源。其他两个因素(X3 KH2

124、PO4，X4 MgSO4)浓度的改变对乙醇发酵强度的影响不明显，而且各因素之间不存在显著的交互作用。 表 3 方差分析 Table 3 Univariate Analysis of Variance Source Type Sum of Squares F Sig X13.250 22.210 0.018 X22.179 14.894 0.031 X30.387 2.642 0.203 X40.362. 2.475 0.214 X1*X20.865 5.914 0.093 X1*X30.207 1.413 0.320 X2*X30.165 1.131 0.366 X1*X2*X30.568 3

125、.883 0.143 X1*X40.290 1.980 0.254 X2*X40.055 0.375 0.584 X1*X2*X40.223 1.521 0.305 X3*X40.002 0.016 0.909 X1*X3*X40.065 0.445 0.552 X2*X3*X40.006 0.038 0.858 X1*X2*X3*X40.003 0.019 0.898 4.3.2 培养基主要成分浓度的选择培养基主要成分浓度的选择 由上述实验可知酵母粉和硫酸铵浓度的变化对乙醇发酵强度影响显著， 利用最速上升法对酵母粉和硫酸铵的浓度进行筛选，实验结果见表 4。 37硕士学位论文 酿酒酵母和运动发

126、酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 表 4 最速上升实验设计及实验结果 Table 4 The experimental design and results of steepest ascent search 酵母粉 Yeast extract (g/kg) 硫酸铵 (NH4)2SO4 (g/kg) 发酵强度 Ethanol productivity (g/kg/h) 1 2 0.4 3.886 2 3 0.6 4.090 3 4 0.8 4.468 4 5 1.0 4.058 5 6 1.2 3.991 6 7 1.4 2.064 由表 4 可知，低浓度时，发酵强度随营养物浓度的增加而提高，当酵

127、母粉浓度为4 g/kg，硫酸铵为 0.8 g/kg 时，发酵强度达到最大值 4.468 g/kg/h。当营养物质浓度继续升高时，发酵强度却呈下滑趋势，这主要是由于与酿酒酵母相比，Z.mobilis 对盐比较敏感，盐浓度越高，渗透压越大，抑制了菌体生长。 4.3.3 料水比对料水比对 Z.mobilis 木薯乙醇发酵的影响木薯乙醇发酵的影响 料水比对乙醇发酵有重要的影响。料水比低，初始总糖浓度低，有利于菌体的生长，但发酵终止时乙醇浓度低，后续蒸馏成本高。料水比增加，可以提高乙醇浓度和反应器的利用率，降低蒸馏的成本，但是同时也会增加发酵液的粘度和渗透压，不利于菌体的生长从而延长发酵时间甚至造成发酵

128、停止。 为了获得较高的乙醇浓度并且兼顾原料利用率和发酵时间，设计料水比为 1:5，1:4，1:3，1:2.5，1:2，相对应的初始总糖浓度依次为 13.924，17.371，21.033，24.23，27.26%(w/w)进行实验(图 1)。如图所示，料水比低时菌体耗糖速率快，发酵时间短，但乙醇浓度较低，料水比 1:5，乙醇浓度仅 74 g/kg。随着料水比的增加，发酵时间逐渐延长，乙醇浓度也逐步增加。但是料水比过高(如 1:2.5，1:2)时，发酵时间长，终点残糖高，且当乙醇浓度达到一定水平(约 115g/kg)，再延长发酵时间，乙醇浓度反而降低。综合考虑乙醇浓度，底物的利用率和设备利用率，

129、选择最佳料水比为 1:3。 38 第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 0 204060801001201401601802000 5 1015202530Time（h）Reducing sugar concentration（g/kg）0 20 40 60 80 100120140Ethanol concentration（g/kg） 1：5 1：2 1：41：31：2.51：5 1：2 1：41：31：2.5 图 1 不同料水比对乙醇发酵的影响 Fig.1 Representative time courses of reducing sugar and ethanol conce

130、ntration during fermentation with different initial Hydromodulus. 4.3.4 糖化酶浓度对糖化酶浓度对 Z.mobilis 木薯乙醇发酵的影响木薯乙醇发酵的影响 糖化酶在木薯乙醇发酵中起着重要的作用，它可以将木薯淀粉分解成可发酵糖，供运动发酵单胞菌乙醇发酵。糖化酶的用量对发酵有很大的影响。糖化酶浓度太高不仅增加成本，而且造成同步糖化发酵过程中可发酵糖的积累，渗透压增大，抑制菌体生长。糖化酶太少，淀粉水解不彻底，乙醇发酵不完全，残糖较高。选择 2.3 实验中获得的最佳料水比 1:3(对应初始总糖浓度为 22.139%w/w)，进行

131、实验，选择最佳糖化酶浓度(表 5)。糖化酶浓度依次为 1，2，4，8，16AGU/g 干物质。由表中数据可知，当糖化酶浓度为 4 AGU/g 干物质时，乙醇发酵强度最大为 4.915 g/kg/h，乙醇浓度最高为 103.22 g/kg，残还原糖和残总糖浓度最低，分别为 0.699%和 1.168%。糖化酶浓度过高或过低都不利于 Z.mobilis 木薯乙醇发酵。 39硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 表 5 糖化酶浓度对Z.mobilis乙醇发酵的影响 Table5 The Effect of glucosidase dosage for ethanol ferme

132、ntation by Z.mobilis 糖化酶量 Glucosidase dosage AGU/g starch 0.5 1 2 4 8 起始总糖浓度 Initial total sugar concentration%(w/w) 22.13922.139 22.139 22.139 22.139 发酵时间 Fermentation time (h) 24 22 21 21 24 残还原糖浓度 Residual Reducing sugar concentration%(w/w) 1.745 0.940 0.734 0.699 0.735 残总糖浓度 Residual total sugar

133、 concentration%(w/w) 4.527 1.803 1.334 1.168 1.379 乙醇浓度 Ethanol concentration (g/kg) 87.18 103.00 101.88 103.22 102.41 发酵强度 Ethanol productivity (g/kg/h) 3.632 4.680 4.851 4.915 4.267 发酵效率 Ethanol yield % 77.06 91.05 90.06 91.24 90.52 4.3.5 培养基不灭菌对培养基不灭菌对 Z.mobilis232B 快速乙醇发酵的影响快速乙醇发酵的影响 酵母乙醇发酵延滞期较短

