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1、第十六章呼肠孤病毒科(Reoviridae)一、概述二、正呼肠孤病毒属(一)哺乳动物呼肠孤病毒(二)禽呼肠孤病毒三、环状病毒属(一)蓝舌病病毒(二)非洲马瘟病毒(三)鹿流行性出血病病毒(四)茨城病病毒(五)马器质性脑病病毒四、轮状病毒属五、 COLTI 病毒属科罗拉多蜱传热病毒六、水生呼肠孤病毒属草鱼出血病病毒主要参考文献一、概述同义名:双股核糖核酸病毒科本科的命名是取自3 个英文单词的词头组合而成,全称是呼吸道(respiratory) 、肠道(enteric)和孤儿( orphan )病毒。于50 年代早期,当乳鼠和灵长类的细胞培养开始广泛应用于病毒学实验室时,从人的呼吸道和胃肠道分离出这
2、类病毒,但与任何疾病都不相关,分类鉴定为小 RNA病毒。几年以后,发现该病毒的基因组为双股RNA ,并分节段。 1959 年建议命名为呼肠孤病毒,强调了其与疾病的不相关性。但是随后发现,这些病毒也有一定的病原性,一些成员还是某些特定疾病的病原体,因此建议改称呼肠病毒。本书照顾习惯,仍称呼肠孤病毒,也与英文“Reo”相应。在证明呼肠孤病毒的基因组是由若干片段组成的双股RNA后,接着又发现三叶草的伤瘤病毒( Clover wound tumour virus, WTV)也含双股RNA ,而且病毒粒子的形态结构极像呼肠孤病毒,从而引起病毒学工作者对双股RNA病毒的极大兴趣。此后,相继在脊椎动物、无脊
3、椎动物、细菌、高等植物和真菌等宿主体内发现了60 种以上的双股RNA病毒(虽其形态结构和生物学特性不尽一致) 。呼肠孤病毒基因组是双链这一重要发现,第一次说明了双链可作为稳定的生命形式存在于自然界。1968 年, Verwoerd 等建议成立一个新的分类学类群,称为“双股核糖核酸病毒” (亦即双股RNA病毒)。 1971 年,Borden 等在原来的呼肠孤病毒群中的某些病毒的负染标本上,发现病毒壳粒呈短粗中空的环状,建议成立环状病毒属。1974 年, Flewett等根据犊牛腹泻病毒和婴儿腹泻病毒的形态类似车轮的特点,又提出了“轮状病毒”这一新的病毒名称。1975 年,国际病毒命名委员会正式采
4、用这一名称,并于1978 年将其列为一个病毒属,而将原来的呼肠孤病毒属提升为科,从而在呼肠孤病毒科下包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属等三个病毒属。1991 年,国际病毒分类委员会(ICT)第 5 次病毒分类报告中新增科州蜱传热()病毒属及水生呼肠孤病毒属,将呼肠孤病毒科分为呼肠孤病毒亚群(正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、 COLTI 病毒属、水生动物呼肠孤病毒属) 、胞质多角体病毒群(胞质多角体病毒属名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页,共 31 页
5、 - - - - - - - - - Cypovirus ) 、植物呼肠孤病毒亚群1(植物病毒属Phytovirus) 、植物呼肠孤病毒亚群2(斐济病毒属 Fijivirus)及植物呼肠孤病毒亚群3(建议)。年第次病毒分类报告中,取消了第次分类报告中的群,统一定位为属,即呼肠孤病毒科下设正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、病毒属、水生呼肠孤病毒属、斐济病毒属Fijivirus、植物呼肠孤病毒属 hytoreovirus及水稻矮缩条叶枯病毒属Oryzavirus。其中正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、COLTI病毒属(科州蜱传热病毒属)及水生呼肠孤病毒属有一些重要的动物病原,本书将分节
6、介绍。本科其它属如胞质多角体病毒属的成员多达150 种以上,均是昆虫病毒,代表种为家蚕胞质多角体病毒,是家蚕的重要致病病毒。植物呼肠孤病毒属及斐济病毒属是植物的病毒。此外,还从真菌发现一些结构与呼肠孤病毒类似的病毒,但 RNA只有 13 个节段,这些内容不再予以讨论。该科大多数成员的病毒粒子呈廿面体对称,无囊膜,有双层衣壳,内衣壳结构稳定,含32 个壳粒, 呈廿面体对称, 但外衣壳结构差异明显(见正呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属等)。病毒核酸为线性双股RNA ,有 1012 个节段,单个节段的分子量0210330103kDa,总分子量为1210320103kDa,大约为病毒粒子总重的14
7、% 22% 。每个RNA节段有一个阅读开放框架,编码一种蛋白质(不需要进一步加工,这区别于双病毒科)。病毒粒子有610 种蛋白质(分子量15103155 103Da) ,包括与核心相关的转录酶和mRNA 帽化酶, 其中一些蛋白质是糖基化的。完整的病毒粒子的分子量约为120 106Da, 在 CsCl2 中浮密度为136139g/cm3。病毒在胞浆内复制,有时在感染细胞的胞浆内看到病毒粒子呈类结晶状排列。病毒复制前,胞饮的病毒粒子首先受细胞溶酶体水解酶的作用致使病毒粒子部分脱壳,成为亚病毒颗粒( subviral particle ) 。这一过程活化了病毒子携带的转录酶和帽化酶,从而转录出在3
8、末端没有多聚腺苷酸化而在5 端帽化的mRNA 分子,这点是独特的。在病毒粒子转录酶作用下,首先合成正股。并不是所有呼肠孤病毒基因组在起始过程中都能转录,只是某些基因(节段)才能起始转录,而其它基因随着病毒早期蛋白的合成而被抑制。每种蛋白的合成分别与每个mRNA 分子相联系,并合成反义RNA链,从而产生双股子代RNA分子。这些 RNA分子又作为模板转录出更多的mRNA ;然而此时的mRNA 不被帽化,通过一种未知的机制,这些未帽化的呼肠孤病毒mRNA 能优先合成大量的病毒结构蛋白。最后,这些亚病毒颗粒与一些附加蛋白一起完成病毒粒子的成熟。在环状病毒的合成过程中,胞浆内形成规则性的微管样结构。轮状
9、病毒的成熟涉及到单层衣壳进入粗面内质网上囊泡的这一不寻常的出芽过程。因此而形成的伪膜随后移至它处,外衣壳加到囊泡上,由于病毒的主要外衣壳蛋白是糖基化的,它的合成只有当它通过内质网膜时才能完成。由于该科病毒核酸是多节段的,很容易出现基因重组现象,重组频率一般为% % 。二、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)同义名:呼肠孤病毒,呼吸道肠道孤儿病毒,肝脑脊髓膜炎病毒。代表株为呼肠孤病毒3 型,成员包括从人、猴、犬、牛分离的呼肠孤病毒、型以及家禽分离株和纳尔逊海湾病毒(Nelson Bay virus, NBV) 。呼肠孤病毒可由许多脊椎动物体内分离到,包括马、牛、猪、绵羊、豚鼠、犬、猫、貂
10、、禽类、蝙蝠以及人、黑猩猩和猴,除了感染啮齿动物和禽外,一般不引起明显的疾病,特别是对成年动物。呼肠孤病毒在动物和人类的某些呼吸道及消化道疾病的发生上,呈现一定的辅助或促进作用。病毒粒子直径约76nm ,有 92 个壳粒,核心直径约52nm ,由两层致密的蛋白质衣壳所包裹。在电镜下,核心上具有12 个呈 5 度对称的棘状突起(约5nm ) ,分别从廿面体对称的12 个顶上延伸出来, 基因节段的转录酶就从该部位释放出来。病毒有三组不同大小的RNA ,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分成10 个分散的节段,编码10 种蛋白质,在翻译过程中再一一裂解。完整病毒的浮密度为 1.37g/cm3。病毒具有抗酸、抗脂
11、溶剂等特性,不需节肢动物传播。基于宿主种类、抗原特性、血凝素和引起细胞融合的能力,一般将正呼肠孤病毒属成员分两群,即哺乳动物呼肠孤病毒和禽名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页,共 31 页 - - - - - - - - - 呼肠孤病毒。从飞狐中分离到的一株纳尔逊海湾病毒,它的特性介于两群之间。(一) 哺乳动物呼肠孤病毒1. 形态具有特征的廿面体对称的双层衣壳结构。病毒粒子的核心由核酸基因组及其密切连接的内衣壳构成,其外还有一层外衣壳,无囊膜。完整的病毒粒子直径76
12、nm左右,核心的直径52nm左右,电子显微镜下很容易看到病毒粒子表面的壳粒,外衣壳共92 个壳粒,分别由五邻体和六邻体组成,其中 80 个为六邻体, 12 个为 5 邻体,壳粒为长10nm 、宽 8nm的中空棱状结构。内衣壳呈廿面体5度对称排列。正呼肠孤病毒的外衣壳比较脆弱,易被热和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)等蛋白水解酶破坏,正是由于这种特性,一般说来,蛋白水解酶能增强病毒在肠道中的感染性,这是由于脱去病毒外衣壳的缘故。内衣壳却很稳定,不仅对热和胰凝乳蛋白酶处理具有较大的抵抗力,而且能耐高浓度的尿素、二甲亚砜()和SDS的处理。呼肠孤病毒可在体外培养的敏感细胞内形成胞浆内包涵体,
