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1、实验实验 碱性磷酸酶的分离提取碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定及比活力的测定n n目的要求：1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法1.原理原理n n碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。 n n在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好
2、的分离提取效果，在工作性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：中特别注意以下几点：(1)(1)取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。高的材料。(2)(2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（酸铵在水中溶解度很大（2020，每升可溶，每升可溶760760克），克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的
3、盐。盐。(3)(3) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。有效。n n酶活力的分析：通常是以对酶活力的分析：通常是以对- -硝基苯磷酸二钠硝基苯磷酸二钠（pNPPpNPP）为底物，在为底物，在pH10.1pH10.1的碳酸盐缓冲液（含的碳酸盐缓冲液（含2 2 mmolmmol/L Mg/L Mg2+2+）的测活体系中检测酶催化的测活体系中检测酶催化pNPPpNPP水解水解产生黄色的对硝基苯酚（产生黄色的对硝基苯酚（pNPpNP）的量。产物的量。产物p
4、NPpNP在在405 405 nmnm处有最大的吸收峰，可以根据处有最大的吸收峰，可以根据ODOD405 nm405 nm 值值的增加计算酶活力的大小。的增加计算酶活力的大小。n n酶活力定义为：在酶活力定义为：在3737下，以下，以2 2 mmolmmol/L /L pNPPpNPP为底为底物，在物，在pH10.1pH10.1的碳酸盐缓冲液含的碳酸盐缓冲液含2 2 mmolmmol/L Mg/L Mg2+2+的的测活体系中每分钟催化产生测活体系中每分钟催化产生1 1 mol/L mol/L pNPpNP的酶量定的酶量定为为1 1个酶活力单位。酶的比活力定义为每个酶活力单位。酶的比活力定义为每
5、mgmg蛋白所蛋白所具有的酶活力单位数。具有的酶活力单位数。n n蛋白质浓度的测定常采用福林蛋白质浓度的测定常采用福林- -酚试剂（酚试剂（FolinFolin- -Phenol reagentPhenol reagent）显色法显色法 2 2操作方法操作方法操作方法操作方法2.1 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取牡蛎碱性磷酸酶的分离提取牡蛎碱性磷酸酶的分离提取牡蛎碱性磷酸酶的分离提取(1)(1)每组称取每组称取2020 g g牡蛎（蒸馏水洗净），加入牡蛎（蒸馏水洗净），加入5050 mLmL预先冷却的预先冷却的0.010.01mol/Lmol/LTrisTris- -HClHCl 缓冲液（缓
6、冲液（pH7.5pH7.5，含含0.10.1mol/Lmol/LNaClNaCl），），（两组一起）两组一起）于高速组于高速组织捣粹机匀浆织捣粹机匀浆1 1minmin，于冰箱于冰箱44放置放置1 1h h进行抽进行抽提。提。(2)(2)室温离心，室温离心，40004000r/m20minr/m20min，收集离心上清液，收集离心上清液，（两组分开）（两组分开）并量体积。（并量体积。（留留2 2mLmL上清液上清液，待，待测酶的比活力。）测酶的比活力。） (3)(3)在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.350.35饱饱和度（和度（100100mLmL加入
7、加入20.920.9g g）。）。缓慢加入，不断搅缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置拌溶解，置冰箱静置0.50.5h h。(4)(4)室温离心，室温离心，40004000r/m20minr/m20min，收集离心上清液，收集离心上清液，并量体积。（并量体积。（留留2 2mLmL上清液上清液，对，对0.010.01mol/Lmol/LTrisTris- -HClHCl 缓冲液缓冲液pH7.5pH7.5含含0.10.1mol/Lmol/LNaClNaCl 透析平衡，透析平衡，待测酶的比活力。（不做）待测酶的比活力。（不做） (5)0.35(5)0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸饱和硫
8、酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至铵至0.700.70饱和度（饱和度（100100mLmL加入加入23.823.8g g）。）。缓慢加入，缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置不断搅拌溶解，置冰箱静置2 2h h。(6)(6)室温离心，室温离心，40004000r/m20minr/m20min，收集沉淀物。收集沉淀物。 (7)(7)得到沉淀物，溶于得到沉淀物，溶于5 5 mLmL含含0.10.1mol/Lmol/LNaClNaCl 的的0.010.01mol/Lmol/LTrisTris- -HClHClpH7.5pH7.5。装入透析袋，对装入透析袋，对0.010.01mol/Lmol/LTr
9、isTris- -HClHClpH7.5pH7.5缓冲液透析平衡，至无缓冲液透析平衡，至无SOSO4 42-2-被检测被检测出为止（可用一定浓度出为止（可用一定浓度BaClBaCl2 2溶液检验）。溶液检验）。(8)(8)取出酶溶液，冷冻高速离心（取出酶溶液，冷冻高速离心（025000025000r/m30r/m30minmin）。）。(9)(9)离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于棕色瓶于44冰箱保存。冰箱保存。2020 g g牡蛎牡蛎加入加入5050 mLmL预先冷却的预先冷却的0.01 0.01 mol/L mol/L Tris