134、，且对 pH 值的要求不高，可以在 pH 值低于 4.5 的条件下生长，这样可以有效的抑制其他杂菌的生长。因此工业生产多采用糊化液化后培养基不灭菌直接进行发酵的工艺，节约了大量的能耗。但是运动发酵单胞菌对 pH 值的要求较严格，在 pH 值低于 5.0 时很难生长，且该菌发酵初期延滞期较长(约 8-9 h)，这在一定程度上增加了染菌机率。本实验研究了在快速乙醇发酵过程中，Z.mobilis232B 是否能在不灭菌的培养基中正常发酵（图 2） 。由图可知，未灭菌组和灭菌组相比，发酵终点乙醇浓度、残还原糖、残总糖、pH 值和发酵液粘度基本一致。这说明在快速乙醇发酵过程中，85低温蒸煮可杀灭营养细胞

135、，在较短的发酵时间里（仅 21h） ，Z.mobilis232B 成为优势菌群，耗糖速度快，竞争性的抑制了其他杂菌的生长。综上可知，Z.mobilis232B 可以在低温蒸煮糊化液化后直接进行乙醇发酵，该处理过程可以节约大量能量。 40 第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 024681012Ethanol %(w/w)RSC%(w/w)RTSC(w/w)pH viscosity (pa.s)SterilizedUnsterilized 图 2 灭菌组与不灭菌组的比较(RSC：残还原糖；RTSC：残总糖) Fig 2 The comparison of sterilized and u

136、nsterilized (RSC: Reducing sugar concertation; RTSC: Residual total sugar concentration) 4.3.6 发酵液残糖成分的分析发酵液残糖成分的分析 利用高效液相色谱对 Z.mobilis232B 木薯乙醇发酵液残糖进行进行分析，图谱见图 3。谱图 A 为标准样品，1-6 依次为麦芽糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和果糖。谱图 B 为发酵结束时发酵液经过酸水解处理后的总糖样。谱图 C 为发酵终点的还原糖样。由图可知发酵液酸水解后糖主要是葡萄糖和少量半乳糖、阿拉伯糖。因为酸水解处理时需要用氢氧化钠中和盐酸，造成盐

137、浓度上升，基线漂移。而终点发酵液残还原糖中不存在葡萄糖和果糖，含有极少量的半乳糖和阿拉伯糖，其他大多数为二糖、三糖等低聚糖。与酿酒酵母发酵液中残糖成分相比，运动发酵单胞菌发酵液中残糖成分更复杂，而且这些残糖均不能被运动发酵单胞菌利用，这是造成利用运动发酵单胞菌利用天然原料发酵效率低于利用葡萄糖发酵的主要原因。 41硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 图 3 运动发酵单胞菌 232B 木薯乙醇发酵液残糖的 HPLC 分析图谱(A 为糖的标准品：1 麦芽糖，2 葡萄糖，3 木糖，4 甘露糖，5 阿拉伯糖，6 果糖；B 为酸水解后的残糖；C 为残糖) Fig. 3 The c

138、hromatograms of residual sugar of ethanol fermentation from cassava by Zymomonas mobilis232B (A standard solution 1 Maltose 2 Glucose 3 Xylose 4 Galactose 5Arabinose 6 Fructose; B final residual sugar; C final reducing sugar) 4.4 讨论讨论 4.4.1 营养物质的限制营养物质的限制 运动发酵单胞菌营养要求严格，而木薯淀粉含量高，但是蛋白质、脂肪含量少，不能满足菌体的生长

139、要求。本实验研究表明在利用木薯为碳源，仅添加尿素、硫酸铵等无机营养成分时，运动发酵单胞菌无法生长。而添加酵母粉后该菌生长迅速，发酵效果良好。Othumpangat S 等研究也表明酵母粉对 Z.mobilis 生物量的积累有着重要的作用。 寻找新的廉价替代营养成分或是含有可满足该菌生长的其他底物进行乙醇生产可大大降低成本，推动运动发酵单胞菌的工业应用。本实验室研究表明运动发酵单胞菌 232B 发酵鲜红薯生产乙醇无需添加酵母粉。 4.4.2 快速乙醇发酵快速乙醇发酵 与酵母菌相比，运动发酵单胞菌对外界环境更为敏感，发酵培养基的pH值对其生长和发酵的影响较大11。运动发酵单胞菌的发酵最适pH在中性

140、范围12,13，发酵时很容易染菌，这是影响其工业化应用的主要原因之一。石贵阳等通过筛选得到一株可42 第四章 运动发酵单胞菌木薯快速乙醇发酵的研究 在pH4.5 进行乙醇发酵的菌株，发酵 48 h乙醇浓度为 71.7 g/L14。本实验证明在快速乙醇发酵过程中，起始pH值中性范围时，未灭菌组和灭菌组相比，发酵终点乙醇浓度、残还原糖、残总糖、pH值和发酵液粘度基本一致，乙醇浓度达 103.22 g/kg。这主要是因为 85 低温蒸煮可杀灭营养细胞，且在较短的发酵时间里(仅 21 h)，Z.mobilis232B成为优势菌群，耗糖速度快，竞争性的抑制了其他杂菌的生长。 4.4.3 残糖成分分析残糖

141、成分分析 运动发酵单胞菌最终能否用于工业生产，最关键是要能否快速高效发酵天然原料生产乙醇。运动发酵单胞菌底物利用范围窄，仅能利用葡萄糖、果糖和蔗糖，且利用果糖和蔗糖发酵时乙醇效率低，副产物山梨醇、甘油等含量较高。目前主要采用酸水解法和双酶法将底物转化为葡萄糖等可发酵糖。本实验采用双酶法处理木薯原料，通过分析发酵液残糖成分可知，发酵液中不存在葡萄糖、果糖等可被运动发酵单胞菌利用的单糖，而是含有葡萄糖结构的低聚糖。通过酸水解可以检测到葡萄糖，但进一步添加糖化酶却不能释放其中的葡萄糖成分。 这说明目前采用的酶制剂不能有效水解残余的低聚糖。因此寻找新的低聚糖高效降解酶系，可减少发酵液中的残糖，从而提高

142、原料的利用率15； 同时利用1%的葡萄糖就可降低废液污染负荷COD值约104 mg/L。 43硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 小结小结 对 Z.mobilis 232B 木薯同步糖化乙醇发酵条件进行了优化，并对发酵液残糖成分进行了分析，为进一步研发高效的酶制剂，加快 Z.mobilis 大规模工业应用提供了理论依据。 (1) 通过 Full factorial 实验设计和最速上升实验确定了发酵培养基的显著性因子及其最适浓度为：酵母粉 4 g/kg，硫酸铵 0.8 g/kg。在最佳培养基条件下进一步研究了料水比和糖化酶浓度对发酵的影响，确定最佳糖化酶浓度为 4 AGU

