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1、第一章 实验室基本技术华华中中农农业业大大学学生生命命科科学学技技术术学学院院细细 胞胞 工工 程程 电电 子子 课课 件件实验室设置实验室设置基本技术基本技术培养基及其配制培养基及其配制细胞培养环境控制细胞培养环境控制外植体接种培养外植体接种培养 主要内容主要内容1.1实实验验室室设设置置实验室组成实验室组成基本设备配置基本设备配置培养容器与用具培养容器与用具细胞工程实验室的基本要求细胞工程实验室的基本要求实验准备实验准备 包括培养基配制，包括培养基配制， 洗涤与灭菌等洗涤与灭菌等无菌操作无菌操作控制培养控制培养Culture roomCulture roomPreparation Prep
2、aration roomroomSteriliSterili- - zing roomzing roomS St te er ri il le e o op pe er ra at ti io on nCytology Cytology roomroomTransiTransi- - tiontion area area实验室布局示意图实验室布局示意图基基本本实实验验室室准准备备室室 准准备备室室的的功功能能就就是是进进行行一一切切与与实实验验有有关关的的准准备备工工作作。要要求求宽宽敞敞明明亮亮，通通风风条件好。条件好。 培培养养室室 培培养养室室的的功功能能是是对对离离体体材材料料进进行行
3、控控制制培培养养。其其首首要要要要求求是是要要能能控控制制光光照照和和温温度度，其其次次为为防防止止微微生生物物感感染染，培培养养室室应应保持干燥和清洁。保持干燥和清洁。 接接种种室室 接接种种室室的的功功能能是是进进行行无无菌菌操操作作。要要求求封封闭闭性性好好，干干燥燥清清洁洁，能能较较长长时时间间保保持持无无菌菌。为为了了保保持持清清洁洁，接接种种室室应应防防止止空空气对流。气对流。辅辅 助助 实实 验验 室室细细胞胞学学实实验验室室 其其功功能能是是对对培培养养材材料料进进行行细细胞胞学学鉴鉴定定和和研研究究。要要求求清清洁洁、明明亮亮、干干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。燥，使
4、各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。行取样检查。 摄摄影影室室及及暗暗室室 其其功功能能是是进进行行培培养养材材料料的的摄摄影影记记录录和和胶胶片片冲冲印印。在在有有条条件件的的情情况况下下可建立此实验室。可建立此实验室。 基本设备配置基本设备配置基本设备基本设备灭菌设备灭菌设备光照培养室与设备光照培养室与设备无菌操作设备无菌操作设备细胞学鉴定设备细胞学鉴定设备培养容器与用
5、具培养容器与用具1.2 基本技术基本技术洗涤技术洗涤技术灭菌技术灭菌技术洗 涤 剂合成洗涤剂合成洗涤剂铬酸洗涤液铬酸洗涤液 常用的铬酸洗涤液配方常用的铬酸洗涤液配方 成成 分分 强酸溶液强酸溶液 中酸溶中酸溶液液 弱酸溶液弱酸溶液 重铬酸钾重铬酸钾 (g) (g) 63 63 120120 100 100 硫硫 酸酸(ml)(ml) 1000 1000 200200 100 100 蒸蒸 馏馏 水水(ml) (ml) 200 200 200200 1000 1000 注意事项注意事项 在在蒸蒸馏馏水水中中缓缓慢慢加加入入浓浓硫硫酸酸，加加热热的的同同时时分分次次加加入入磨磨碎碎的的重铬酸钾至其
6、完全融解。重铬酸钾至其完全融解。 重重铬铬酸酸钾钾加加蒸蒸馏馏水水后后加加热热溶溶化化，冷冷却却后后再再缓慢加入浓硫酸。缓慢加入浓硫酸。 玻璃器皿洗涤玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿、已使用过的试新的玻璃器皿、已使用过的试管、烧杯、三角瓶管、烧杯、三角瓶 、吸管、滴管等内径狭小的玻、吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品。璃制品。 塑料用品洗涤塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，液洗涤