13、包涵体内具有许多结晶状排列的病毒粒子。将提纯的病毒粒子置于蒸馏水中,可使外衣壳结构疏松,病毒粒子的直径增大。也常见到呼肠孤病毒的空衣壳,这是病毒粒子中缺乏核酸的缘故。2. 理化学特性早在 1962 年, Gomatos 等就已证明呼肠孤病毒具有双股RNA ,因为感染呼肠孤病毒的L 细胞的胞浆内包涵体在DNA酶和 RNA酶处理后依然保持感染性,Feulgen 染色呈阴性反应,而且这种包涵体在用吖啶橙染色时呈苹果绿色。5氟脱氧尿核苷(FUDR )和 5溴脱氧尿核苷(BUDR )等 DNA合成抑制剂,不能抑制呼肠孤病毒的增殖。但在病毒增殖的后期,吖啶橙染色可能呈橘红色ZW(应用 pH4.95 的 0
14、01% 吖啶橙液进行染色,双股DNA和双股 RNA病毒呈苹果绿色,单股DNA和单股 RNA病毒呈橘红色,详见本书第十四章。ZW) ,从而证明呼肠孤病毒除双股RNA外,同时还有单股 RNA的存在。后者是一些低分子量的寡核苷酸,一般认为是病毒不完全转录的产物,约占病毒核酸总量的15% 20% 。这些单股RNA 主要分布在病毒粒子核心的外面。正呼肠孤病毒的整个基因组由10 个片段的双股RNA组成,节段分子量为0510327103kDa, RNA的总分子量14103 15103kDa。在氯化铯中的浮密度为161g/cm3。S20W730。RNA含量约占病毒粒子总重的14% ,病毒共含3 000 个寡核
15、苷酸,其长度在 2% 20 核苷间,核心含44%RNA 。G+C含量为 44% 。双股 RNA在 7885温度中发生变性,成为对 RNA酶敏感的单股RNA ,说明其中存在不耐热的结合键。病毒粒子分子量130106Da,本属病毒的基因组与呼肠孤病毒科其它属成员无同源性序列。正呼肠孤病毒的蛋白质占病毒粒子总重的86% ,分布于两层衣壳内,一共有9 种蛋白质,分子量33103155103Da,种主要多肽,即1、2、1、2、1、2、和3。外衣壳由 2、1 和3 等三种蛋白质组成。Astell等( 1972)由感染细胞中提取“亚病毒单位” ,也就是除掉外衣壳的病毒粒子,随后加入3 蛋白,结果成功地在试管
16、内组装成完整的呼肠孤病毒粒子,从而证明3 蛋白是外衣壳的主要成分。但在仔细研究胰凝乳蛋白酶降解外衣壳的过程中,发现与衣壳稳定性和病毒粒子感染性有关的主要成分是2 而不是3。胰凝乳蛋白酶可将3 完全除去, 但病毒粒子仍保持高度感染性。但在将 2 降解时,病毒粒子的感染性明显下降。最后除去的是1,结果遗留52nm直径的内衣壳,即核心。1、2、1 和2 等几种蛋白质存在于内衣壳内。正呼肠孤病毒不含糖类和脂质,对乙醚有抵抗力。正呼肠孤病毒含有转录酶、复制酶、核苷酸磷酸水解酶、帽化酶。正呼肠孤病毒对去氧胆酸盐、醚和氯仿具有很大抵抗力,能耐562 小时或 6030 分钟的加热,在4,其传染性至少可维持 2
17、 个月。在有12mol/L MgCl2 存在的情况下,5055加热 515 分钟,可以明显提高名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页,共 31 页 - - - - - - - - - 正呼肠孤病毒的感染力。一般认为,这是除去外衣壳或改变外衣壳结构或性质的结果。在冰冻的病毒液中加入上述浓度的Mg 和 Cl 离子,却使病毒明显灭活,原因不明。用胰凝乳蛋白酶处理病毒标本,有提高其感染力的作用。这种酶可使外衣壳发生部分裂解,并不将其完全除去。正呼肠孤病毒可被某些染料的光动力作
18、用所破坏,包括常用于蚀斑试验的中性红。紫外线也有破坏病毒的作用,但是已经在紫外线灭活的病毒标本内多次发现多数感染复活现象。正呼肠孤病毒在pH2280 的广泛酸碱范围内保持稳定。在室温条件下, 能耐 1%H2O2、3% 福尔马林、 5% 来苏儿和1% 石炭酸 1 小时。但 70% 乙醇在较长时间作用后使其灭活,过碘酸盐也可迅速杀死呼肠孤病毒。3. 抗原性正呼肠孤病毒具有共同的群特异性抗原2 和3,另外还有型特异型抗原1。哺乳动物的呼肠孤病毒共有一个补体结合性抗原,应用血清中和试验和血凝抑制试验,则可将其区分为 3 个不同的血清型。2 型呼肠孤病毒更进一步区分为4 个亚型。 这些血清型与禽呼肠孤病
19、毒没有血清学关系。奇怪的是,哺乳动物的呼肠孤病毒竟与三叶草的伤瘤病毒具有一个共同的抗原成分,而且这种植物病毒与哺乳动物的呼肠孤病毒具有同样的形态结构以及双股RNA构型。呼肠孤病毒的 3 个哺乳动物血清型都能凝集人的O型红细胞,这种红细胞凝集现象发生于437温度中。56加热使呼肠孤病毒迅速丧失血凝特性。3 型呼肠孤病毒还能凝集牛的红细胞。分离自猪的病毒株常可凝集猪的红细胞,但不能凝集豚鼠和鸡的红细胞。应用蔗糖密度梯度技术可由病毒粒子中提取两种血凝素,其中一种与病毒的感染性有关。乙醚不能破坏呼肠孤病毒的血凝性和感染性;氯仿能破坏其血性,但不破坏其感染性。呼肠孤病毒的血凝现象可被特异抗血清所抑制,故
20、可进行血凝抑制试验检测抗体或用已知抗体鉴定病毒。4. 培养呼肠孤病毒可在许多种类的培养细胞中增殖,包括原代猴肾细胞、KB 细胞、 HeLa 细胞、人羊膜细胞以及L 细胞等,并于714 天内产生细胞病变,主要是在感染细胞内形成嗜伊红性胞浆内包涵体。这些包涵体特征地形成于胞核附近的胞浆内,并在感染过程增进时散布于整个胞浆内。电子显微镜检查,可在包涵体内看到完全和不完全的病毒粒子。这些病毒粒子经常呈结晶状排列,并常连结于胞浆内的梭形微管上。感染细胞最后崩解,病毒被释于细胞外。不同于禽呼肠孤病毒,哺乳动物呼肠孤病毒虽可在鸡胚内增殖,但不呈现规律性。来源于人的呼肠孤病毒株通常不能在鸡胚卵黄囊内增殖。正呼
21、肠孤病毒在L 细胞内的增殖过程已被充分研究。于 37,接种入的病毒可在30 分钟内吸附 65% 。病毒借细胞吞饮作用侵入细胞。吞饮泡与溶酶体融合而形成吞噬体。电子显微镜观察,常可在这种吞噬体内见到完整的病毒粒子。病毒粒子的外衣壳由溶酶体的水解酶除去,剩下“亚病毒颗粒”,亦即核心。核心中的转录酶和帽化酶原来呈“不活动”状态,此时因外衣壳的除去或改变而被激活,从而由某些双股RNA片段转录出单股的mRNA 。另一些双股RNA基因节段则随早期病毒蛋白合成而受到抑制,母代的双股RNA继续保留,在获得蛋白外壳后可以重新成为完整的病毒粒子。新转录出来的单股mRNA 既是新的双股RNA的合成模板,也是病毒蛋白
22、质的合成模板。这些未帽化 mRNA 能优先合成大量的病毒结构蛋白。这些双股RNA是在复制酶的帮助下由新复制的单股RNA组合而成的。病毒粒子的最后装配,就在胞核周围的胞浆内进行,并如上述,常常连结于梭形微管上。正呼肠孤病毒的一个特点,就是在没有脱去内衣壳的病毒核心内,就能进行部分转录过程。每个病毒核心含有许多酶活动点,初期的mRNA 分子即由此释出。5. 病原性鼠类能发生3 型呼肠孤病毒的自然感染,有时称肝脑脊髓炎,其临床表现为黄疸、运动失调、油性被毛、生长发育迟缓等。给乳幼鼠作滴鼻感染,也可使其发生呼吸道疾病而死亡。将1 型呼肠孤病毒给小鼠作腹腔内接种,可于 57 天内致死, 并可由死亡小鼠的
23、各器官分离到呼肠孤病毒。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页,共 31 页 - - - - - - - - - 对新生仓鼠、雪貂、大鼠也会引起同样病变。将3 型病毒直接注入乳鼠脑内,可以使其发生坏死性脑炎和死亡。剖检中枢系统,可见病毒主要在神经原细胞内增殖,胶质细胞和室管膜细胞内显然不发生病毒增殖。此外,呼肠孤病毒对大鼠、小鼠还有致畸变作用。1 和 2 型呼肠孤病毒感染小鼠,病毒可通过怀孕鼠的子宫垂直传播,致胎儿或新生儿死亡。其它哺乳动物和人的呼肠孤病毒感染大多呈无
24、症状经过。第1 株牛呼肠孤病毒是由健康牛的粪便中分离获得的,至今已分离到50多个牛呼肠孤病毒株,包括1、2、3 等三个血清型。1 型最为常见。在某些国家的牛群中,阳性抗体率达 57% 。一般认为,牛在一岁以内普遍发生呼肠孤病毒感染,但不出现症状,牛在发生呼吸道疾病后, 呼肠孤病毒抗体的效价经常上升。1 型与 2 型混合感染对牛地方性支气管肺炎的流行起重要作用。给牛作呼吸道感染试验,虽然没有症状,但肺和其它组织中含有高滴度病毒,鼻液中也出现病毒,随后则可测出血清中较高效价的抗体。给不吃初乳的新生犊牛作人工感染,常可产生轻微的肺炎病变,但不象组织培养细胞那样形成胞浆内包涵体。马呼肠孤病毒的3 种血
25、清型均有发现,调查表明其抗体阳性率分别为1 型 29% ,2 型 19% ,3 型 61% 。1 型与 3 型可致马上呼吸道疾患,此外还可与马流感病毒一起引起咳嗽综合征。绵羊也存在3 个型的呼肠孤病毒,但抗体检测以3 型为主。用猪株呼肠孤病毒给6 周龄幼猪作经鼻接种,幼猪体温升高,血清中的血凝抑制抗体可增高4 倍以上。 犬呼肠孤病毒只分离到1 型,2 型与 3 型的抗体亦有阳性。用 1 型实验感染幼犬时发生间质性肺炎,抗体效价上升。猫呼肠孤病毒分离率最高的是3 型,人工感染可致温和的呼吸道症状。1 型是从猫的肿瘤细胞中分离所得的。人类的呼肠孤病毒感染十分普遍,3 种血清型均有发现,血清学调查的
