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1、第二章第二章 基因工程载体和工具酶基因工程载体和工具酶Chapter II vectors and Tools enzyme for genetic engineering, 【载体（载体（ Vector）】基因工程操作中，把能基因工程操作中，把能携带目的基因进入宿主细胞并进行携带目的基因进入宿主细胞并进行扩增扩增和和表达表达的工具叫载体。的工具叫载体。【工具酶工具酶】是是基因重组技术基因重组技术不可缺少的工具，不可缺少的工具，主要用于核酸分子的切割、连接、聚合、修饰、主要用于核酸分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。主要有限制性反转录等有关的各种酶系统。主要有限制性内切内切
2、酶酶、连接酶连接酶、核酸聚合酶核酸聚合酶、磷酸酶和磷酸激酶、磷酸酶和磷酸激酶、逆转录酶逆转录酶等。等。 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于所以就必须借助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来来实现。实现。【载体载体】能载带微量物质共同参与某能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，种化学或物理过程的常量物质，在基在基因工程操作中，把能携带目的基因进因工程操
3、作中，把能携带目的基因进入宿主细胞并进行入宿主细胞并进行扩增扩增和和表达表达的工具的工具叫载体。三种最常用的载体是细菌叫载体。三种最常用的载体是细菌质质粒粒、噬菌体噬菌体和和植物病毒植物病毒。 （1 1）载体必须是载体必须是复制子复制子。 具有复制起始具有复制起始 点，最好要有点，最好要有 较高的自主复制能力。较高的自主复制能力。（2 2）有）有选择性标记，如抗选择性标记，如抗KanKan、抗、抗AmpAmp（3 3）有一段）有一段多克隆位点多克隆位点 外源外源DNADNA插入其中，不影响其复制插入其中，不影响其复制（4 4）分子量小，拷贝数多分子量小，拷贝数多（5 5）容易容易从宿主细胞中从
4、宿主细胞中分离纯化分离纯化（1）载体必须是）载体必须是复制子复制子。 最最好要有较高的自主复制能力。好要有较高的自主复制能力。 【复制子（复制子（repliconreplicon）】是是DNA复制时从一个复制时从一个DNA复制复制起点开始最终由这个起点起起点开始最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。像始的复制叉完成的片段。像E.coli 质粒质粒DNA独立复制的独立复制的单位均为复制子。单位均为复制子。 （2）有）有选择性标记选择性标记抗生素抗性标记基因抗生素抗性标记基因:标记基因是与外源目标记基因是与外源目的基因构建在同一表达载体上，一起转化进入的基因构建在同一表达载体上，一起转化进入细胞，
5、而后在特定条件下帮助筛选出已转化的细胞，而后在特定条件下帮助筛选出已转化的细胞。细胞。 蓝白筛选：蓝白筛选： pUC19pUC19等载体携带细菌等载体携带细菌laclac操纵子中的操纵子中的lacZlacZ基因编码，基因编码，-半半乳糖苷酶乳糖苷酶N N端状端状146146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTGIPTG和和XgalXgal时，时，lacZlacZ 基因被诱导表达产生的基因被诱导表达产生的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端肽端肽与与宿主菌表达的宿主菌表达的C C端肽互补端肽互补而具有而具有-半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性（质（质粒和宿主编码的肽
6、段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为活性，称为-互补互补， -complementation-complementation），），半乳糖苷酶水半乳糖苷酶水解解XgalXgal而使菌落呈现蓝色而使菌落呈现蓝色；转化转化空载体空载体大肠杆菌受体菌大肠杆菌受体菌pUC19产生产生Lac Z 的的N端端146个氨基酸的多肽个氨基酸的多肽大肠杆菌产生大肠杆菌产生Lac Z 的的C端的多肽端的多肽IPTG诱导表达诱导表达LacZ（ -半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）X-Gal蓝蓝色色产产物物水解反应水解反应 在在lacZlacZ 中间又插入了一段
7、人工设计合成的中间又插入了一段人工设计合成的DNADNA序列，其序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏外来序列插入后则破坏了了lacZlacZ 编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选蓝白筛选插入外源片插入外源片段后的载体段后的载体大
8、肠杆菌受体菌大肠杆菌受体菌pUC19产生产生Lac Z 的的N端端146个氨基酸被打断个氨基酸被打断的多肽的多肽大肠杆菌产生大肠杆菌产生Lac Z 的的C端的多肽端的多肽IPTG诱导表达诱导表达无无LacZ产生产生X-Gal白色白色产物产物无水解反应发生无水解反应发生（3 3）有一段多克隆位点）有一段多克隆位点多克隆位点（多克隆位点（multiple cloning site, MCS），），是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS中，每个限制性
9、酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。 （4 4）分子量小，拷贝数多。分子量小，拷贝数多。（5 5）在宿主细胞内稳定性高，在宿主细胞内稳定性高，容易容易从宿主从宿主细胞中细胞中分离纯化。分离纯化。克隆载体克隆载体: : 克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断表达载体表达载体: : 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体: : 把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中(1)按功能分按功能分A.【克隆载体克隆载体】克隆一个基因或克隆一个基因或DNA片断，如片断，如T载体等。载体等。 pUCm-T载体载体 (pUCm-T Vecto
10、r) ：是用于克隆含有是用于克隆含有A末末端端PCR产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片断产物的理想载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片断的重组克隆。的重组克隆。 TA克隆：克隆：许多高温许多高温DNA聚合酶，扩增的聚合酶，扩增的PCR产物产物3-末端都带末端都带有一个突出碱基有一个突出碱基A；pUCm-T载体是两端各带有一个载体是两端各带有一个突出碱基突出碱基T的双链线性质粒，与的双链线性质粒，与PCR产物可准确地形产物可准确地形成环状质粒成环状质粒DNA； PCR产物与产物与pUCm-T载体形成环载体形成环状质粒状质粒DNA的过程叫的过程叫TA克隆。克隆。B.【表达载体表达载体】用于一个
11、基因的蛋白表达。常用于一个基因的蛋白表达。常用的有用的有原核表达载体原核表达载体（如，（如，pQE 3.0等）和等）和真真核表达载体核表达载体(如，如，pQE 3.1（/-）等）等)。真核表达载体：绿色荧光蛋白载体真核表达载体：绿色荧光蛋白载体pEGFP-C3pEGFP-C3( (Green Fluorescent Protein，GFP) pEGFP-C3载体载体 pEGFP-C3载体是一种把异源性蛋白质融合至EGFP C端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。 含有巨细胞病毒（CMV）启动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个
12、多克隆位点，具有筛选标志卡纳霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因。 异源性蛋白与EGFP阅读框融合克隆入pEGFP-C3，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内定位。 EGFP融合蛋白融合蛋白在胞质中表达在胞质中表达真核表达载体：绿色荧光蛋白载体真核表达载体：绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2pEGFP-C2红色荧光蛋白表达载体红色荧光蛋白表达载体 pVisionRFP-CEGFP融合蛋白融合蛋白在胞质中表达在胞质中表达pAVU6+27：RNAi哺乳动物载体，含有氨苄青霉素抗性和新霉素抗性。常用多克隆位点为Sal和Xba （3 3）整合载体：）整合载体：把一个基因插入到染色体组中，把一个基因插入到染色体组中，如酵母附加载体如酵母附加载体YEpsYEps可以插入酵母的染色体DNA