7、， 需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。焰干燥。 培养基培养基湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。 玻璃器皿玻璃器皿湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至热至1504015040minmin，或或12021202h h。 金属器皿金属器皿干热灭菌。干热灭菌。 接种室接种室接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每醛加高锰酸钾，一般每100100mlml甲醛加甲醛加5 5g g高锰酸钾。高锰酸钾。 培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积与灭菌时间的关系培养基
8、体积培养基体积 （mlml）灭菌温度灭菌温度 （） 灭菌时间灭菌时间（min.min.） 20205050 121 121 20 20 5050500500 121 121 25 25 50050050005000 125 125 35 35 1.3 培养基及其配制培养基及其配制 植物细胞培养基及其配制植物细胞培养基及其配制动物细胞培养基及其配制动物细胞培养基及其配制 植物细胞培养基及配制培养基基本成分培养基基本成分培养基配方培养基配方培养基配制培养基配制无 机 盐 类大量元素大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括升几十至几千毫克。
9、大量元素包括C C、H H、O O、N N、P, KP, K、CaCa、MgMg、 S S。 微量元素微量元素 微量元素的用量一般低于微量元素的用量一般低于1010-5-51010-7-7克分子浓度。植物所需的微量元素有克分子浓度。植物所需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、 MoMo、MnMn、CoCo。 有 机 成 分糖糖 维生素维生素 肌醇肌醇 氨基酸氨基酸 其它其它 植 物 激 素生长素生长素 细胞分裂素细胞分裂素其它其它其它附加成分琼脂琼脂 活性炭活性炭 附加复合成分附加复合成分 常用培养基配方常用培养基配方：常用培养基配方： MS（MurashingandSkoog,
10、1962）White（White,1934）B5(Gamboretal,1968)N6(朱至青，朱至青，1974)培 养 基 配 制 大量元素配制成大量元素配制成10-20 10-20 的母液的母液 微量元素配制成微量元素配制成100-200 100-200 的母液的母液 激素单独配制成激素单独配制成mg/mlmg/ml的母液的母液 培养用培养基按需要按比例加入培养用培养基按需要按比例加入动物细胞培养基及配制动物细胞培养的营养需求特点动物细胞培养的营养需求特点培养基配方及培养基选择培养基配方及培养基选择培养基配制培养基配制动物细胞培养液的成分及性质氨基酸类氨基酸类（1 1）必需氨基酸）必需氨基
11、酸IleIle、LeuLeu、LysLys、MetMet、PhePhe、ThrThr、CysCys、SerSer等等（2 2）非必需氨基酸）非必需氨基酸维生素类维生素类盐类盐类葡萄糖葡萄糖缓冲系统缓冲系统大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。HEPEsHEPEs现被广泛使用，常用浓度为现被广泛使用，常用浓度为25mmol/L25mmol/L。矿物类矿物类有机补充物如核苷类、有机补充物如核苷类、TCATCA中间产物、丙酮中间产物、丙酮酸盐、类脂化合物等。酸盐、类脂化合物等。激素类如激素类如insulininsulin、生长激素、氢化可的松生长激素、氢化可的松等。等。生长