26、阳性率很高,最重要的是1 型,但大多呈无症状经过。曾从普通感冒、脑炎、肝炎、脑膜炎、脑脊髓膜炎以及致死性肺炎患者体内分离到不同血清型的呼肠孤病毒。6. 诊断和防制应用敏感的组织培养细胞从发病早期的粪便、呼吸道分泌物、滑液或其它组织样品中分离病毒。为消除细菌和其它病毒的干扰,应视情况先将病料作5055加热或用乙醚、丙酮处理。根据特征性细胞病变核周围包涵体的出现,人工感染乳鼠致病,初步判定病料中是否有呼肠孤病毒存在。应用已知抗体进行鉴定:先以补体结合反应检测群抗原,随后再用中和试验或血凝抑制试验检测型特异性抗原。鉴于症状及病理剖解变化都不具特征性,诊断通常有赖于抗体的检测,现症病例的诊断,则需发病
27、期及康复期的双份血清。ELISA 的敏感性远远高于琼脂扩散和间接血凝试验,以纯化病毒为抗原,并且用高岭土处理血清,以排除非特异性反应,其结果与中和试验一致。对某些由呼肠孤病毒参与所致的疾病,可用灭活的呼肠孤病毒与其它抗原混合而成的联合疫苗进行预防。(二)禽呼肠孤病毒1. 病毒特征禽呼肠孤病毒具有典型的呼肠孤病毒形态,纯化的禽呼肠孤病毒只含有RNA和蛋白质,平均含量分别为187% 和 813% 。RNA中既有 ss 又有 ds,其中 ssRNA约占 RNA总量的 30% 。禽株RNA的含量高于哺乳动物株(14% ) ,这种差别归因于禽株含有ssRNA 。根据 SDS-PAGE 电泳迁移率的不同,
28、可将禽呼肠孤病毒的10 个 RNA节段分为三类,依次为L、M和 S。其中大节段L(L1、L2 和 L3)分子量为2410327103kDa;中节段 M (M1、M2 和 M3)分子量为1310317103kDa;小节段 S(S1、S2、S3 和 S4)分子量为0.68 1031.2 103kDa,与哺乳动物株比较稍有差异,但禽株S1 的分子量远远大于哺乳动物株。不同分离株(包括不同血清型和同型不同毒株)的dsRNA核酸电泳迁移有明显多样性,但与致病力无相关性。嗜关节性的S1133 株及其无致病力的疫苗株P100,它们的dsRNA节段在 SDSPAGE中的迁移型式完全相同,但蛋白质却有差别,推测
29、蛋白质的改变与毒力强弱和生长特性有关。应用更灵敏的核酸杂交试验表明疫苗株P100 的 dsRNA至少有 4 个节段发生了变化。不同于哺乳动物呼肠孤病毒,禽呼肠孤病毒不能凝集鸡、火鸡、鸭、鹅、人O型、牛、绵羊、兔、豚鼠、大鼠或小鼠的红细胞。只有两个例外报道。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页,共 31 页 - - - - - - - - - 禽呼肠孤病毒对热有抵抗力,能耐受60 8 10 小时, 56 22 24 小时, 37 15 16 周,22 48 51 周,
30、 43 年以上, -20 4 年以上, -63 10 年以上。半纯化病毒于60 5 小时条件下尚不能完全灭活,MgCl2 能增强病毒对热的稳定性,但浓度太大反而促进其灭活。对乙醚不敏感,对氯仿轻度敏感,对pH3 有抵抗力,室温下过氧化氢作用1 小时不能使其灭活;2% 苯酚部分灭活病毒,2% 甲醛在低温( 4)无效。对2% 来苏尔、 3% 福尔马林、 DNA代谢抑制物、放线菌素 D、阿糖胞苷、5氟2脱氧尿嘧啶有抵抗力。70% 乙醇和05%有机碘可灭活病毒。2. 抗原性禽呼肠孤病毒各毒株之间具有共同的群特异抗原,而与哺乳动物株和纳尔逊海湾病毒无交叉,这种共同的沉淀抗原可用琼扩或补结试验检测。使用血
31、清学方法可对呼肠孤病毒进行分类,或根据对鸡的相关致病性分群。Kawamura等将日本禽呼肠孤病毒77 个株应用蚀斑减数试验分为5 个血清型, Wood等( 1980)统计了来自美国、英国、德国和日本呼肠孤病毒的相关性,虽然在异源型毒株间有很大程度的交叉中和关系,但仍发现了11 个血清型。至目前为止凭借中和试验将禽呼肠孤病毒分为11 个血清型。由于交叉反应大量存在,因此有些群只能作为亚型而不作为独立血清型。Hieronymus 等 () 将 5 个吸收不良综合征的分离物分为3 个血清型,而 Robertson 和 Wilcox ( 4)将 10 个澳大利亚分离物分为三个有很大程度交叉反应的群。显
32、然,呼肠孤病毒经常以抗原亚型,而不是以独特的血清型存在。3 培养禽呼肠孤病毒很容易从禽源细胞培养物中分离。常用的细胞培养是禽原代细胞,包括鸡胚成纤维细胞、肝、肺、肾、巨噬细胞和睾丸细胞。最常用的是雏鸡肾细胞(26 周龄) ,分离火鸡株时可用火鸡肾细胞。Barta (1984)等一些学者认为,做蚀斑和分离病毒时,应选择鸡胚肝细胞。用各种方法分离本病毒的比较结果表明,以鸡肝细胞最敏感,其次为鸡肾细胞,而成纤维细胞敏感性最差。感染呼肠孤病毒的鸡源细胞培养物能够形成合胞体(一般在合胞体形成前细胞内产生空泡),细胞浆内有包涵体(初期嗜酸性,后变嗜碱性)。某些毒株亦可适应于许多哺乳动物细胞系,如在绿猴肾(
33、 Vero) 、乳仓鼠肾( BHK21 ) 、猫肾( CRFK ) 、Georgia 牛肾( GBK ) ,兔肾( RK)和猪肾( PK )细胞内生长,但大多数毒株只有在Vero 细胞中产生CPE 。经卵黄囊或绒毛尿囊膜接种,呼肠孤病毒容易在鸡胚内生长。初次分离选用卵黄囊接种,一般在接种后35 天鸡胚死亡,胚体因皮下出血而呈淡紫色。绒毛尿囊膜接种,通常在78 天后鸡胚死亡,绒毛膜上有隆起的、分散的痘疮样病灶,未死胚胎生长滞缓,肝淡绿色,脾肿大,心脏有病损。4 病原性1954 年, Fahey 和 Crawley 首次从有慢性呼吸道疾病的鸡呼吸道内分离到禽呼肠孤病毒,后来由Peter ()进一步
34、证实。当时用这种被称为 Fahey Crawley病毒,接种于易感鸡后,表现为温和性呼吸道疾病,病鸡的肝脏坏死并出现腱和滑膜的炎症。禽呼肠孤病毒流行于鸡、火鸡、鸭、鹦鹉和其它禽类,可水平传递亦可经卵垂直传递。已由多种疾病分离出该类病毒,包括病毒性关节炎、腱鞘炎、矮小综合征(Stunting syndrome) 、呼吸道病、肠病( Enteric disease ) 、吸收障碍综合征(Malabsorption syndrome )和骨质疏松征(Osteoporosis )等。患禽生长受阻,发生心包炎、心肌炎、心包积水、肠炎、肝炎,腔上囊和胸腺萎缩,骨短粗或出现急慢性呼吸道病。某些呼肠孤病毒株的
35、致病作用,由于柔嫩艾美尔球虫或巨型艾美尔球虫的协同感染而加强。鸡感染传染性法氏囊病病毒或在特殊的饲养环境下,能增高由WVV2937株感染所致腱鞘炎的严重性。呼肠孤病毒也能加剧由其它病原引起的疾病,如鸡贫血因子、大肠埃希氏杆菌和新城疫病毒。由于感染了呼肠孤病毒,使机体的免疫功能降低,导致对其它传染性病因的易感性增加。此外,在临床上未感染的鸡也常发现病毒。由禽呼肠孤病毒所致的最重要和常见的疾病是病毒性关节炎、腱鞘炎和吸收障碍综合征。三、环状病毒属( Orbivirus)名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 -
36、 - - - - - - 第 6 页,共 31 页 - - - - - - - - - 本属在某些形态、理化和生物学特性上不同于正呼肠孤病毒。正呼肠孤病毒经常含有两层衣壳,对热及酸性环境(pH30)具有强大抵抗力,不发生虫媒传播方式,而环状病毒虽有双层衣壳,外衣壳结构模糊,内衣壳由32 个大的环状壳粒组成,故称环状病毒。对热和pH3.0 的抵抗力不高,多数成员可在节肢昆虫和脊椎动物体及其细胞内增殖。病毒粒子呈二十面立体对称,直径为 6580nm ,核衣壳的直径为5460nm ,但无棘状突起,衣壳由32 个大型壳粒组成。病毒粒子的分子量为80106Da,S20W为 550,在 pH6 8 稳定,
37、感染性在pH30 丧失。在蛋白质存在下,病毒非常稳定,如由室温存放的血液中25 年后仍能重新分离出蓝舌病病毒。病毒基因组由10 个节段的双股RNA组成,节段分子量大小为0.5 1032.8 103 kDa,总分子量约 15103kDa,占病毒粒子重量20% ,G+C含量为 42% 44% 。有七条结构多肽,分子量为35103150103Da,占整个病毒粒子重量的80% 。主要核心蛋白是Vp3 和 Vp7,分子量分别为103Da和 38103Da,其中 Vp7 是存在于核心表面上壳粒的主要成分,核心也含有Vp1、Vp4 和 Vp6。外衣壳层含Vp2(MW=111 103Da)和 Vp5(MW=5
38、9103Da) 。有三种非结构蛋白NS1、NS2 和 NS3,分子量分别为644103、 41103 和 256103Da,其中 NS2 是磷蛋白。目前已知的成员根据其血清学的亲缘关系可分为12 个群,其中蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒、鹿流行性出血病病毒、茨城病病毒及科罗拉多蜱传热病毒5 个群对家畜致病(表19-1 ) 。没有检测到属特异性抗原,但可通过荧光抗体、免疫扩散和补结反应证实群内有共同的抗原。个别毒株呈现低水平交叉反应,通常被报道为血清群中的独特成员。表 19-1 环状病毒病的分群群的名称血清型生物媒介非洲马瘟病毒 19 库蠓蓝舌病病毒 124 库蠓鹿流行性出血症病毒 17 蚊马脑器质性
