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1、L/O/G/OL/O/G/O氧化应激与衰老及氧化应激相关检测方氧化应激与衰老及氧化应激相关检测方法法 1 1、氧化应激的概念与产生2、氧化应激与自由基的联系3、衰老的概念以及特征5、氧化应激的相关检测方法4、氧化应激与衰老的关联1、氧化应激的概念与产生氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。概概 念：念：氧化应激的产生 氧化应激的产生既有内部也有外部的 外因 内因 包括慢性
2、或急性感染，还有血糖调节方面存在的问题。 包括接触环境污染、石化制品或重金属； 氧化应激的出现还与生活方式有关，如吸烟、喝酒、运动过度、服用药物，还有进食过量。特别要注意的是，日晒（紫外线辐射）过多也会引起氧化应激。 营养物质的缺乏也会导致氧化应激。如果我们缺硒，或者体内的维生素E、维生素A或其他关键性抗氧化剂含量不足，那么就无法给自身提供维护抗氧化系统正常工作的必要因素。体重超重也有危害，脂肪组织制造发炎分子，从而导致氧化应激。 2、氧化应激与自由基的联系 氧化应激是指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。
3、ROS有超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（ONOO-）等等。2.1自由基的危害与作用 危害：危害： 它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病-最主要的危险因子，是人类健康的大敌！作用：生物氧化，氧化还原反应是人体最基本的生化反应，氧化应激亦是人体一种最基本的保护机制。在我们体内，每一个细胞一天要产生2.5X1011个分子的ROS，人体内每天可产生4X1021个分子的
4、自由基。它们不仅为我们提供和传递为维持生命活动的能量，帮助我们消灭细菌和病原体，清除体内的毒素和“垃圾”。所以氧化应激和自由基亦是我们的朋友我们人体不能没有，也不能“消灭”它！2.2简述抗氧化系统中一些简单的自由基清除剂及产物（1）超氧化歧化酶（SOD） SOD它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因为自由基造成的对细胞伤害。(2)过氧化氢酶（CAT） CAT它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，因为H2O2会与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH。(3)谷胱甘肽过氧化酶（GSHPx）GSH-Px它为生物体中
5、清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶以保护细胞膜结构和功能完整性的作用。（4）丙二醛（MDA）MDA是自由基发生反应的产物，促进机体衰老。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，这回会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性 。3、衰老的概念衰老的概念以及特征以及特征3.1衰老的概念 在人的生命周期中，有一个随着时间推移而表现出机体器官机能不断退化，直至死亡的过程，这个过程在医学老年学中被称之为衰老（senility）。 衰老衰老(aging)：与年龄相关的机体的形态、结构和生理功能的逐渐退化的总现象。3.2衰老的基本特征 衰老是一个过程，它可以追溯到卵子
6、未受精以前。可以说从生命的开始就同时意味着老化或衰老的开始。 早在1962年，美国老年学家Strehler就提出了衰老过程的四个标准，即普遍性、内因性、进行性和有害性。经过几十年的研究，人们逐渐总结了衰老的几个基本特征： 衰老的认识衰老的认识指某种衰老现象必须能在一个种类的所有个体中看到。现已证明，衰老过程在多细胞生物中是普遍存在的。 衰老变化是由自身的内部因素引起的，是生物机体必然的内在性退变过程。衰老变化一旦发生，常常是不可逆转的。 衰老是随着时间的推移而不断深化与发展的过程，即衰老在生物体内是逐步积累加重的。1普遍性普遍性 2内因性内因性 3累积性累积性 衰老导致体内出现有害的改变，使机
7、体适应能力和抵抗能力减退、功能下降直至丧失，最终死亡。 生物的衰老过程是可以预测的。一般超过65岁的老人，约有30%出现各种生理功能减退。这种生理功能减退情况在平时可以处于平衡状态，一旦遇到感染、外伤，以及各种内外环境改变的影响，可因适应性不全而危及生命安全。老年人进入80岁以后，各方面生理功能减退更明显。 4危害性危害性 5可预计性可预计性 人體器官衰老退化時間表p大腦：20歲開始衰老 到了40歲，神經細胞的數量開始以每天 1萬個的速度遞減，從而對記憶力、協調性及大腦功能造成影響。p 腸：從55歲開始衰老 步入55歲後開始大幅減少。結果人體消化功能下降，腸道疾病風險增大。消化液流動開始下降，