12、因子类如血小板衍生出来的生长因子生长因子类如血小板衍生出来的生长因子（PDGFPDGF）、）、成纤维细胞生长因子（成纤维细胞生长因子（FGFFGF）、）、表表皮生长因子（皮生长因子（EGFEGF）、）、内皮生长因子及增殖刺内皮生长因子及增殖刺激活性因子（激活性因子（MsAMsA）等。等。培养基配方及培养基选择平衡液溶液（平衡液溶液（BSSBSS）天然培养液天然培养液合成培养液合成培养液无血清培养基无血清培养基其他常用液其他常用液RingerPBSTyrodeEarleHanksDulbeccoD-hanksNaCl9.008.008.006.808.008.008.00KCl0.420.200
13、.200.400.400.200.40CaCl20.250.200.200.140.10MgCl2.6H2O0.100.10MgSO4.7H2O0.200.20Na2HPO4.H2O1.560.060.06NaH2PO4.2H2O0.050.141.42KH2PO40.200.060.200.06NaHCO31.002.200.350.35葡萄糖葡萄糖1.001.001.00酚红酚红0.020.020.02表表1几种常用的几种常用的BSS（g/L）天然培养液血浆血浆血清血清胚胎浸出液胚胎浸出液鼠尾胶原鼠尾胶原合成培养液人工方法模拟合成人工方法模拟合成如如TC199TC199、MEMMEM、RP
14、M-1640RPM-1640、DMEMDMEM、Hams F12Hams F12等。等。主要成分是氨基酸、主要成分是氨基酸、vitaminvitamin、碳水化合物、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质等。无机盐和其他一些辅助物质等。无血清培养基包括基础培养基和附加成分。包括基础培养基和附加成分。基础培养基：一般用人工合成的培养液，常用基础培养基：一般用人工合成的培养液，常用Ham F12Ham F12和和DMEMDMEM，1 1：1 1混合，加含混合，加含15mmol/L 15mmol/L HEPEsHEPEs的的1.2g/L NaHCO1.2g/L NaHCO3 3作基础培养液。作基础培养
15、液。附加成分：附加成分：v培养基质培养基质（纤维连结素、多聚物、胶原等。）（纤维连结素、多聚物、胶原等。）v营养成分营养成分（转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、生长因子等）（转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、生长因子等）v酶抑制剂酶抑制剂（ 0.1%0.1%0.5%0.5%大豆胰酶抑制剂）大豆胰酶抑制剂）其他常用液消化液消化液1.1.胰蛋白酶液胰蛋白酶液适适用用于于消消化化细细胞胞间间质质较较少少的的组组织织，常常用用浓浓度度0.25%0.25%、0.125%0.125%，T T：37370 0C C或室温，或室温，pH7.4pH7.4左右。左右。2.Na2.Na2 2EDTAEDTA溶液溶液 3.3.胶原蛋
16、白酶液胶原蛋白酶液pHpH调整液调整液1.NaHCO1.NaHCO3 3液液2.10%HAc2.10%HAc液液3.HEPEs3.HEPEs液液一一种种H H缓缓冲冲剂剂，可可长长时时间间保保持持较较强强的的缓缓冲作用，维持恒定的冲作用，维持恒定的pHpH值。值。200mmol/LGln200mmol/LGln抗菌液抗菌液青霉素、链霉素（双抗）液青霉素、链霉素（双抗）液 卡那霉素液、制霉菌素液卡那霉素液、制霉菌素液肝素抗凝剂肝素抗凝剂培养基配制BSS配制方法配制方法以以Hanks液为例：液为例：1.按配方表准确称量试剂；按配方表准确称量试剂；2.将将CaCl2先溶解在先溶解在100ml水中；水
17、中；3.其它成分依次溶解在其它成分依次溶解在750ml水中；水中；4.用数滴用数滴5.6%NaHCO3溶解酚红；溶解酚红；5.将将2缓慢倒入缓慢倒入3中，搅动；中，搅动；6.将将4加入加入5中；中；7.将将6移入容量瓶中，补足水混匀；移入容量瓶中，补足水混匀；8.分装盐水瓶中，高压灭菌，分装盐水瓶中，高压灭菌，40C冰箱保存。冰箱保存。1.血浆：选用生长血浆：选用生长1年左右的健康雄鸡，年左右的健康雄鸡，从鸡翼血管处抽取血液，在有肝素时离心从鸡翼血管处抽取血液，在有肝素时离心（3000rpm,10min）。）。取上清分装入若干取上清分装入若干小瓶，低温冰箱保存。小瓶，低温冰箱保存。2.血清：血