39、脑病病毒 15 库蠓Eubenangee病毒 13 白蛉Palyam 病毒 16 蚊Changuinola 病毒 17 蜱Corriparta病毒 13 库蠓Kemerovo病毒 120 Warrego 病毒 12 Wallal病毒 12 环状病毒在宿主细胞的胞浆内合成和增殖,进入宿主细胞脱去外壳需要依赖RNA的 RNA聚合酶活化。感染细胞内质网肿大,出现颗粒性近核包涵体,线粒体变形,同时常在胞浆内形成微管样构造。这种微管样构造可在蔗糖密度梯度上提纯;电子显微镜下观察,直径约50nm ,表面还有线状周圈性的微细结构,使整个微管样构造呈楼梯样外观。据生化学和抗原性分析,这种微管样构造由病毒特异的
40、非衣壳性多肽组成,至少有一种以上。成熟的病毒粒子也常与之粘附。敏感细胞感染病毒后,胞浆内形成包涵体。病毒粒子释出是挤出式而不是芽生。本属代表种为蓝舌病病毒,其它成员包括个血清群见表19-1 。还有一些未分群的毒株,包括Ife ,Japanant ,Lebombo ,LLano Seco ,Orunga,Paroo River,Vmatillam ,T50616(分离自臭鼬) 。(一) 蓝舌病病毒( Bluetongue virus)名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7
41、页,共 31 页 - - - - - - - - - 同义名:绵羊卡他热病毒,嘴疼病病毒,草原强直症病毒蓝舌病是绵羊的一种急性传染病,其特征是颊粘膜和胃肠道粘膜严重的卡他性炎症。病羊发热,大量流涎,并由鼻孔流出多量浆液性或粘液性鼻涕,干涸后结痂于鼻孔周围。舌、齿板、齿龈和颊粘膜充血肿胀,并出现瘀点,此后变为青紫色,蓝舌病的名称即由此而来。乳房和蹄冠等部位也常出现病变上皮脱落,但不发生水疱。死亡率5% 30% 不等。除绵羊外,牛及其它反刍兽也罹患本病,但症状较轻,死亡率也低。蓝舌病最早于1876 年发现于南非的绵羊,1940 年前本病仅限于撒哈拉以南的非洲大陆。到40 年代已蔓延至中东一些国家和
42、地区,例如塞浦路斯、叙利亚、伊拉克、土耳其、以色列和巴勒斯坦。其它国家亦已相继发现本病的存在。1948 年美国报道此病。 1952 年西半球首次在美国加州从绵羊体内分离到病毒,1959 年在俄勒冈首次从牛中分离到病毒,70 年代后期广泛分布于热带、亚热带国家。 19561957 年欧洲尤其是西班牙和葡萄牙流行。1978 年, Davies 报道在澳大利亚的库蠓体内分离到蓝舌病病毒。目前在热带和亚热带地区的绝大多数国家的易感动物中都可能感染蓝舌病病毒或与之密切相关病毒。我国的蓝舌病于1980 年在云南首先发现,并相应分离出蓝舌病病毒,从而确定了本病在国内的存在。1. 形态特征核衣壳的直径为536
43、0nm,但因衣壳外面还有一个细绒毛状外层,使病毒粒子的总直径提高到 7080nm 。病毒粒子在氯化铯中离心沉淀以后,绒毛层消失,原因不明。于电子显微镜下仔细观察,可见绒毛层中的绒毛似乎是由衣壳壳粒上延伸出来的。成熟的病毒粒子经常包围于一个外层囊膜样结构中。这种囊膜样结构可被醚或吐温80 除去,但病毒活性不受影响。因此人们认为,它们并非蓝舌病病毒必要的组成成分,而是由细胞膜 “抢来” 的细胞性物质,故又称为 “假囊膜”。图 16-2 蓝舌病病毒(横杠=100nm )自 Smale 等蓝舌病病毒的衣壳由32 个大型壳粒组成。壳粒直径为811nm ,呈中空的短圆柱状。2. 理化学特性蓝舌病病毒含有2
44、0% 的 RNA ,由 10 个片段的双股RNA组成。 RNA的分子量为118103kDa。在吖啶橙着染感染细胞时,特别是在感染后期,常可发现橘红色的包涵体,说明除双股RNA外,还有部分单股RNA的存在。 G+C含量为 43% 。蓝舌病病毒含有7 种结构多肽,包括4 种主要多肽和3 种次要多肽,组成外壳的Vp2 和 Vp5 由 RNA第 2 及第 5 节段编码,内壳Vp1、Vp3、Vp4 及 Vp6 由 RNA 第 1、3、4、9节段编码, 核衣壳内 Vp7 由 RNA第 7 节段编码。 FQ(11 。20,Y-WZ 3. 抗原性应用细胞培养或敏感实验动物进行中和试验和RNA杂交试验,已经证明
45、蓝舌病病毒至少有24 个血清型。 Vp7 是群特异性抗原,可用补结、琼扩或荧光抗体检测,Vp2 是型特异性抗原。蓝舌病病毒血清型在世界不同地区的分布见表19-2 。5. 病原性蓝舌病病毒主要感染绵羊,特别是羔羊。潜伏期约一周。病羊发热,高达42,精神沉郁,食欲丧失, 随后出现口鼻部典型的“蓝舌” 病变。 在发热后 57 天检查口腔, 可见粘膜上有多数糜烂,并常因胃肠道发生病变而出现血样下痢。头、耳和颔间组织和喉部经常发生水肿,并常因蹄部知觉层发生病变而出现跛行。病羊被毛断裂,甚至全部被毛脱落。急性期的死亡率为20% 30% ,该病的严重性依据病毒毒株、绵羊品种和局部生态学条件而不同。在非洲和欧
46、洲的某些严重暴发中,死亡率有时高达99% 。但在美国,死亡率一般不超过1% 7% 。美利奴品种的绵羊,特别是其羔羊,似乎对本病最为敏感,病死率在70% 以上。蓝舌病病毒可经胎盘感染胎儿,引起流产、死胎或胎儿先天性异常,严重时甚至可使整个羊群丧失一个产羔期的全部羔羊。Bwangamoi给 57 头母羊接种强毒力的蓝舌病病毒均在其妊娠第3542 天之间发现病毒于接种后67 天侵入胎儿, 10 12名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页,共 31 页 - - - - - -
47、 - - - 天后胎儿死亡。病理组织学检查证明蓝舌病病毒在肝上皮细胞和血管上皮细胞复制,成年绵羊毒血症有时超过28 天。病毒在牛体存在的时间还要长,但仅当公牛发生病毒血症时,能从公牛精液中分离到病毒,并经交配传播给母牛和犊牛。用含病毒的血液、血清或磨碎组织给绵羊接种,很易引起人工感染。Pini用 10 型蓝舌病病毒给绵羊作耳部皮下接种,随后每天扑杀1 头,检查组织中的病毒量,共11 天。平均潜伏期为69 天,最初的临床症状为发热。于接种后第4 天,可在头部淋巴结、扁桃体和脾脏中发现病毒,于接种后第6 天出现病毒血症,于接种后第8 天出现肉眼病变,该作者认为,病毒最先在局部淋巴结内增殖,随后经淋
48、巴或血流到达其它部位的淋巴组织,再行增殖,最后散布至全身各器官和组织。蓝舌病病毒几乎感染所有的反刍兽,包括家养和野生的,牛和山羊和某些野生动物(尤其是北美的白尾鹿)也可严重发病,症状和病变与绵羊相似。通常只有2% 10% 的牛感染后有临床症状,且大多比较缓和,可能发生长期持续的病毒血症。病变包括肺充血以及肌肉和结缔组织的出血和水肿,口和蹄部也可能有病变。心肌、骨骼肌出现弥漫性混浊肿胀和灶状变性,但组织学检查不易发现包涵体。Luedke 报道,用6 株蓝舌病病毒分别注射 6 组 18 头乳用山羊, 每头皮内和皮下接种蓝舌病病羊的抗凝血液4ml,结果 18 头山羊全部感染,并均由其血液中分离到病毒
49、。蓝舌病病毒可能使猪发生蹄部病变。脑内接种时,蓝舌病病毒可以适应于14 日龄乳鼠和乳仓鼠,适应株病毒在脑内的滴度较高,可用其制造补体结合试验的抗原。日龄较大者则不易感,多数耐过不死。风可能传播本病毒,造成远距离扩散。据兽医公报( 83) ,北非带毒的库蠓传到西班牙和葡萄牙,使绵羊发生了较大流行。6. 生态学蓝舌病多呈地方性流行,病的发生、流行与媒介昆虫的分布、习性和生活史密切相关,有明显的季节性,即以晚夏与早秋发病率最高。库蠓是蓝舌病病毒的主要传播媒介。当雌库蠓吸吮患畜的带毒血液后,其生活史长达70 天,每34 天吸血一次。病毒在感染的库蠓唾液腺和血腔细胞内增殖。在外环境中孵化710 天,病毒
50、就能在唾液腺中排泌,通过叮咬感染易感动物。库蠓多喜温湿泥区或牛粪,湿度对其生活史非常重要,但也发现一些种的库蠓存在于干燥区域,另外一些蠓在高浓度盐水中繁殖。南非淡翅库蠓(CPallide pennis ) 、 美国变翅库蠓(C.Varri pennis )为主要传播媒介。应用膜饲法或胸内接种,很易使库蠓发生蓝舌病病毒感染。Jennings 等(1980)应用胸内接种法使库蠓感染蓝舌病病毒,应用荧光抗体法可在头、胸和腹部检出病毒。病毒效价在 9 天内逐渐增高,在接种后第5 天就能可靠检出。有谓蓝舌病病毒可在库蠓体内增殖10000倍。 Luedke 等( 1976)应用库蠓作为媒介昆虫,在绵羊与绵
51、羊之间连续传了15 代,共13个月。 库蠓的感染率为37% ,而且由库蠓叮咬引起的感染,其临床症状甚至比用人工接种的绵羊更为严重。尚未证实库蠓经卵垂直传播。已有羊蜱蝇(Melophagus ovinus )可以携带并传播蓝舌病病毒的报道,但尚未证实蓝舌病病毒能在羊蜱蝇体内增殖。牛、山羊和鹿以及羚羊等野生反刍兽可能长期携带病毒,并在疾病流行的间歇期内扮演病毒储主的角色。 Luedke 等(1977)通过库蠓叮咬的方法使妊娠60 天和 120 天的小母牛发生蓝舌病,随后采血进行病毒分离。结果在感染50天和 100 102 天后可由1/3 2/3 的感染母牛血液中发现病毒(此时已出现中和抗体!) 。