10、-HClTris-HCl 缓冲液（缓冲液（pH 7.5pH 7.5，含含0.1 0.1 mol/L mol/L NaClNaCl），），于高速组织捣粹机匀浆于高速组织捣粹机匀浆1 1 minmin，于冰箱于冰箱4 4放置放置1 1 h h进行抽提。进行抽提。室温离心，室温离心，4000 4000 r/m 20 minr/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。收集离心上清液，并量体积。匀浆液上清液缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.350.35饱和度（饱和度（100 100 mLmL加入加入20.9 20.9 g g），），不断搅拌溶解，置冰箱静置不断搅拌溶解，
11、置冰箱静置1 1 h h。室温离心，室温离心，4000 4000 r/m 20 minr/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。收集离心上清液，并量体积。加入固体研磨细粉的硫酸铵至加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.700.70饱和度（饱和度（100100mLmL加入加入23.823.8g g）。）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 2h h。室温离心，室温离心，40004000r/m20minr/m20min，收集沉淀物。收集沉淀物。0.350.35饱和硫酸铵上清液饱和硫酸铵上清液沉淀溶于溶于5 5 mLmL含含0.10.1mol/Lmol/LNaClN
12、aCl 的的0.010.01mol/Lmol/LTris-HClTris-HClpH7.5pH7.5。装入透装入透析袋，对析袋，对0.010.01mol/Lmol/LTris-HClTris-HClpH7.5pH7.5缓冲液透析平衡，至无缓冲液透析平衡，至无SOSO4 42-2-被被检测出为止检测出为止粗酶液2.2 2.2 比活力测定比活力测定比活力测定比活力测定2.2.12.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作对硝基苯酚标准曲线的制作对硝基苯酚标准曲线的制作对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）（不做）（不做）（不做）：取取1515支试管编号，支试管编号，0 0号一支，号一支，1 17 7号各二支，按
13、下列表格操作。号各二支，按下列表格操作。管号01234567pNP含量(mol)00.050.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.350.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。8.80103( mol/L)
14、-1cm-1管号空白1235mMpNPP(mL)各0.2mLNa2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mLH2O(mL)各0.50mL混匀，混匀，3737，5 5分钟分钟酶液（mL）/各0.1mL3737，精确反应，精确反应1010分钟分钟0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL 酶液（mL）0.1mLOD405nm2.2.2 酶活力的测定酶活力的测定以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产物的mol数，算出酶活力。管号管号1 11 1 2 22 2 3 33 3 4 44 4 5 55 5 加酶时加酶
15、时间间（minmin）0.5m0.5m1m1m1.5m1.5m2m2m2.52.5mm3m3m3.5m3.5m4m4m4.5m4.5m5m5m加加NaOHNaOH时间时间10.510.5111111.511.5121212.512.5131313.513.5141414.514.51515反应时反应时间间（minmin）10101010101010101010101010101010101010102.2.3蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定本实验采用紫外吸收法（本实验采用紫外吸收法（ODOD280280）测定蛋白浓度测定蛋白浓度。n n上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用Tris-HCl缓冲液稀释
16、，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。2.3 2.3 结果处理结果处理结果处理结果处理计算：式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNPmol数，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg） 纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力*100/第一步总活力酶活力（U/mL）蛋白浓度（mg/mL）将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做） 步骤总体积mL蛋白mg/mL总蛋白mg酶活力U/mL总活力U比活力U/mg纯
17、化倍数得率%匀浆过滤液4007.2420.3正丁醇处理上清液47033.80.35饱和(NH4)2SO4上清液44035.30.7饱和(NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3314.7DEAE-32酶液9.63.821002.2SephadexG75酶液13.20.49451.5SephadexG200酶液6.80.21509.33.3.注意事项注意事项（1 1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。性。（2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水浴锅中预热及反应。（3）紫外分光光度测定需用石英杯。（4）稀释倍数（5）移液器的使用（6）离心机的使用