143、/g 淀粉，料水比为 1： 3。 在最佳发酵条件下， 30 同步糖化发酵 21 h 后， 乙醇浓度可达 103.22 g/kg，平均发酵乙醇强度为 4.915 g/kg/h。与利用其他底物发酵相比发酵时间缩短了十多个小时以上，乙醇发酵强度提高 150%以上，实现了快速乙醇发酵。 (2) 进一步实验证明在快速乙醇发酵条件下， Z.mobilis 232B 可以在不灭菌培养基上进行发酵，为工业化应用提供了基础。 (3) 利用高效液相色谱对发酵液残糖成分进行分析，证明运动发酵单胞菌 232B已利用完发酵液中的葡萄糖、果糖等可发酵单糖，残糖均为结构复杂的二糖、三糖等低聚糖。 44 第四章 运动发酵单胞

144、菌木薯快速乙醇发酵的研究 参考文献参考文献 1 Rogers P. L, Jeon, Y. J, Lee K. J, Lawford H. G. Zymomonas mobilis for Fuel Ethanol and Higher Value ProductsJ. Adv Biochem Engin/Biotechnol, 2007, 108: 263288 2 刘艳, 赵海, 戚天胜.一株运动发酵单胞菌Zy-1快速发酵生产乙醇J. 应用与环境生物学报，2007, 13: 6972 3 Cazetta M.L, Celligoi M.A.P.C, Buzato J.B, et al. F

145、ermentation of molasses by Zymomonas mobilis: Effects of temperature and sugar concentration on ethanol productionJ.Bioresour Technol, 2007, 98(15), 28242828. 4 石贵阳, 吕惠敏, 章克昌. 玉米原料细菌酒精发酵的研究J. 无锡轻工业学报, l995, 14(2): l2ll24. 5 朱浩里, 王泽云，张君等.不同菌种利用早籼稻糖化液发酵生产乙醇的研究J. 酿酒, 2003, 30(1):1720. 6 Linda Davis, Pe

146、ter Rogers, John Pearce, et al. Evaluation of Zymomonas-based ethanol production from a hydrolysed waste starch streamJ. Biomass Bioenerg, 2006, 30, 809814. 7 Othumpangat S，Nagin C，Sidappa CBOptimization and Interaction of Media Components in Ethanol Production Using Zymomonas mobilis by Response Su

147、rface MethodologyJJ Biosci Bioengineer, 1999, 88: 334338. 8 赵江, 赵华. 木薯酒精发酵条件优化J. 酿酒, 2003, 2: 7679 9 Gunasekaran P, Karunakaran T, Kasthuribai M. Fermentation pattern of Zymomonas mobilis strains on different substratesa comparative studyJ. J. Biosci., 1986, 10(2):181186. 10 Kalnenieks U, Galinina N

148、, Toma M M. Ethanol cycle in an ethanologenic bacteriumJ. FEBS Lett, 2002, 522: 68. 11 Lawford H, Ruggiero A. Production of fuel alcohol by Zymomonas mobilis: effect of pH on maintenance and growth-associated metabolismJ. Biotech Appl Biochem, 1990, 12: 206211. 12 Ingrain L O, Aldrich H C，Borges A C

149、 C, et a1. Enteric bacterial catalysts for fuel ethanol productionJ. Bioteclmology Progress,1999,15:855866 13 Jeon Y J， Svenson J C， Joachimsthal E L， et a1. Kinetic analysis of ethanol production by an acetate-resistant strain of recombinant Zymomonas mobilisJ.Biotechnol Lett, 2002, 24:819824. 45硕士

150、学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 14 陶飞, 石贵阳, 徐良玉, 章克昌. 耐酸性运动发酵单胞菌的筛选和酒精发酵条件的优化J. 无锡轻工大学学报，2003，22(5):7679. 15 张树政. 酶制剂工业 (下册)M. 北京: 科学出版社, 1989.46 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 第五章第五章 综述综述 燃料乙醇发酵研究进展燃料乙醇发酵研究进展 5.1 前言 前言乙醇是目前世界上生产历史最悠久、产量最大的发酵工业产品。乙醇生产实现工业化始于19世纪末，至今已经有百余年历史。乙醇学名乙醇，是由碳、氢、氧3种元素组成的有机化合物，结构式是C H OH25，是一

151、种无色透明、易挥发、易燃烧的液体。乙醇广泛应用于食品、化工、医药、染料、国防等行业1，同时乙醇又是十分重要的清洁能源。将它作为未来的一种可再生能源来考虑，以缓解世界性的能源短缺问题，则始于20世纪70年代。随之国民经济的发展，石油危机和温室效应的加剧，燃料乙醇的发展得到了高度的重视。美国和巴西在利用燃料乙醇方面走在世界的前列2。目前车用燃料乙醇的使用主要有两种模式：美国 “汽油醇”模式。配制汽油和无水乙醇的混合物，乙醇在混合物中的比例最高可达25%。汽油醇是一种可再生清洁能源而且可替代四乙基铅作汽油的防爆剂。(2)直接利用乙醇作为汽车燃料模式。这时必需使用专门设计的，具有更高压缩比的发动机。1

152、989年，巴西以甘蔗、糖蜜等为原料年产发酵乙醇1210 t6以上，几乎全部用来代替汽油，大部分采用第二种方式作为汽车的燃料，率先实现了汽车燃料的乙醇化。5.2 发展燃料乙醇的意义发展燃料乙醇的意义 燃料乙醇作为生物能源可缓解石油能源短缺的问题。 化石燃料是不可再生资源，现在全球已探明的石油储量为 1,464108t，如以每年开采 30108t测算的话，在今后40 年50 年内地球上的石油将被用尽3。为此，各国都在为开发新能源，特别是汽油的代用品而努力。积极发展燃料乙醇这种可再生清洁能源，是人类必须面临的重大选择。 使用燃料乙醇可以缓解日益严重的大气污染问题。这是因为，乙醇的辛烷值比汽油高许多，