8、發生便秘的幾率便會增大。 p乳房：從35歲開始衰老 女人到了35歲，乳房的組織和脂肪開始喪失，大小和豐滿度因此下降。從40歲起，女人乳房開始下垂，乳暈急劇收縮。控制細胞生長的基因可能發生變異，進而引發癌症。 p肺：從20歲開始衰老 肺活量從20歲起開始緩慢下降，70歲次呼吸(約合473毫升)約只有卅歲的半。聲音：從聲音：從6565歲開始衰老歲開始衰老 女人的聲音變得越來越沙啞，音質越來越低，而男人的聲音越來越弱，音質越來越高。眼睛：從眼睛：從4040歲開始衰老歲開始衰老 隨著視力下降，隨著年齡的增長，眼部肌肉變得越來越無力，眼睛的聚焦能力開始下降。 心臟：從心臟：從4040歲開始老化歲開始老化
9、 因為血管逐漸失去彈性，動脈也可能變硬或者變得阻塞，之後輸送到心臟的血液減少，引起心絞痛。肝臟：肝臟：7070歲開始老化歲開始老化 肝臟似乎是體內唯一能挑戰老化進程的器官。腎：腎：5050歲開始老化歲開始老化 腎過濾量從50歲開始減少，腎過濾量減少的後果是，人失去了夜間憋尿功能，需要多次跑衛生間。75歲老人的腎過濾血量是30歲壯年的一半。 p前列腺：50歲開始老化 40歲以下男子很少患前列腺增生。前列腺吸收大量睪丸激素會加快前列腺細胞的生長，引起前列腺增生。p骨骼：35歲開始老化 35歲骨質開始流失，進入自然老化過程。絕經後女性的骨質流失更快，可能會導致骨質疏鬆。骨骼大小和密度的縮減可能會導致
10、身高降低。椎骨中間的骨骼會萎縮或者碎裂。p牙齒：40歲開始老化 40歲變老的時候唾液的分泌量會減少。唾液可衝走細菌，唾液減少，我們的牙齒和牙齦更易腐爛。牙周的牙齦組織流失後，牙齦會萎縮。 p肌肉：30歲開始老化 肌肉一直在生長，衰竭；再生長，再衰竭。年輕人這一過程的平衡性保持很好。但是，30歲以後，肌肉衰竭速度大於生長速度。過了40歲，人們的肌肉開始以每年0.5% 到2%的速度減少。經常鍛煉可能有助於預防肌肉老化。 p聽力：在55歲左右開始老化 60多歲半數以上的人會因為老化導致聽力受損。這叫老年性耳聾，是因毛髮細胞的缺失導致，內耳的毛髮感官細胞可接受聲振動，並將聲振動傳給大腦。 皮膚：25歲
11、左右開始老化 皮膚在25歲左右開始自然衰老。死皮細胞不會很快脫落，生成的新皮細胞的量可能會略微減少。從而帶來細紋和薄而透明的皮膚。 味覺和嗅覺：60歲開始退化 我們一生中最初舌頭上分布有大約10000個味蕾。到老了之後這個數可能要減半。味覺和嗅覺逐漸衰退，部分是正常衰老過程的結果。 生育能力：35歲開始衰退 女性生育能力到35歲以後開始衰退。子宮內膜可能會變薄，使得受精卵難以著床，也造成了一種抵抗精子的環境。男性的生育能力也在這個年齡開始下降。 頭髮：30歲開始脫落 從32歲左右睪丸激素水平的改變影響了這一周期，導致毛囊收縮。每一根新頭發都比先前的那根細。記憶力減退性功能減退夜尿頻畏寒易疲勞,
12、難恢復耳鳴眩暈視力退化葡萄糖代謝異常脂肪代謝異常.等等老老化化的的症症狀狀4、氧化应激与衰老的关联 氧化应激的概念最早源于人类对衰老的认识。1956年英国学者Harmna首次提出自由基衰老学说,该学说认为自由基(Free radical)攻击生命大分子造成组织细胞损伤,是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。1990年美国衰老研究权威Sohal教授指出了自由基衰老学说的种种缺陷,并首先提出了氧化应激的概念。 4.1氧化应激与人体衰老 依靠氧气，我们的身体才焕发出勃勃生机。我们吸入氧气，用它来燃烧燃料（消耗食物）并制造能量。但是，细胞使用氧气时会产生副产品以高能氧气分子形式存
13、在的废物。这些反应性氧气分子有一个名字，叫自由基。 自由基会对人体组织和细胞结构造成损害，主要是因为自由基中的不配对电子攻击人体内其他物质的分子，从而进行配对，引起器官功能衰退，进而导致衰老现象的发生。 大部分与老化有关的健康问题，如皱纹、心脏病和阿尔兹海默症，都与体内氧化应激过大有关。正如美国加州大学伯克利分校的邓汉姆哈尔蒙博士指出的那样：“很少有人能活到他们潜在的最大寿命。他们往往提早死于各种疾病，其中很大一部分是自由基引发的。”尽管哈尔蒙博士的研究成果已经是半个世纪以前的事了，人们却直到最近才对他的理念有所了解。 事实上，人体几乎所有的器官都很容易受到氧化应激带来的伤害，症状表现不计其数
14、，如疲倦、全身无力、肌肉和关节痛、消化不良、焦虑、抑郁、皮肤瘙痒、头痛，以及注意力难以集中和感染难以痊愈等。4.2抗氧化应激抗氧化剂可以减缓氧化应激带来的危害。改变饮食结构，调整生活方式，补充营养物质及接受其他进补治疗。比如，多吃水果和蔬菜，因为它们含有多种抗氧化物质，如维生素C、维生素E和-胡萝卜素，以及类黄酮和其他高效化学物质。红葡萄酒，蔬菜、茶叶、豆制品以及可可豆、巧克力这一类食品 美国学者在实验室里培育出了一种长寿命的线虫，寿命比同类延长了70%。有研究发现，果蝇体内有数百个基因与寿命的长短有关系。从线虫和果蝇的研究结果来看，长寿物种常伴有丰富的超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（H