52、10 头母牛中, 2头流产, 1 头产出死胎,其它7 头正常分娩,但7 头犊牛均有不同程度的结构或功能上的异常。 4 头犊牛(包括1 头死胎)在出生时血液中含有病毒(此时尚无中和抗体和沉淀抗体)。某些犊牛在6 个月内发生病毒血症。 Luedke 等还曾用库蠓传播方法由1 头隐性带毒牛将蓝舌病病毒传给绵羊,使其临床发病。7. 免疫病后康复动物对同型病毒具有很强免疫力,且持续几年。接种疫苗是防治本病的有效方法,目前普遍应用冻干的鸡胚化弱毒疫苗。这类疫苗分单价和多价两种,可根据各地流行的病毒血清型选用相应的疫苗。在非洲地区,由于几乎存在所有的血清型,因此必须应用多价疫苗。疫苗引起的免疫期可达1 年左
53、右。多价疫苗中各毒株之间的相互干扰,在一定程度上影响疫苗的免疫效名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页,共 31 页 - - - - - - - - - 力。而疫苗株在免疫原性上的差异和动物个体反应性的不同,可能也是疫苗接种效果不一致的原因。绵羊在接种弱毒疫苗后,经常发生病毒血症,例如Sawyer 等( 1977)应用组织培养细胞从疫苗接种羊的组织和胎儿中分离到疫苗株病毒。疫苗接种羊的病毒血症的滴度,有时高达足以感染媒介昆虫的程度。鸡胚化弱毒疫苗不能用于妊娠母羊,因其
54、可能导致死胎、胎儿脑及其它组织产生病变。这种疫苗还可能影响母羊发情,所以通常是在母羊发情前几周接种。每年注射1 次。于接种后 10 天左右出现免疫性。由于羔羊可经初乳获得母源抗体,故羔羊需在出生后3 个月以上才能进行疫苗接种,以免母源抗体影响自动免疫的效果。因为蓝舌病病毒是一种抗原多变的虫媒病毒,多价弱毒疫苗的广泛使用,可能导致基因型重组和毒力变异增强,所以灭活疫苗列为首选。Parker 等( 1975)应用 BHK21细胞培养蓝舌病病毒,并用丙内酯灭活,制成灭活细胞培养疫苗。试用于羊,据云可以引起良好的抗体反应。Shipham 等( 1976)应用亚硝酸、5氟尿嘧啶、硝酸胍和原黄素诱变,于2
55、8孵育 48 小时后,分离获得ts 株(即温度敏感株) ,但尚未见用作疫苗的报道。我国亦已应用羟胺灭活疫苗进行预防接种,据报道,收到较好效果。地方毒株弱毒疫苗的研制和试用工作亦在进行中。虽然已应用合成肽抗原和重组DNA克隆化方法制备亚单位疫苗,但目前尚未作为商品疫苗出售使用。(二) 非洲马瘟病毒( African horse sickness virus)同义名:马瘟病毒。1. 形态特征马瘟病毒的形态结构极象蓝舌病病毒。超薄切片中的病毒粒子直径为75nm,内有一个致密的核心,直径约50nm 。于负染标本内,病毒粒子的总直径为6080nm ,衣壳的直径约55nm ,由 32个壳粒组成。有时看到带
56、有细胞性囊膜的病毒粒子。所谓细胞性囊膜,是指囊膜全部来自细胞,不含病毒成分。甚至可在一个细胞源性膜样结构中看到大量病毒粒子的堆集。2. 理化学特性马瘟病毒含有双股RNA 。病毒粒子在氯化铯中的浮密度为125133g/cm3。马瘟病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐有一定抵抗力,抗胰蛋白酶。在pH610 之间稳定,但在pH30迅速灭活。 血液或血清中的病毒可以长期存活,在 4甚至室温条件下存活多年。将其混入等量的草酸盐石炭酸甘油保存液中,保存时间更长。血液或血清即使腐败,也不明显影响马瘟病毒的存活。60于 30 分钟内使其灭活。 保存病毒的适宜温度是4或 -70 ,马瘟病毒在 -20%-50 温度中较易
57、灭活。加入5% 蔗糖、 5% 乳白蛋白或蛋白胨以及健康血清,均有利于马瘟病毒的活存。01% 福尔马林能在22条件下在48 小时内杀死马瘟病毒。在制备马瘟病毒的灭活抗原时,经常应用 01% 04% 丙内酯。某些毒株感染鼠脑的抽提物能够凝集马的红细胞,红细胞凝集的最适条件是pH64、37孵育 2 小时。3. 抗原性应用中和试验和血凝抑制试验可将马瘟病毒分为9 个血清型,推测在非洲其它地方还存在其它血清型。但是这些血清型并不彼此泾渭分明,经常在血清学反应或免疫保护力上呈现某种程度的交叉反应,因此有人认为,各型马瘟病毒可能具有同样的抗原成分,仅其含量明显不同而已。已在非洲发现所有的9 个血清型,但在某
58、一地区,则常以1 个或 2 个血清型为主,例如阿尔及利亚的马瘟流行暴发,主要是由第9 型引起的。补体结合试验呈群特异性,可以测出各型马瘟病毒共有的特异性抗原。琼脂扩散试验也是群特异的,通常出现2 条或 2 条以上的沉淀线,因此必须应用同样制备的对照阴性抗原进行对比观察。4. 病原性马、骡、驴是马瘟的主要自然感染者,能使感染的动物死亡。马最敏感,骡次之,发病率高,致死率低。驴有一定抵抗力,仅出现温和的发热反应。斑马则完全不易感,可能系隐性名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第
59、10 页,共 31 页 - - - - - - - - - 带毒者。皮下注射01% 毫升的含毒血液,即可引起感染。静脉、脑内、腹腔和乳房内注射的结果相同。实验感染的潜伏期通常为57 天,自然感染的潜伏期为310 天,但也可能稍为缩短或延长至半个月以上。马瘟在临床上习惯地分为四个类型,即发热型、肺型、心型和混合型。ZZ(发热型 ZZ) 为轻症感染,体温升高,最高可达41,持续58 天,随即恢复正常。最常见于驴和未完全免疫马群受到同种病毒的感染时。只有部分病马呈现轻度症状,如食欲不振,结膜潮红,呼吸困难和脉搏增快。ZZ( 肺型 ZZ) 为最严重的病型,体温急骤上升,高达41或以上,呼吸加快,每分钟
60、70 次左右,并出现急性肺水肿的症状:前腿分开、头颈伸长、鼻孔扩大、大汗淋漓、阵咳后排出淡黄色和泡沫状鼻涕。病畜可在数小时内死亡。主要病变是肺水肿和胸腔积水有时可达几千毫升,并有严重的组织胶样浸润。常见于易感马群感染强毒株时。ZZ( 心型或亚急性型ZZ) ,潜伏期 714 天,典型病变是皮下、浆膜下组织和肌间组织的水肿性浸润,心包大量积液,可达2 000毫升,心外膜上有弥漫性出血点,心肌出血,心冠脂肪水肿和有点状出血。临床表现为体温升高,持续3 6天,继则眼窝和眼睑水肿,并向颊部、颔间和颈部扩展。病畜呼吸困难,脉搏快速。多因缺氧和心脏病变而突然死亡。ZZ( 混合型 ZZ) 又称 ZZ( 心肺型
61、 ZZ) ,具有上述各型的症状,多在尸体剖检时发现心、肺变化。死亡率高达50% 。Amjadi (1971)报道在人工感染驹的肾上皮细胞内发现大量嗜伊红性胞浆内包涵体。死亡率因病型而不同。严重暴发时高达 90% ,但一般不超过25% 30% 。山羊和斑马的感染性不高,但病毒在灰色斑马持续存在的时间长。给犬静脉或皮下注射强毒材料或者喂饲大量病马组织,可以使其发生感染,并产生短暂的病毒血症。但对马瘟流行地区的犬作血清学检查,却证明犬极少发生自然感染。雪貂在静脉接种马瘟病毒后体温升高,但无其它明显临床症状。牛、绵羊和家兔没有感染性。人及禽类也不感染马瘟。等()从头大象中检测到抗体。脑内接种马瘟病毒可
62、使小鼠、大鼠、豚鼠及其它的实验室常用小啮齿类动物发生感染。由自然感染病马分离到的病毒呈嗜内脏性,病毒广泛分布于病马的各种脏器和血液中。但用连续脑内传代的方法使上述病毒适应于鼠脑,可以使其变为嗜神经性病毒。这种经鼠脑继代的病毒对小鼠的毒力增高,26 日龄鼠脑内接种后出现脑炎症状,但对马的致病力减弱,然而仍保持其抗原性。6. 生态学马瘟不直接由病马传染给健康马,必须通过媒介昆虫叮咬病马、骡等动物才能传播。库蠓是马瘟病毒的主要传播者,曾多次从库蠓体内分离到病毒。Mellor等( 1975)应用胸内接种和喂饲含毒血液的方法使库蠓发生人工感染,并能传播病毒,证明库蠓是生物学带毒者。在土耳其,虻和螯蝇被认
63、为是马瘟病毒的传播者。Ozawa等(1965)应用按蚊和库蚊成功地传播了马瘟病毒。虽然病后恢复马可能带毒90 天,但在没有蚊、蠓等媒介昆虫存在的季节,马瘟病毒是怎样持续存在和越冬的 ?这是至今没有阐明的问题。有人推测可能存在一种或几种可以作为病毒储主的野生脊椎动物。于春夏季节,新羽化的库蠓或其它媒介昆虫在叮吸这些储主的血液时遭受感染。经库蠓等媒介昆虫越冬的可能性,尚未获得实验证据。传染媒介的控制,可用杀虫剂在马匹安定而吸血昆虫最活跃的夜间进行。7. 免疫四、轮状病毒属( Rotavirus )同义名:双层病毒(Duoviruses )轮状病毒是各种幼龄动物非菌性腹泻的主要病原之一。最早于 19
64、68 年由 Mebus 等在美国内布拉斯加州一农场犊牛腹泻病例中发现,欧、美洲各国以及澳大利亚、新西兰和日本等都发现了牛轮状病毒引起的犊牛腹泻,澳大利亚和英、美等国均报道有轮状病毒引起的仔猪腹泻。此外,在绵羊、山羊、幼驹、鹿以及兔和小鼠等也有发生轮状病毒性腹泻的报道。小鼠的流行性腹泻就是名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页,共 31 页 - - - - - - - - - 轮状病毒引起的。鸡和火鸡等多种禽类中亦有轮状病毒感染的存在。我国亦有猪、牛、羊、犬和多种禽类