153、既是抗爆剂又是助燃剂，所以用汽油醇作燃料不用再添加四乙基铅或MTBE 就可成为高标号燃料油，可消除空气中的铅的污染。 乙醇作燃料可以缓解因地球温室效应加剧带来的气温升高及地球气候恶化等严重后果4。20 世纪 80 年代初，人们提出了由于温室效应加剧，造成地球气候剧变的说法。科学家进一步认为温室效应加剧是因为温室气体浓度增加引起的，而在诸多温室气体中CO2是主要的。大气中CO2来自各个方面，其中 50%来自汽车尾气的排放。所以，控制汽车尾气是缓解温室效应的主要手段之一。图 1.1 的数据显示，光合作用合成 1 分子葡萄糖需要 6 分子的CO2，乙醇发酵和燃烧共释放 6 分子CO2，所以乙醇 47

154、硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 燃烧不增加大气中CO2浓度(图 1.1)。 所以， 使用燃料乙醇是消除由于汽车尾气中CO2排放引起的温室效应最有效的措施之一。巴西和美国均采取了相应的控制措施和手段。 图 1.1 光合作用与燃料乙醇的关联 Fig.1.1 The relationship of photosynthesis and fuel ethanol 5.3 国内外燃料乙醇发展概况国内外燃料乙醇发展概况 5.3.1 巴西燃料乙醇的发展巴西燃料乙醇的发展 燃料乙醇实现工业化生产始于巴西。 巴西发展燃料乙醇主要基于两方面的考虑，一方面时国内石油资源的匮乏， 另一方面

155、时盛产甘蔗， 农业资源丰富。 巴西是贫油国，1973 年和 1979 年爆发的两次石油危机给正在快速发展巴西经济造成了沉重打击，为实现能源自给，巴西政府加速实施了以燃料乙醇为重点的替代能源战略，提高了乙醇汽油中的乙醇比例，加大了对燃料乙醇的研发投入并扶持相关企业5。巴西自然条件优越，甘蔗资源丰富，是世界上最大的产糖和蔗糖出口国，生长成本低，在以甘蔗为原料的燃料乙醇生产与推广使用方面具有代表性。 它是目前世界上主要的燃料乙醇生产和消费国之一，也是世界上唯一不使用纯汽油作为汽车燃料的国家6。2004 年，其生产量为 146 亿升(约合 1152 万吨)，乙醇消费量超过 122 亿升，乙醇占汽车燃料

156、的比重 15.42%，同期乙醇出口量超过 23 亿升。同时，巴西也是世界上燃料乙醇生产成本最低的国家，燃料乙醇已经具备了相当的市场竞争力，早在 2001 年巴西政府就已取消了对燃料乙醇的补贴，由市场供求直接调节。目前，巴西年产乙醇已超过 1200万吨，乙醇在汽油中的添加比重为 20%25%，50%以上的汽车使用乙醇燃料，而该国生产的新一代汽车可以完全使用乙醇为燃料7。巴西实施燃料乙醇计划给国家带来的效益主要表现为：一是形成了独立的经济能源运行体系；二是刺激了国家农业、乙48 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 醇工业以及相关产业的协调发展，同时增加了就业的总数；三是促进了本国大气和生态环境的显

157、著改善。 5.3.2 美国燃料乙醇的发展美国燃料乙醇的发展 由于 1973-1974 年石油输出国组织大量提高石油的价格，造成了石油危机，世界各国又重新关注生物乙醇，同时受到巴西发展燃料乙醇计划的启示，美国于 1978 年首次在布达拉斯州推广燃料乙醇(加入量为 10%)。同年，美国的普度大学成立了国际上第一个再生资源研究室， 而美国的能源部又成立了两个用于研究燃料乙醇发展计划的实验室，主要从事生物质转化为乙醇的科学研究。1979 年，美国国会为了减少对进口石油的依赖， 利用本国丰富的玉米资源发展燃料乙醇 8， 当年的产量达 3104t，到了 1990 年达 2.60106t。1990 年美国实

158、施的空气清洁法进一步促进了燃料乙醇的应用发展，1999 年美国环保局与国会共同推广的“清洁替代燃料计划”-禁止使用MTBE，使得燃料乙醇的发展得到推广9-12。目前美国燃料乙醇工业呈现出良好的发展势头，燃料乙醇需求量急剧增加。2005 年 8 月，美国出台的新能源法案正式生效，该法案提出“2012 年，要使每年利用燃料乙醇或生物资源的数量达到 75 亿加仑” 。 5.3.3 欧盟燃料乙醇的发展欧盟燃料乙醇的发展 欧盟国家发展燃料乙醇主要是基于以下原因：一是石油价格的不断上涨；二是为了减少对石油的依赖；三是为了增加就业机会；四是将能源消耗的资金留在本国；五是乙醇汽油的使用提高了汽油的动力性能；

159、六是在一定程度上改善了本国的生态环境状态。2004 年欧盟燃料乙醇产量达 1.75106t左右，乙醇汽油的使用量约在 1.0106t以上。相比巴西和美国，欧盟生产燃料乙醇成本较高，以小麦为原料燃料乙醇的成本为 0.48 美元/升，以甜菜为原料大约为 0.52 美元/升13,14. 5.3.4 我国燃料乙醇的发展我国燃料乙醇的发展 我国燃料乙醇产业起步较晚，但发展迅速，前景广阔。最初我国的燃料乙醇生产以陈化的玉米，小麦等粮食为原料，燃料乙醇为当时农产品的出路提供了巨大的市场。2004 年政府规定吉林燃料乙醇有限责任公司、河南天冠集团、安徽丰原生物化 49硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯

160、乙醇发酵条件研究 学股份有限公司和黑龙江华润乙醇有限公司为燃料乙醇定点生产企业，其中，河南天冠集团主要以小麦为原料，其他三家都以玉米为原料。2005 年，我国生产了 102 万吨燃料乙醇， 成为世界上继巴西、 美国之后第三大生物燃料乙醇生产国和应用国。 2006年，我国燃料乙醇的生产达到 144 万吨15。 与巴西、 美国相比， 我国目前燃料乙醇生产成本较高， 价格偏低， 能源消耗严重，乙醇生产必须依靠政府补贴才能够保本/盈利。安徽丰原生物化学股份有限公司是上市公司， 公司向公众提供的数据是： 国家提供的财政补贴， 2005 年每吨补贴 1883 元，2006 年每吨补贴 1628 元，200