15、2O2）。 4.3抗衰老的基因 研究表明，研究表明，B细胞淋巴瘤白血细胞淋巴瘤白血病病-2（Bcl-2）基因是多细胞动物中普）基因是多细胞动物中普遍存在的遍存在的“长寿基因长寿基因”，如神经元寿命较，如神经元寿命较长，长，Bcl-2的表达高于其他类型的细胞。的表达高于其他类型的细胞。原因呢？通过检测人体各种细通过检测人体各种细胞中胞中Bcl-2Bcl-2的表达情况的表达情况发现，发现，Bcl-2Bcl-2的表达与的表达与细胞的寿命呈正相关。细胞的寿命呈正相关。 Bcl-2Bcl-2能阻止缺乏线粒体能阻止缺乏线粒体DNADNA的细胞凋的细胞凋亡，而亡，而Bcl-2Bcl-2抗细胞凋亡效应不依赖于
16、呼抗细胞凋亡效应不依赖于呼吸链。吸链。 Bcl-2Bcl-2基因的表达还可以挽救许多基因的表达还可以挽救许多受到刺激而必然死亡的细胞，因而认为受到刺激而必然死亡的细胞，因而认为Bcl-2Bcl-2是死亡的闸门。是死亡的闸门。5.1抗氧化酶类的检测5.2脂质过氧化损伤的测定5.3蛋白质氧化损伤的检测5.4氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测5.氧化应激的相关检测方法：5.15.1抗氧化酶类的检测抗氧化酶类的检测5.1.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 SOD活力的高低与自由基、低密度脂蛋白的氧化损伤有着密切的联系,测定SOD的活力可间接反应组织细胞抗氧化损伤、机体清除自由基的能力。SOD体外活性测
17、定方法有直接法和间接法,包括电泳法、免疫法、ESR法、化学发光法、脉冲辐解法、紫外分光光度计法等。5.1.2 谷胱甘肽过氧化物酶的测定 谷胱甘肽过氧化物酶催化GSH氧化生成GSSG,用掉一个过氧化氢。在氧化应激条件下,细胞中过氧化氢浓度明显减少,因此测定GSH过氧化物酶的活力可以作为衡量细胞抗氧化水平的一项生化指标。可采用紫外分光光度计法、分光光度法或者酶联免疫吸附法等进行测定。5.1.3 5.1.3 过氧化氢酶的测定过氧化氢酶的测定 过氧化氢酶作用于过氧化氢的机制实质上是过氧化氢的歧化,必须有两个过氢化氢先后与过氧化氢酶相遇且碰撞在活性中心上,才能发生反应。过氧化氢浓度越高,分解速度越快。一
18、般也采用紫外分光光度法对其进行检测。5.25.2脂质过氧化损伤的测定脂质过氧化损伤的测定 ROS攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化,如醛基丙二醛、酮基、羟基氢过氧基以及新的氧自由基等。丙二醛会引起细胞损伤，因而测定丙二醛的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出细胞损伤的程度。常用硫代巴比妥酸法来测定丙二醛含量,此法是应用最多也是最古老的方法，但我们采用试剂盒检测。5.35.3蛋白质氧化损伤的检测蛋白质氧化损伤的检测 蛋白质的氧化损伤不仅包括对酶、受体和载体蛋白的损伤,而且还包括一些二次损伤,如DNA修复酶的损伤。目前,蛋白质氧化使用最广的生物标志物是
19、蛋白质羰基含量，其传统的检测技术是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶免疫吸附法测定2, 4-二硝基苯肼与蛋白质羰基反应生成的腙,来衡量蛋白质的损伤情况。一般我们采用Western blotting或者RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）来分析蛋白质含量以及蛋白表达情况。5.45.4氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测5.4.1 Bcl-2基因的检测 Bcl-2蛋白的上调表达可以对抗细胞的凋亡,在ROS诱导细胞凋亡的调节中,Bcl-2发挥了重要作用，Bcl-2可以减少氧自由基的产生。Bcl-2的过度表达能阻抑多种凋亡相关基因的表达。测定方法主要有印迹杂交和实时荧光定量法对它进行检测。随着近年来荧光定量聚合酶链反应术的发展,用定量聚合酶链反应技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。5.4.2 p535.4.2 p53基因的检测基因的检测p53基因属抑癌基因,是细胞生长周期中负调节因子,与细胞周期的调控、DNA的修复、细胞分化、细胞凋亡等功能相关。氧化应激导致细胞DNA损伤的过程必须有p53参与。常采用免疫组织化学、原位杂交等方法来检测。数据分析数据分析数据统计分析数据用平均数标准差表示，应用SPSS12.0统计软件对所测得各项数据进行数据描述、t检验、方差分析等统计分析，统计显著性水平设为P0.05。 谢谢！