65、等轮状病毒感染的报道,并已发现或分离鉴定了病毒。轮状病毒感染引起严重的经济损失。以英国为例,犊牛轮状病毒性腹泻的发病率为60% 80% ,死亡率为 0% 50% ,1% 4 周龄仔猪群的发病率超过80% ,死亡率7% 20% 。轮状病毒感染引起的腹泻是一种世界性传染病。据初步统计, 全世界幼儿发生的肠炎至少有50% 是由轮状病毒引起的。该属代表种为人轮状病毒,其它成员包括从人、牛、小鼠(EDIM ) 、豚鼠、绵羊、山羊、猪、猴(SA11) 、马、羚羊、北美野牛(Bison ) 、鹿、家兔、犬、禽的分离株。1. 形态特征病毒粒子略呈圆形,具有双层衣壳。直径为6575nm 。中央为一个电子致密的六
66、角形核心,直径3740nm 。周围绕有一个电子透明层。轮状病毒曾被描述为类呼肠孤病毒,但可根据它们清晰明确的光滑外缘与呼肠孤病毒相区别。壳粒由此向外呈辐射状排列,构成内衣壳。外周为一层由光滑薄膜构成的外衣壳,厚约20nm ,外衣壳可能是在内质网膜上芽生时获得的。以核心为毂,以呈辐射状排列的内衣壳为轮辐,以外衣壳为辋,构成了特征性的轮状结构。轮状病毒这一名称,就由此而来。有关轮状病毒的超微结构,学者们的意见尚不一致。曾提出过内衣壳有个、个、个、个、个壳粒构成呈面体排列的多种模型。Martin等( 1975)认为轮状病毒与环状病毒一样,也有32 个大的环形壳粒,且其180 个三联亚单位按T=9方式
67、组成20 个三角面体。每个三联亚单位包含3 个结构单位,所以一共有540 个结构单位。但据Esparza(1978)报道,轮状病毒表面有162 个孔,由 320 个三联亚单位按T=9方式组成20 个三角面体。因每个三联亚单位包含三个结构单位,所以一共有960 个结构单位。图 69-3 轮状病毒(横杠=100nm ) - 自杨盛华出现上述不同的观察结果,也许是标本制作方法不同的缘故。现公认轮状病毒为二十面体,三角剖分数 T=13。Stannard等( 1977)对乳鼠流行性腹泻轮状病毒和猴轮状病毒SA11 株进行了细致的电子显微镜观察,发现其内衣壳有180 个形态亚单位,排列成晶格状。12 个顶
68、各为一个空隙,由 5 个壳粒围绕,另外80 个空隙各由6 个壳粒围绕。外衣壳由蜂窝样的晶格组成,且与内衣壳的晶格排列相符。 Stannard还绘制了一幅有关轮状病毒衣壳结构的模式图,见图1-4。除完整的病毒粒子(称为光滑型,即S颗粒)外,还常可以见到没有外衣壳的病毒粒子,称为粗糙型,即R颗粒。形成无感染性的或感染性差的单层衣壳壳粒,这种颗粒,比完整病毒粒子小,其出现的相对频率甚低,但已发生在鸡、仔猪、犊牛和人类的感染中,约占仔猪轮状病毒感染的,而在牛则低至。此外还有空衣壳。在已感染的小肠上皮细胞的胞浆内,常有无定形的毒浆(viroplasm )和微管样结构(其表面形态与病毒粒子相同),可能是病
69、毒衣壳异常合成的产物。图 16-4 轮状病毒衣壳结构模式 ( 自 Stannard) 2. 理化学特性轮状病毒粒子和核心在氯化铯密度梯度中的浮密度分别为136138g/cm3 和 144g/cm3。S20w=525。病毒由 11 个节段的双链RNA组成, 大小为 06 10333103kDa。以 Nebraska 株轮状病毒为例,各节段的分子量分别为221、185、170、155、100、082、051、051、026、020 和 020103kDa。RNA占病毒粒子重量的12% 15% 。短的保守序列全在5末端。轮状病毒的个节段,在聚丙烯酰胺凝胶电泳后,易于分开,形成特定的电泳带组合模式,即
70、电泳图型模式,简称电泳型。这条带分为个区段。常见的动物和人的轮状病毒的个区段中,各带的排列名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页,共 31 页 - - - - - - - - - 位置为 2 32,统称群。根据第和第节段之间距离的长短,又分长型和短型。后来又发现了一些新的轮状病毒,其电泳型与群不同,称为、和群,见表19-3 和图 19-5 。表 19-3 轮状病毒分群特征群群特异性抗原电泳型宿主 ABCDEFABCDEF 42 324 2234322522 242
71、233 332 多种动物和人猪、牛、大鼠、中国成人、小儿小儿、猪禽猪禽尽管不同的血清型可能呈现相似的电泳型,而同一血清型又可能显示不同的电泳型,但国内外迄今还常应用电泳分型法作为鉴定轮状病毒的主要手段。图 19-5 轮状病毒RNA的电泳型A. 常见轮状病毒,长型,423 2 B. 常见轮状病毒,短型,423 2 C. 非典型轮状病毒,52 22 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳,可在不同毒株间发现RNA节段的电泳迁移图谱有一定程度的差异,不同种动物的轮状病毒之间的差异更明显。其中最重要的是根据第10 和 11 节段之间距离的长短划分的所谓长型与短型。一些A群轮状病毒具有血凝性,例如牛NCDV 株能凝集人
72、O型以及豚鼠、马、绵羊等红细胞。绵羊和人株能凝集鸡、绵羊、兔、豚鼠及人的红细胞。我国江苏省的分离株能凝集豚鼠、马、人O型、绵羊及犊牛红细胞。最适pH7274,温度为37,血细胞浓度为 05% 。血凝和血凝抑制试验亦可提供一种毒株分类方法。轮状病毒对环境因子和许多常见消毒剂如碘附和次氯酸盐有较强的抵抗力,能耐受乙醚、氯仿和去氧胆酸钠处理而不影响其感染性。对酸( pH30)和胰酶稳定,56 30 分钟使其感染力降低2 个对数。 1mol/L MgCl2 不能增高其对 56 60 分钟的稳定性。粪便中的病毒在1820室温中,经7 个月仍有感染性。能耐1%甲醛 1 小时以上。 10聚维酮碘 (povi
73、doneiodine ) 、 乙醇和6氯胺是有效消毒剂。总的说来,蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶,能增强轮状病毒和正呼肠孤病毒的感染性,由于轮状病毒对外界环境因素及消毒剂作用有抵抗力,所以当清洗和消毒畜禽舍时必须注意到这个特点。3. 抗原性病毒粒子表面有种抗原,即群抗原、中和抗原及血凝素抗原。群抗原与多种结构蛋白有关,主要是由第6 节段编码的内壳蛋白Vp6;中和抗原主要是由第9 节段编码的外壳糖蛋白Vp7;血凝素抗原是由第4 节段编码的外壳蛋白Vp4,可被蛋白水解酶水解。不是所有的轮状病毒都有血凝素。根据群抗原的差异及病毒RNA末端指纹图的分析将轮状病毒分为AF 6 个群。绝大多数哺乳动物轮状病毒,
74、具有一种相同的群抗原。这些轮状病毒被命名为A 群或典型轮状病毒,包括大多数哺乳动物和禽A群轮状病毒,是研究的主要对象。BF 群只在原代宿主上生长,为非典型轮状病毒或副轮状病毒(pararotavirus) ,缺乏共同抗原,其基因片段只有第5、7、9 节段 RNA ;其中 B群出现在人、猪、牛、绵羊和大鼠,在我国发现的成人轮状病毒是重要代表;C群在猪,很少见于人, D群和 F 群在禽, E群在猪。禽轮状病毒与哺乳动物无抗原相关性。尽管用免疫荧光、ELISA、补结试验、琼扩等方法检测群抗原,但同群轮状病毒仍有不同的抗原。此种抗原可用血清中和试验或蚀斑减数中和试验鉴别。根据中和抗原Vp7 的差异可将
75、A 群轮状病毒分为14 个血清型,分别用阿拉伯数字G1 11 标记;依据Vp4 差异大约有个血清型,标记为p18,它们间有部分抗原交叉。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页,共 31 页 - - - - - - - - - 5. 病原性小日龄的幼畜最为易感,症状也较严重。成年人、畜血清中的抗体检出率高达40% 100% ,大多呈隐性感染。畜、禽群一旦发生本病,随后将每年连续发生,这是因为轮状病毒在体外具有较强的抵抗力,而且隐性感染的成年动物不断排出病毒的缘故。腹泻
76、是本病的主要症状,严重者带有粘液和血液,部分病例因严重脱水和酸碱平衡失调而死亡。病毒感染主要局限于小肠,特别是其下2/3 处,即空肠和回肠部。病毒对小肠上皮细胞有极强的偏嗜性,幼畜在感染数小时后小肠绒毛萎缩、柱状上皮细胞脱落,从而使肠道分泌和吸收机能失调。利用轮状病毒实验感染鸡和火鸡进行的免疫荧光研究表明,病毒增殖的主要部位是小肠成熟绒毛吸收上皮细胞的胞浆。绒毛的上1/3感染细胞较多。少量感染的细胞也见于结肠上皮、盲肠和某些绒毛的固有层。腺胃、肌胃、脾、肝或肾中未见到免疫荧光。轮状病毒宿主范围甚广,已知的有人、小鼠、牛、牦牛、猪、绵羊、山羊、马、犬、猫、猴、羚羊、鹿、兔、鸡、火鸡、雉鸡、鸭、珍
77、珠鸡、鹌鹑、鸽和情侣鹦鹉等。各种动物的轮状病毒都对各自的幼龄动物呈现明显的病原性。成年动物大多呈隐性感染经过。人的轮状病毒能够实验感染犊牛、猴、仔猪、羔羊,并可能引起临床发病;但不能使小鼠和家兔感染发病。牛轮状病毒和鹿轮状病毒也能感染仔猪。猪轮状病毒似乎只能使仔猪感染发病。分离自火鸡和雉的轮状病毒可感染鸡。没有迹象表明,禽类轮状病毒可感染哺乳动物,反过来也是一样。Woode等( 1978)用无菌猪作试验,猪轮状病毒引起的新生仔猪死亡率为100% ,57 日龄仔猪的死亡率为5% 30% 。犊牛最早在出生后12 小时发病,迟的数周,一般以17 日龄犊牛发病最多。有趣的是,尽管发生于火鸡、鸡、雉鸡和