18、清：从出生从出生1周内的小牛动脉采血，每头小周内的小牛动脉采血，每头小牛放血牛放血15002000ml。取血瓶内预先放置取血瓶内预先放置30ml生理盐水，以便于血凝块和瓶壁的分离。采血生理盐水，以便于血凝块和瓶壁的分离。采血后，血瓶倾斜放置后，血瓶倾斜放置2-4h（室温），待血液充分室温），待血液充分凝结后移入凝结后移入40C冰箱过夜，让血清析出。次日冰箱过夜，让血清析出。次日吸取上清，以吸取上清，以4000rpm离心离心30min，收集血清。收集血清。血清用蔡氏滤器过滤除菌，分装，细菌培养检血清用蔡氏滤器过滤除菌，分装，细菌培养检查无菌后于低温冰箱保存。查无菌后于低温冰箱保存。天然培养基配制
19、方法天然培养基配制方法3.胚胎浸出液：胚胎浸出液：将将911d胚龄的鸡胚磨胚龄的鸡胚磨碎和，加等量缓冲液，离心收集上清，碎和，加等量缓冲液，离心收集上清，即为鸡胚浸出液，于即为鸡胚浸出液，于200C700C保保存。存。1.4 细胞培养环境控制 植物细胞培养环境控制植物细胞培养环境控制动物细胞培养环境控制动物细胞培养环境控制1.4.1 植物细胞培养环境控制光照光照 温度温度pH气体气体温度温度光照包括：光周期、光量和光质三方面。光照包括：光周期、光量和光质三方面。光光量量指指的的是是光光照照强强度度，因因植植物物类类型型不不同同而而异异。离离体体培培养养条条件件下下常常用用的的光光量量一一般般为
20、为10004000lx。光光质质即即是是光光的的波波长长的的影影响响。离离体体培培养养下下一一般般用用白白炽炽荧荧光光灯灯进进行行光光照照，光光谱谱成成分分主主要要是是蓝蓝光光，光光谱谱波波长长为为419nm。在在离离体体培培养养中中，根根、芽分化的依赖光谱成分不同。芽分化的依赖光谱成分不同。光周期光周期指的是光照和黑暗交替的时间，影响指的是光照和黑暗交替的时间，影响细胞脱分化和再分化的效应。细胞脱分化和再分化的效应。温温度度控控制制主主要要依依据据植植物物物物种种的的起起源源和和生生态态类类型型来来决决定定。依依植植物物生生活活习习性性可可将将其其分为喜温性植物和冷凉性植物两大类型。分为喜温
21、性植物和冷凉性植物两大类型。喜喜温温性性植植物物培培养养温温度度一一般般控控制制在在26-280C，冷冷凉凉性性植植物物培培养养温温度度一一般般控控制制在在18-220C或或低于低于250C为为宜。宜。在在大大多多数数情情况况下下，适适温温有有利利于于细细胞胞分分裂裂，即即可可以以提提高高细细胞胞分分裂裂速速率率，而而适适当当提提高高温温度度则则有有利利于于细细胞胞生生长长，在在一一定定范范围围内内降降低低培培养养温温度度则则使使细细胞胞分分裂裂和和生生长长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。速度均减缓，而且使细胞的质量增加。湿湿度度条条件件：培培养养过过程程对对湿湿度度要要求求并并不不十十分分
22、严严格格，因因为为培培养养的的小小环环境境中中相相对对湿湿度度常常达达110%。周周围围环环境境的的相相对对湿湿度度低低于于60%时时，培培养养基基容容易易干干涸涸，会会改改变变培培养养基基的的渗渗透透压压；相相反反，若若周周围围环环境境湿湿度度过过高高时时，培培养养室室易易滋生各种细菌和霉菌。滋生各种细菌和霉菌。周周围围环环境境较较适适宜宜的的相相对对湿湿度度为为7080%。植植物物培培养养通通常常使使用用的的pH值值范范围围是是5.56.5。pH在在4.0以以下下或或7.0以以上上培培养养物物就就不不能能正常生长。正常生长。由由于于外外植植体体的的吸吸收收，引引起起培培养养过过程程中中的的
23、pH变化；高压灭菌引起变化；高压灭菌引起pH变化。变化。总总体体上上讲讲，动动物物细细胞胞忍忍受受低低温温的的能能力力比比忍忍受受高高温温的的能能力力强强。如如哺哺乳乳低低温温细细胞胞在在45下下只只能能存存活活1小小时时，但但在在25条条件件下下仍仍然然能能慢慢速速生生长长，并并维维持持长长时时间间不不死死，甚甚至至在在4下下数数小小时时后后，再再置置于于适适宜宜温温度度下细胞仍然可以正常生长。下细胞仍然可以正常生长。1.4.2 动物细胞培养环境控制2. pH2. pH动动物物细细胞胞培培养养适适宜宜的的pHpH一一般般在在7.2-7.47.2-7.4，低低于于6.86.8或或高高于于7.6