161、7 和 2008 年每吨补贴 1373 元。按照国家计划，定点生产燃料乙醇的企业，财政补贴将逐年递减，直至 2008 年完全取消。这就意味着燃料乙醇的生产将完全推向市场，竞争将进一步加剧，对原料的选择也将成为企业竞争的重中之重。 根据我国生物燃料乙醇及车用乙醇汽油“十一五”发展专项规划 ，“十一五”期间， 我国将生产 600 万吨生物液态燃料， 其中燃料乙醇 500 万吨， 到 2020 年生产 2000万吨生物液态燃料，其中燃料乙醇 1500 万吨。未来我国玉米生产将难以满足燃料乙醇生产的工业化需求。 考虑到玉米生物乙醇的发展可能威胁到国家的粮食安全， 为此，2006 年起国家停止新批玉米燃

162、料乙醇企业，并大力鼓励发展非粮食能源作物为原料开发燃料乙醇。2006 年 10 月，中粮集团投资的国内第一个用木薯生产、年产 20 万吨燃料乙醇项目在广西开工。河南天冠集团已经开始了转型之路，2007 年 8 月底，其年产 3000 吨的纤维素乙醇项目已奠基，这是国内首条千吨级纤维素乙醇产业化试验生产线。 5.4 乙醇发酵概论乙醇发酵概论 5.4.1 乙醇发酵的机制乙醇发酵的机制 自然界中， 包括某些梭菌(Clostridium sp)在内的多种微生物都能代谢产生乙醇，但酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌和兼性厌氧细菌运动发酵单胞菌(Zymomonas mob

163、ilis)则是目前乙醇生产菌的主要开发对象16。 5.4.1.1 酵母菌的代谢机理和乙醇的生物合成 酵母菌在厌氧条件下可发酵己糖形成乙醇，其生化过程主要由两个阶段组成。第一阶段己糖通过EMP途径分解成丙酮酸。 第二阶段丙酮酸由脱羧酶催化生成乙醇和二50 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 氧化碳，乙醇进一步被还原成乙醇，整个过程如图2所示17。葡萄糖发酵成乙醇的总反应式C6H12O62C2H5OH+2CO2。 图2 酿酒酵母乙醇发酵代谢途径 Fig. 2. Metabolic pathway of ethanol fermentation in S. cerevisiae. Abbreviat

164、ions: HK: hexokinase, PGI: phosphoglucoisomerase, PFK:phosphofructokinase, FBPA: fructose bisphosphate aldolase, TPI: triose phosphate isomerase, GAPDH: glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,PGK: phosphoglycerate kinase, PGM: phosphoglyceromutase, ENO: enolase, PYK: pyruvate kinase, PDC: pyruvat

165、e decarboxylase, ADH: alcohol dehydrogenase. 发酵过程中除主要生成乙醇外， 还生成少量的其他副产物， 包括甘油、 有机酸 (主要是琥珀酸)、杂醇油 (高级醇)、醛类、酯类等。理论上 lmol 葡萄糖可产生 2mol 乙醇，即 180g 葡萄糖产生 92g 乙醇，得率为 51.1%，可是实际得率没有这么高。因为酵母菌体的积累约需消耗 2%的葡萄糖，另外约 2%的葡萄糖用于形成甘油、有机酸、杂醇油等。因此，实际上只有约 47%的葡萄糖转化成乙醇。 5.4.1.2 运动发酵单胞菌的乙醇发酵 运动发酵单胞菌是一种革兰氏阴性厌氧菌， 具有很强的产乙醇能力18。

166、 发酵单胞 51硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 菌的糖代谢不同于酵母菌EMP途径， 而是采用ED途径19。 ED途径又名 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(KDPG)裂解途径是，少数缺乏完整EMP途径的微生物所具有的一种替代途径。其特点是葡萄糖只经过 4 步反应即可快速获得由EMP途径需经 10 步反应才能形成的丙酮酸。在ED途径中，6-磷酸葡萄糖先脱氢产生 6-磷酸葡萄糖酸，后在脱水酶和醛缩酶的作用下，生成 1 分子 3磷酸甘油醛和 1 分子丙酮酸。3磷酸甘油醛随后进入EMP途径转变成丙酮酸。1 分子葡萄糖经 ED 途径最后产生 2 分子丙酮酸，以及净得各 1

167、分子的 ATP、NADPH 和 NADH。 图 3 运动发酵单胞菌乙醇发酵代谢途径 Fig 3 Metabolic pathway of ethanol fermentation in Z.mobilis 5.4.2 乙醇发酵过程乙醇发酵过程 乙醇发酵可分为三个不同的阶段，前发酵期、主发酵期和后发酵期20。各期时间长短与菌株的种类、数量、糖化剂的种类，醪液进罐温度以及发酵操作等关系密切。一般说来，间歇发酵总时间为 56-72 h，连续发酵为 44-52 h。 (1) 前发酵期 种子液进入发酵罐与糖化醪混合后，由于菌体密度不高，醪液中的各种营养也充分，因此，菌体经短时间适应后开始生长繁殖。与此同

168、时，糖化酶继续作用，糊化液化的淀粉以及糊精被转化为糖。前发酵期延续时间一般为 10 h 左右，连续发酵时前发酵期基本不存在。前发酵期的发酵作用不强烈，醪液温度低，乙醇含量低，对杂菌52 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 抑制能力差，因此此发酵阶段应特别防止杂菌污染。 (2) 主发酵期 主发酵期由于酵母细胞大量形成，醪液中的细胞数可达 1 亿个/ml 以上，由于醪液中氮、磷等缺乏，菌体己不再大量繁殖，而主要进行乙醇发酵。此阶段，醪液中的糖分消耗迅速，乙醇含量增加。主发酵时间一般为 12-15 h 左右。 (3) 后发酵期 后发酵期醪液中的糖分己大部分被酵母菌所利用， 但醪液中残存的糊精等多糖成

169、分继续被转化为可发酵性糖，酵母则将它转化为乙醇。后糖化的作用的速度比糖发酵速度要慢得多。后发酵期乙醇和二氧化碳生成量较主发酵期减少，表观看来，气泡仍不断产生。淀粉质原料生产乙醇的后发酵阶段一般约需要 40 h 左右才能完成。此时发酵液的温度应控制在 3032 ，若醪液温度太低，会影响糊精及淀粉的糖化作用，造成残糖增加，影响原料的淀粉利用率。 5.5 乙醇发酵工艺进展乙醇发酵工艺进展 我国乙醇工业以淀粉质原料生产为主，该部分主要以淀粉质原料木薯为例进行介绍。淀粉质木薯乙醇发酵的主要工艺流程为: 原料预处理水热处理(液化)糖化发酵蒸馏 5.5.1 原料的预处理原料的预处理 原料的预处理主要包括原料