78、鸭的绝大多数自然感染者是6 周龄以下的禽类,但较大的鸡( 56119 日龄)和火鸡(112 日龄)对实验感染的敏感性却较初生几周的雏禽高。感染动物可产生血液循环抗体及肠道分泌抗体,血清中的抗体水平和对感染的抵抗力并不相关。而在感染中起保护作用的是肠道局部的SIgA,能中和轮状病毒。在大多情况下,肠道感染后的回忆应答时间短。如人工感染猪天后用同样的猪轮状病毒攻毒,可获得完全保护,但天后不能抵抗重复感染。人轮状病毒感染后很快出现特异性抗体,IgM 在感染后510 天效价最高, IgG则在感染后1520 天时达高峰。 犊牛在感染后第3 天即可检出肠道的分泌抗体,能维持约40 50天,再次感染时可再分
79、泌30 40 天。 猪感染后天就能检测到轮状病毒粪抗体(Coproantibody) 。鸡和火鸡口服接种轮状病毒时,早在感染后46 天即出现血清抗体的应答。母乳中的抗体滴度及持续时间因动物的种类及免疫状况而异。6. 免疫人用口服轮状病毒活疫苗可使儿童获得保护。美国已有用于犊牛的冻干弱毒疫苗。弱毒毒株是牛轮状病毒经牛胎肾细胞传200 代以上 (最后 60 代培养于 29 30)减毒培育而成的。对刚出生而尚未吮吸初乳的新生犊牛,经口给予融化后的疫苗4ml,可使发病率明显降低,即或发病,症状也较轻微。可能是因疫苗株病毒首先感染了小肠粘膜上皮细胞,从而能够阻止随后的强毒感染,而在疫苗接种后57 天,又
80、将产生局部抗体。但学者们对于轮状病毒弱毒疫苗对其它血清型的感染是否有保护作用?是否会转变成强毒株?颇为关注。但据轮状病毒免疫的现有知识表明,口服活的致弱疫苗或许会比经非肠给予灭活疫苗更为有效。另一种免疫方法是用灭活疫苗给母畜作免疫注射,通过乳汁免疫,保护新生仔畜。已经明确,初乳抗体能够防止腹泻或降低其剧烈程度。据测定,牛羊在产后第1 天,初乳中抗体含量最高,产后3 天迅速下降至不可测出的水平。用甲醛灭活的牛轮状病毒疫苗5ml 给分娩前6090 天的母牛作皮下注射,分娩前30 天再作第2 次注射,也可降低新生犊牛的发病率。Gastrucci等(1989)采用油包水佐剂疫苗免疫注射妊娠最后一月的母
81、牛,测得母牛初乳中的中和抗体效价为12 560 ,直至产犊后5 天牛奶抗体水平仍未明显下降,而未免疫母牛在初乳中含有极低效价的抗体(140 以下) 。与牛、羊乳中抗体持续时间很短的情况相反,Bohl (1978)发现,猪的初乳和常乳中具有相当高的抗体效价,即使是在泌乳后期采集的乳标本中,中和抗体效价也常超过11 000 。测定 67 个农场的268 头母猪,除1 头外,抗轮状病毒的中和抗体效价均高于164。由此证明, 多数母猪的初乳和常乳能给未断乳仔猪提供不同程度的被动保护。仔猪的轮状病毒性腹泻大多发生于1023 日龄幼猪,更小的猪可能因有充名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - -
82、 - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页,共 31 页 - - - - - - - - - 分的乳源性免疫力而较少发病。许多学者建议给母猪作免疫注射,通过提高初乳免疫的途径,预防仔猪的轮状病毒性腹泻。就单胃动物来说,乳中的 IgA 抗体可能比IgG 更为有效。 因为乳中 IgA的浓度较高,且对酶的降解作用具有较大以G6号玻璃滤器或孔径为02m的滤膜过滤。收集滤液,以38 000r/min离心沉淀90 ()病毒核酸电泳法用于直接检测轮状病毒感染,并同时能鉴定出病毒基因组的电泳型,是研究轮状病毒分类学和流行病学的最常见方法
83、。通常将病料或感染的培养物冻融处理后,经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样品后,从轮状病毒中提取进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(),银染,根据病毒节段的数目及图式即可作出判断。血清学分析一般检查不出同一型轮状病毒的微小差异,但法可以检出。如果粪样中病毒含量高,应用下述简单的核酸提取方法,也可获得满意的电泳鉴定结果。取粪液025ml,加入 Eppendorf 管中,再加等量溶液,振荡混合秒钟,立即加入苯酚氯仿混合液05ml,如上振荡混合。 r/min离心沉淀分钟,吸取上层水相,即为核酸样品,立即进行电泳。加样时,取核酸样品 l ,加样品稀释液l ,混匀后即将Eppendorf管放入水浴加热分钟,随后滴
84、加凝胶板。电泳电压为或用电流量,电泳小时后用乙醇、乙酸固定分钟,并以硝酸银染色后观察。五、 COLTI 病毒属 (Coltivirus) 科罗拉多蜱传热病毒(Colorado tick fever virus) 科罗拉多蜱传热病毒为COLTI 病毒属的代表种,原属于环状病毒属。由于其对人有致病性,病毒核心的衣壳表面结构不同于典型的环状病毒,尤其是病毒基因组由个双链节段而不是环状病毒的个节段组成,核酸总分子量kDa,远比环状病毒(kDa)大,故单列为一属。该属成员除科罗拉多蜱传热病毒外,还包括Eyach 和 Eyach 血清型的变异株Ar和Ar。可能的成员有印度尼西亚的JKT6433、JKT69
85、69、JKT7041、JKT7075 分离株以及中国分离株M14 、HN59 、HN131 、HN199 、HN295 。本病毒能致山区和高原地区人类的轻型热病,表现为体温升高、颤抖、头痛及背部肌肉疼痛,恶心和呕吐,患者能完全康复。急性期有病毒血症。潜伏期一般为天,病程天。近年来从我国云南西双版纳无名热及病毒性脑炎病人中分离的病毒()以及从海南省三带喙库蚊中分离的株和麻翅库蚊中分离的株()等分离株,经核酸电泳,其分节段。此外,从当地猪、牛血清中也分离到病毒,且在我国热带、亚热带分布广泛,初步鉴定这些分离株很可能是病毒属成员。本病毒见于美国和欧洲,但也可能存在于印尼和中国。1. 形态和理化学特性
86、科罗拉多蜱传热病毒为球形颗粒,由致密的核心和包围着核心的双层衣壳组成,直径为 nm 。病毒对酸( pH )和热(,秒种)均敏感,pH30 能使病毒感染性丧失,乙醚等脂溶剂能降低其感染性。病毒核酸由个节段的双股组成,0 分子量分别在024 10325103kDa,总分子量为18103kDa。病毒蛋白的结构不清楚。2. 抗原性在迄今分离到的所有病毒株中,已知有两个血清型,分别代表美国北部的分离株和欧洲分离株(Eyach) 。年从美国科罗拉多、洛基山等地蜱和病人血液分离到多株不同基因型变异株,在年分离的株病毒有两株的基因带型不同于年分离株。由于本病毒具有多节段双链基因组,易于发生不同基因型病毒的重组
87、,从而产生不同的变异株。3. 培养和生态学本病毒可在多种脊椎动物和昆虫细胞中复制。已报道的有人、鹿、仓鼠、吮乳或成年小鼠、硬蜱、蚊子以及多种人类细胞系。从牛、猪体内也分离到中国株。安德逊革蜱是主要生物传播媒介,蚊子也可能有传播病毒的作用(印度尼西亚分离株)。松鼠和金花鼠是病毒贮主。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页,共 31 页 - - - - - - - - - 六、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus )同义名:水生动物呼肠孤病毒(Aquatic an
88、imal reovirus) 1979年 Meyers 从美国牡蛎中分离出呼肠孤病毒(1p) ,年Winto 等从大马哈鱼分离出呼肠孤病毒(CSV ) ,年 Nagabayashi等从日本牡蛎中分离出JOV1 病毒,年 Winton等再次从种鱼类(Notemigonus Crysoleueas , Oncorhynchus keta 和Ictalurus punctatus )以及美国牡蛎中分离出种呼肠孤病毒。我国学者(3)从草鱼出血病中分离出一株草鱼出血病病毒,并鉴定为呼肠孤病毒科中的新成员。这些从鱼类及贝类发现的呼肠孤病毒,它们有一些共性,即病毒外观相似于正呼肠孤病毒,粒子直径nm 左右,
89、核心约 nm 。在氯化铯中浮密度 gcm3,能抵抗乙醚和蛋白酶处理而感染性不受影响。双股基因组有个节段,分子量为0310325103kDa,总分子量15103kDa。分类,即个L,个,个。有种主要结构蛋白,分子量103 103Da。至少还有种次要的病毒蛋白存在。病毒在胞浆内复制,可能类似于正呼肠孤病毒复制方式。病毒宿主范围包括变温脊椎动物和无脊椎动物(贝壳类)。能在鱼类细胞系中有效增殖,在某些鱼类细胞上能形成蚀斑或合胞体。病毒呈水平传播,尚未发现任何生物传播媒介。鉴于上述特点,它们不同于已知呼肠孤病毒科中任何一属,曾建议提名为水生动物呼肠孤病毒属(Aquatic animal reovirus