24、7.6都都不不利利于于细细胞胞生生长长，严严重重时时会会导致细胞死亡。导致细胞死亡。 培培养养细细胞胞对对pHpH的的要要求求因因培培养养时时间间长长短短有有关关，一一般般原原代代细细胞胞要要求求较较严严格格，而而永永久久细细胞胞系系对对pHpH具有较强的忍耐性。具有较强的忍耐性。 3. 3. 溶氧及气体环境溶氧及气体环境一一般般细细胞胞在在培培养养初初期期要要求求较较低低的的溶溶氧氧水水平平，而而在在对对数数生生长长期期或或培培养养后后期期，对对溶溶氧氧水水平平要要求求增增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。 除除了了氧氧气气供供应应外外，还还应应
25、注注意意培培养养基基的的氧氧气气和和COCO2 2的平衡。的平衡。 4. 4. 渗透压渗透压动动物物细细胞胞培培养养渗渗透透压压包包括括两两个个方方面面的的问问题：题： 一是培养基的渗透压维持；一是培养基的渗透压维持； 二细胞体内的渗透压维持。二细胞体内的渗透压维持。 大大多多数数动动物物细细胞胞对对渗渗透透压压的的忍忍耐耐程程度度较较强强，只只要要培培养养基基的的渗渗透透压压变变化化不不是是很很剧剧烈烈，一一般般对对培培养养物物不会造成致命伤害。不会造成致命伤害。 动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。1.5 外植体接种培养植物离体培养类型：植物离体
26、培养类型： 组织培养组织培养 器官培养器官培养 细胞培养细胞培养 原生质体培养原生质体培养植物材料的培养与外植体选取植物材料的培养与外植体选取 外植体灭菌外植体灭菌接种培养及培养条件的控制接种培养及培养条件的控制植物离体培养基本程序外植体的来源外外植植体体（explantexplant）是是指指用用于于离离体体培培养养的的活活的的植物组织、器官等材料。植物组织、器官等材料。 用用于于外外植植体体分分离离的的母母体体植植物物材材料料一一般般有有三三种种来源：来源： u一是生长在自然环境下的植物；一是生长在自然环境下的植物； u二二是是有有目目的的地地培培育育在在温温室室控控制制环环境境条条件件下
27、下生长的植物；生长的植物； u三是无菌环境下已经过离体培养的植物。三是无菌环境下已经过离体培养的植物。 外植体取材a. a. 根据培养需求选择植物部位根据培养需求选择植物部位 b. b. 多年生植物注意树龄和季节多年生植物注意树龄和季节 c. c. 在不影响培养目的的前提下尽可能在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体选择自然繁殖器官作外植体外植体灭菌外植体外植体清洗整理清洗整理杀菌剂灭菌杀菌剂灭菌无菌水清洗无菌水清洗不同外植体不同外植体 在灭菌剂浓度、在灭菌剂浓度、 时间、程序上时间、程序上 应有所区别应有所区别几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使
28、用浓度使用浓度(%)(%)消毒时消毒时间间(min.)(min.)效效 果果残液去残液去除难易除难易次氯酸钙次氯酸钙/ /纳纳10105 53030好好易易新洁尔灭新洁尔灭101020205 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21010最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难课后思考课后思考请思考细胞工程实验技术与其它生物技术实验不请思考细胞工程实验技术与其它生物技术实验不同之处。同之处。植物细胞培养环境控制应注意哪些方面？植物细胞培养环境控制应注意哪些方面？动植物细胞培养基的主要成分分别包括哪些？动植物细胞培养基的主要成分分别包括哪些？就本章知识，分析动植物细胞培养的区别。就本章知识，分析动植物细胞培养的区别。