170、的除杂和粉碎。 木薯在收获和干燥过程中，经常会掺夹进泥土、沙石、金属杂质等。如不经除杂处理直接用于乙醇生产，不仅易造成生产管道和设备的堵塞，影响正常生产，而且会造成设备严重损坏，管道设备磨损加快。原料清杂方法通常用筛选和磁选。筛选多选用振动筛去除原料中的较大杂质及泥沙； 磁选多选用永磁马蹄铁去除原料中的磁性杂质，如铁钉、螺母等。 木薯原料的粉碎，有利于增加原料的表面积，加快原料吸水速度，降低水热处理温度，节约水热处理蒸汽；有利于-淀粉酶与原料中淀粉分子的充分接触，促使其水解彻底，速度加快，提高淀粉的转化率；有利于物料在生产过程中的输送。与整粒或整片原料相比，粉碎后的原料所需的蒸汽压力和温度比较

171、低，时间比较短，从而可以减少蒸汽用量，提高原料蒸煮质量，减少可发酵物质的损失。乙醇生产原料的粉碎按 53硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 带水与否分为：干式粉碎和湿式粉碎21。 5.5.2 原料的水热处理原料的水热处理 植物组织细胞中的淀粉受细胞壁裹护，极难与淀粉酶作用，通过水热处理，使粉料充分与水混合得到粉浆，粉浆加热温度升高，淀粉吸水膨胀，细胞壁破裂，淀粉由颗粒变为溶解状态的糊液，适于 -淀粉酶将其转变为低分子的糊精、低聚糖、双糖和单糖； 同时借加热粉浆对粉浆灭菌， 以杀灭原料表面所带存的微生物， 防止杂菌生长，保证糖化和发酵的顺利进行。 水热处理的一个附带作用就

172、是对原料的起到一次灭菌作用。原料水热处理操作包括粉浆的制备、-淀粉酶的加用、液化和冷却等。 原料的水热处理传统工艺主要有高温高压处理和常压处理两种方式23。近年来，又出现了很多新的水热处理工艺如喷射液化工艺、无蒸煮工艺等。 1 高温高压处理工艺 高温高压处理工艺，即高温蒸煮工艺，是将粉料加水制成粉浆，在中间桶内加蒸汽预煮后打入耐压容器，再加入蒸汽使粉浆保持数百千帕和 130 以上高温，对粉浆进行的处理。高温高压处理又分为连续处理和间歇处理两种形式，其流程为：粉料加水制浆加汽预煮加汽加压处理冷却糖化。 高温蒸煮工艺对原料处理较为彻底，能较彻底地杀灭原料表面附着的微生物，有利于糖化、发酵的正常进行

173、。但是设备要求高，投资大；蒸汽消耗多，糖的损失多，杂质产生多等。随着科学技术的进步，高效低温酶制剂的广泛应用，该工艺正被常压处理所取代。 2 常压处理工艺 常压处理工艺是粉料加水制成粉浆后，加入 -淀粉酶搅拌均匀，用蒸汽加热至100 的处理工艺。 其流程为： 粉料加水制浆加入 -淀粉酶加热液化冷却糖化。 3 蒸汽喷射液化工艺 低压蒸汽喷射液化工艺早已被应用在淀粉糖、味精、有机酸等工业上，20 世纪90 年代被应用于乙醇行业。喷射液化是利用低压蒸汽喷射液化器来完成淀粉液化的。喷射液化具有连续液化、操作稳定、液化均匀等优点，而且由于低压蒸汽喷射液化器采用以料带汽的方式进行喷射液化，因此对蒸汽压力要

174、求低，节省蒸汽，而且加热均匀。喷射液化工艺流程为：粉料加水、淀粉酶制浆喷射液化器保温液化。 4 生料无蒸煮工艺 54 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 乙醇生产过程中，原料的蒸煮液化耗能较大。研究实施生料无蒸煮乙醇生产工艺对降低生产成本、提高经济效益意义重大23,24。目前研究最多的是玉米粉的生料无蒸煮工艺。其工艺流程为原料粉碎调浆糖化发酵蒸馏。 5.5.3 糖化糖化 木薯通过水热处理，成为溶解状态的淀粉、糊精和低聚糖等，不能直接被酵母利用生成乙醇，必须加入一定数量的糖化剂，使溶解的淀粉、糊精和低聚糖等转化为能被酵母利用的可发酵糖。 糖化是将水热处理后醪液中的碳水化合物转化为可发酵糖的过程2

175、5。糖化的效果的好坏主要受糖化酶种类、糖化酶用量、糖化温度、糖化时间和醪液pH的影响。从木薯乙醇发酵的研究资料来看，糖化酶添加量一般控制在 100-200 u/g原料，糖化阶段的温度在 58-62 ，糖化时间控制在 30-60 min26。 5.5.4 乙醇发酵乙醇发酵 目前木薯乙醇发酵工艺主要有分别水解发酵工艺， 同步水解、发酵工艺，固定化细胞发酵工艺， 生淀粉发酵工艺等。 分别水解发酵工艺(SHF) SHF 法的工艺特点是糖化和发酵分别在不同的反应器中进行。当前木薯原料发酵生产乙醇普遍采用的是 SHF 模式，SHF 模式发酵速度较慢，一方面是由于发酵初期高的葡萄糖浓度对酵母发酵产生抑制，另

176、一方面即使 SHF 模式中也存在后糖化过程，酵母自身不能利用淀粉，发酵结束除了取决于酵母利用葡萄糖的速度，还取决于发酵后期糖化酶的后糖化速度。 同步水解、发酵工艺 同步水解、发酵工艺即同步糖化发酵法。20 世纪 70 年代，一些学者在研究纤维素发酵转化乙醇的过程中，为了防止糖积累和最终产物抑制，从而提高纤维素酶的催化水解效率，提出了同步糖化发酵(SSF)模式，受到了广泛的重视，目前在多种原料上很多学者都进行了大量研究27-30。采用SSF模式发酵淀粉原料生产乙醇，省略了糖化工段，能耗降低；糖化和发酵在同一个反应器中进行，设备投资省；另外糖化和发酵同时进行，糖化生产的葡萄糖一经产生就被酵母利用，

177、解除了产物抑制，保持了糖化酶的活性， 有利于防止染菌31。 刘振等对木薯干原料同步糖化发酵生产乙醇的各影响条件进行研究，得出最优的工艺条件：原料粉碎粒度 0.45 mm，加水比 2.8，100 55硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 下蒸煮 30 min，-淀粉酶、糖化酶的添加量分别为 10、180 u/g，30 下发酵 48 h乙醇浓度约 11%(w/w)32。 固定化细胞发酵工艺 固定化细胞发酵具有能使发酵罐内细胞浓度提高，细胞可连续使用，使最终发酵液乙醇浓度得以提高。在游离发酵过程中，酵母随着醪液流出，造成酵母细胞迅速降低，发酵速度变慢。人们从固定化酶技术得到启发

178、，使酵母一直停留在发酵罐中，保持高的反应速度。常用的方法有吸附、包埋、交联等，可用的固定载体多种多样，常用的载体有海藻酸钠、卡拉胶、多孔玻璃等。赵玲等以海藻酸钠为载体进行了固定化酵母流化床生物反应器木薯淀粉乙醇的间歇发酵试验，得出发酵醪初糖浓度为15%-17%，经过 9 h的发酵，发酵醪乙醇含量达到 9.3%-9.6%(v/v)，乙醇收率为87.35%-92.27%,反应器的乙醇生产能力为 5.71-5.90 g/L/h，与常规的生产工艺相比极大地缩短发酵时间，提高生产强度 2-3 倍33。李魁采用聚乙烯(PVA)为载体共固定化酵母菌细胞和糖化酶制剂，以木薯糖化醪为发酵底物在共固定化生物反应器

179、中，控制发酵温度 30 ， 在糖化醪流加速率为 9 mL/h， 停留时间 3.1 h和稀释速率为 0.155 h-1条件下进行乙醇连续发酵，成熟发酵醪液残余总糖和残余还原糖含量均较低，游离细胞数较常规发酵低 1 个数量级以上，总糖利用率高达 96.91%34。Veera等将运动发酵单胞菌和淀粉葡萄糖苷酶共固定化，当淀粉浓度为 150 g/L时，最大乙醇产量为 55.3 g/L35。 利用某些具有强自身絮凝能力的菌株形成颗粒， 以此作为一种固定化细胞的方法被称为无载体细胞固定化技术36，与通常的载体固定化方法相比，它具有如下优点：a 固定化操作方法简单， 无载体附加费， 不消耗任何辅助材料， 颗

180、粒制备成本低； b 与载体固定颗粒相比， 细胞颗粒内部传质阻力小， 有利于维持细胞的活性和发酵的进行；c 反应器中菌体浓度高，可获得很高的生产强度。马悦等以一株粟酒裂殖酵母变异株(Schizosacharomyces pombe)在悬浮生物反应器内进行了以木薯淀粉糖化液为发酵底物的乙醇清液连续发酵研究，得出了二级连续发酵系统可明显改善一级系统的不足，并取得了平均流加糖液浓度 150 g/L， 发酵强度为 9.7 g/L.h， 流出液乙醇浓度 72.7 g/L，残糖浓度 3.74 g/L，总糖利用率 90%的较好结果，并且整个系统在连续一个月的运行中从未发现染菌现象，发酵操作稳定37。 生淀粉发

181、酵工艺 生料发酵就是指原料不用蒸煮，糊化直接将生料淀粉进行糖化和发酵，生料发酵56 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 在酿酒上已得到广泛应用38，生产实践表明，与传统的酿酒方法相比：能耗低，生料酿酒可节约能源 50%；成本低，降低成本 37%；改善劳动条件，降低劳动强度 30%左右；出率高，能提高出酒率 20%-30%等优点，但以生料发酵在木薯乙醇生产中的研究比较少见。Seiuosuke Ueda等人报道了用木薯制乙醇的试验方法，Asp.aw amoriNRRL3l12 和Asp.niger菌种在麸皮上于 30 培养 3 d制成淀粉酶，将粉碎的木薯浆和淀粉酶、酵母混合，在pH 3.5，30

182、下发酵 5 d，生木薯的乙醇产量是理论值的 82%-99%39。Mikuni等从Chalara paradoxa中发现了新的生淀粉糖化酶，并确定了最佳的生料发酵条件，发酵时间需要 5 d40。李志平以木薯为原料，通过单因素试验、正交试验研究了生淀粉直接发酵生产乙醇的最佳发酵条件，发酵 4d乙醇浓度成为7.04%(v/v)，发酵率为 78.38%41。Mural等利用基因的手段把米根霉中糖化酶的基因导入酵母中，利用这样构建的酵母可直接进行生料发酵42。 5.6 燃料乙醇发展中存在的问题及对策燃料乙醇发展中存在的问题及对策 随着国民经济的进一步发展，整个社会对燃料乙醇的需求量越来越大，但当前的乙醇

183、生产普遍存在着问题。主要包括： 发酵液乙醇浓度低。发酵浓度低不仅影响了设备利用率，而且增加蒸馏能耗。 能耗高。乙醇生产过程特别是蒸煮和蒸馏过程能耗高。 原料问题。我国是人口大国，利用玉米、小麦等粮食做原料必将影响我国的粮食安全。酒糟的处理问题。每生产一吨乙醇要产生 1215 吨酒糟，且废液中 COD 指标高，直接排放会造成严重的环境污染。有效的解决酒糟的再利用问题不仅关系到环保，而且关系到企业的经济效益。 针对以上存在的问题，我国和世界各国的学者都进行了大量的研究，在新菌种、新工艺、新思路等方面取得了一定的进展。主要包括现： (1)实现高浓度乙醇发酵提高乙醇发酵浓度。高发酵强度乙醇发展新工艺目

184、前已取得了很大进步。在菌种选育方面，Bertolini MC等从巴西酒精厂分离出的耐渗透压酵母菌株，发酵后乙醇浓度达 19%43。毛志群等用含高浓度乙醇选择性培养基从自然界中分析筛选到一株高产乙醇酵母菌株SP-48，经 72 h发酵可得到 16.2%乙醇44。Ernandes等分离到了许多抗酒精酵母菌， 可以产生大约 20%(V/V)的乙醇45。 在高浓度乙醇发酵工艺上也取得了一定的成绩。黄宇彤等提出了一种在玉米粉糊化点前(60 )，加入 10 U/g的液化酶预处理 20 min，可降低峰值粘度和峰值粘度持续时间，并且可以防止淀粉糊的老化回生46。Thomas等报道了一种液化、糖化工艺，发酵超

185、浓醪小麦淀粉 175 h乙醇浓度达到 21%47。 57硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 (2) 在节能方面，主要应放在无蒸煮工艺和乙醇节能回收技术的研究上，将能耗尽可能的降低。目前研究的生料淀粉发酵工艺可以在一定程度上降低生产能耗，但是发酵周期太长，还有待于进一步研究。 (3) 寻找廉价原料，研究乙醇生产的新工艺。生产燃料乙醇的原料不仅可以是淀粉质原料、糖质原料，还可以是自然界大量存在的廉价的纤维素48。解决发酵乙醇原料的根本出路在于利用纤维素(包括纤维素、半纤维素等)来替代粮食原料。但是以植物纤维素为原料生产燃料乙醇工艺中还存在很多亟带解决的技术难题。 纤维素预处

186、理成本高，水解困难就是一个难点之一，因此改进纤维素酶的活性和研究高效低成本的纤维素水解方法是今后的一个研究方向。 (4) 酒糟处理的指导思想应该是将酒糟当作一个有用的原料来处理，要将生产 SCP、燃料、饲料、肥料或者其他生物制剂与酒糟的处理结合起来，并在工艺处理中消除污染源，达到排放标准。 58 第五章 综述 燃料乙醇发酵研究进展 参考文献 1 马赞华. 酒精高效清洁生产新工艺Ml. 北京:化学工业出版社.2003,115. 2 M.F. Demirbas, Mustafa Balat. Recent advances on the production and utilization tre

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204、ew ethanol-tolerant yeasts for fuel ethanol production from sucroseJ. Biotechnology Letters,1990,12(6): 463468. 44 毛志群, 张伟, 檀建新, 袁耀武, 李英军. 燃料乙醇用高产酒精酵母的筛选及鉴定J. 酿酒，2003,30(3):3537 45 J.R.Ernandes and M.Matulionis. Isolation of new ethanol-tolerant yeasts for Fuel ethanol production from sucroseJ. Biot

205、echnol Lett, 1990(12): 463 468. 61硕士学位论文 酿酒酵母和运动发酵单胞菌木薯乙醇发酵条件研究 46 黄宇彤， 孙智谋等. 对高浓度玉米原料糊化液化粘度的研究J. 食品与发酵工业, 2001, 27(6):2124. 47 Thomas.K.C., Ingledew.W.M. Fuel alcohol production: effects of free amino nitrogen on fermentation of very-high-gravity wheat mashesJ. Appl.Envion. Microbiol, 1990(56): 204

206、6 2050. 48 Sun Y, Cheng JY.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a reviewJ.Bioresource Technology, 2002, 83(1):111. 62 附 录 附 录 Api ZYM 检测酶的读表 RESULT No. ENZYME ASSAYED FOR SUBSTRATE PHPOSITIVE NEGATIVE1 Control Colorless or color of the sample if it has an intense coloratio

207、n 2 Alkaline phosphatase 2-naphthyl phosphate 8.5Violet 3 Esterase (C4) 2-naphthyl butyrate 6.5Violet 4 Esterase Lipase (C8) 2-naphthyl caprylate 7.5Violet 5 Lipase (C14) 2-naphthyl myristate 7.5Violet 6 Leucine arylamidase L-leucyl-2-naphthylamide 7.5Orange 7 Valine arylamidase L-valyl-2- naphthyla

208、mide 7.5Orange 8 Cystine arylamidase L-cystyl-2-naphthylamide 7.5Orange 9 Trypsin N-benzoyl-DL-arginine-2- naphthylamide 8.5Orange 10 -chymotrypsin N-glutaryl-phenylalanine-2- naphthylamide 7.5Orange 11 Acid phosphatase 2-naphthyl phosphate 5.4Violet 12 Naphthol-AS-BI- phosphohydrolase Naphthol-AS-B

209、I-phosphate 5.4Blue 13 -galactosidase 6-Br-2-naphthyl-D- galactopyranoside 5.4Violet 14 -galactosidase 2-naphthyl-D-galactopyranoside 5.4Violet 15 -glucurondase Naphthol-AS-BI-D-glucuronide 5.4Blue 16 -glucosidase 2-naphthyl-D-glucopyranoside 5.4Violet 17 - glucosidase 6-Br-2-naphthyl-D- glucopyrano

210、side 5.4Violet 18 N-acetyl- glucosaminidase 1-naphthyl-N-acetyl-D- glucosaminide 5.4Brown 19 -mannosidase 6-Br-2-naphthyl-D-mannopyranoside5.4Violet 20 -fucosidase 2-naphthyl-L-fucopyranoside 5.4Violet Colorless Or Very pale yellow 63发表文章 发表文章发表文章 周玲玲，赵海，甘明哲，靳艳玲，申乃坤，戚天胜. 运动发酵单胞菌 232B 木薯快速乙醇发酵. 太阳能学报

211、. (已接收)64 致 谢 致致 谢谢 时光飞逝，三年的求学生涯就要结束，我将踏上人生的又一个新的旅程。值此论文完成之际，我真诚地向恩师赵海研究员表达最真挚的谢意和祝福！本论文是在导师赵海老师的精心指导下完成的，从论文的选题、研究方案的设计到论文的写作等各个环节都凝聚着老师大量的心血。赵老师知识渊博，科学思维敏捷，严谨治学，亲切待人，不仅教授专业知识，培养良好的科研作风，更以其丰富的人生经历影响了我，使我学到了许多为人处事的道理和态度。赵老师对生活的乐观、治学态度的严谨和忘我的工作精神深刻地影响、 感染了我， 使我受益匪浅， 引导我在人生的道路上克服困难，不断进取。 感谢课题组的吕发康、戚天胜等老师在工作和生活上给予了极大的帮助和关心。感谢本实验室的同学靳艳玲、甘明哲、申乃坤、薛慧玲、李科、付洁等同学在实验和生活上给予了热情的帮助和关心，难忘和你们相处两年来的点点滴滴。 感谢李安明老师以及生物所人教处所有的老师给予我的关心和帮助。感谢刘莉、孙荣勋等在读同窗在求学的道路上给我的鼓励和慰藉。祝大家生活快乐、前程似锦。 最后感谢我的家人多年在物质上和精神上给我的关心和支持， 他们是我求学路上最坚强的后盾，是我前进的动力，我成长路上的每一个进步，每一次成功都离不开他们的支持。 谨以此文献给我的导师、同学、朋友和家人！祝你们幸福安康、万事如意！ 周玲玲 2008 年 5 月 65