90、) , 现正式归为一属。 该属代表种金体美鳊鱼病毒( Golden shiner virus ) 。此外,还包括p呼肠孤病毒、大马哈鱼呼肠孤病毒(Chum salmon virus ) 、鲇鱼呼肠孤病毒( Channel catfish reovirus ) 。还可能包括有鲤属鱼呼肠孤病毒(Tench reovirus) 、圆鳍雅罗鱼呼肠孤病毒( Chub reovirus ) 、银大马哈鱼呼肠孤病毒(Coho salmon reovirus) 、文蛤呼肠孤病毒( Hard clam reovirus ) 、草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus )即草鱼出血病病毒、大菱鱼呼肠
91、孤病毒(Turbot reovirus) 。属中除草鱼呼肠孤病毒(草鱼出血病病毒)外,其它均无重要的致病意义。 ( 一) 草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus)同义名:草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus) ,鱼呼肠孤病毒。草鱼出血病主要危害10cm 左右的当年草鱼(月龄),死亡率可达,二龄草鱼也易感,成年草鱼则为无症状感染。感染鱼游泳异常,继而离群独处,或漂游水面,或沉卧池底,或剧转打圈,多在出现上述症状后一天内死亡。病死鱼体色深暗,眼球突出,全身出血、充血。临床表现通常可分三型:即以肌肉充血为主的“红肌肉型”;以鳍基及鳃瓣充血为主的“红鳍
92、红鳃型” ;以肠道严重出血为主要特征的“肠炎型”。以上三型往往混合出现。本病是我国最主要的鱼病之一,遍及我国南方各省,当水温超过时广为流行,一般多在月,月为高峰,造成严重的经济损失。最早于年在湖北发现,起先怀疑其病原为气单胞菌,后来证实为病毒,曾有疱疹病毒之说,年确定为呼肠孤病毒,现定名为草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV ) 。我国科技工作者经过十余年的不懈努力,在病原、诊断和免疫预防方面做了大量的工作,令人瞩目。19年以来,从江浙等地以出血症为特征的草鱼中还分离到另一种不同于呼肠孤病毒的类似小RNA病毒的病毒。1. 形态和理化学特性草鱼出血病病
93、毒直径nm ,双层衣壳,外衣壳厚约nm,内衣壳 52nm 。超薄切片可见病毒粒子在胞浆中呈晶格状排状。基因组为双股, 分 11 个节段,总分子量约15103kDa;聚丙烯酰胺凝胶电泳图型为33 32,可因毒株不同有所差异,分子量在 0310331103kDa。有种主要结构多肽,分子量32103137103Da 。蔗糖浮密度130g/cm3,氯化铯浮密度137g/cm3。病毒对酸( pH3) 、碱( pH10)及热( 56,min)均稳定,对氯仿和乙醚不敏感。组织中的病毒在- 保存两年仍有活力。未发现有血凝名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - -
94、- - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页,共 31 页 - - - - - - - - - 活性。2. 抗原性草鱼出血病病毒与其它已知国外分离的鱼类呼肠孤病毒,如大马哈鱼呼肠孤病毒、金体美鳊鱼病毒等无抗原性交叉。至于毒株间是否存在着抗原性差异尚待研究,用特定毒株制备的疫苗对不同地区的免疫效果可有差异,提示可能存在着不同的血清型。毒株血清型与电泳型之间的关系及其在流行病学上的意义同样有待阐明。呼肠孤病毒科(Reoviridae)导源于呼肠孤儿病毒(Respiratory enteric orphan virus ) ,意即既能感染呼吸道,也能感染胃肠道的一类
95、病毒,它们的致病性尚不清楚。这类病毒原先归于ECHO病毒,为ECHO10。但是,进一步研究表明它的毒粒不仅比ECHO 病毒要大,而且能形成特征性的胞浆内包含体。 这种含有病毒特异性抗原的包含体用丫啶橙染色时,与细胞 DNA 一样呈绿黄色,而不是象通常的单链RNA 呈红色。由于这一现象导致了呼肠孤病毒基因组是双链RNA 这一重要发现,第一次说明双链RNA 可作为稳定的生命形态存在于自然界。迄今,已知呼肠孤病毒科是一个庞大的病毒科,它有150 个以上成员,在自然界广泛存在于脊椎动物、非脊椎动物和植物。一、呼肠孤病毒科的分类呼肠孤病毒科包括6 个属以及1 个未定名的属。(一)呼肠孤病毒属(Reovi
96、rus) ,或正呼肠孤病毒(Orthoreovirus )代表株为呼肠孤病毒I 型。其它成员包括从人、猴、狗和牛分离的呼肠孤病毒1、2、 3 型,以及从禽分离的Crawley、Nelson Bay 等。(二)环状病毒属(Orbirirus )代表株为兰舌病毒(Blue tongue virus ) 。其它成员包括11 个血清型:1.兰舌病毒亚属(Blue tongue subgroup) (库蠓属)。兰舌病毒有21 个血清型。2.Eubenangee亚属。包括Eubenangee(蚊) ;Pata(蚊) ;Tilligerry (NB7080)蚊。3.Corriparta 亚属。包括Acado
97、(蚊) ;Bambari;Corriparta(蚊);Jacareacanga 。4.Changuinola 亚属。包括BeAr35646 (白蛉);BeAr41067 (白蛉);BeAr54342 (白蛉);Changguinola(白蛉);Irituia 。5.Kemerovo 亚属。包括Baku(壁虱);Bauline(壁虱);Cape Wrath(壁虱); Chenuda(壁虱) ;Fin, Great Island(壁虱);Huacho(壁虱);Kemerovo(壁虱);Kena; Lipovnik (壁虱);Mono Lake(壁虱) ; Mykenes (壁虱); Nugget(
98、壁虱);Okhotskiy (壁虱);Poovoot; Seletar(壁虱);Sixgun city (壁虱);Tindholmur (壁虱);Tribec(壁虱);Wad Medani (壁虱);aquina Head(壁虱) 。6.Palyan 亚属。包括Abadina(库蠓);D Aguilar (库蠓);Kasba(蚊) ;Nyabira; Palyam(蚊);Vellore(蚊)。7.流行性鹿病亚属(Epizootic disease of deer subgroup) 。包括 EHD, New Jersey; EHD, Can Alberta; IbAr22619; IbAr33
99、853; Ibaraki。8.Warrego 亚属。包括Mitchell River (MRM10343 ) (库蠓);Warrego Ch9935(库蠓)。9.Wallal 亚属。包括Mudginbarry ;Wallal(CH12048 ) 。10.非洲马病亚属(African horse sickness) 。包括 9 个血清型。11.马退行性脑病(Equine encephalosis) 。包括 5 个血清型。12.未分属的。 包括 Ife, Japanant, Lebombo, Llano Seco, Orunga, Paroo River, T 50616(臭鼬分离) ,Umati
100、lla 。可能成员还有家兔融合细胞病毒(Rabbit syncytium virus ) 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 17 页,共 31 页 - - - - - - - - - (三)轮状病毒属(Rotavirus)代表株为人轮状病毒(Human rotavirus ) 。其它成员包括从人,牛,小鼠(EDIM ) ,豚鼠,绵羊,山羊,猪,猴(SA11) ,马,羚牛,北美野牛(Bison) ,鹿,家兔,狗和鸭的分离物。按抗原性大约可分为AG 等 7 个组(洪涛19
101、88) 。(四)植物呼肠孤病毒属(PhytoreovirusPlant reovirus subgroup 1 )代表株为伤瘤病毒(Wound tumor virus, WTV ) 。其它成员有水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV ) 。可能成员有水稻瘿矮病毒(Rice gall dwarf virus ) 。(五)斐济病毒属(Fiji Plant reovirus subgroup 2 )代表株为斐济病病毒(FDV ) 。其它成员根据形态、抗原性可分为以下3 组:1 组:谷类植物分蘖病病毒(Cereal tillering disease virus ) ;玉米组缩病毒(
102、Maize rough dwarf virus) :马唐矮化病毒(Pangola stunt virus) ;水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus ) 。2 组:斐济病病毒(Fiji disease virus ) 。3 组: Arrhenatherum 兰矮病毒( Arrhenatherum blue dwarf virus ) ; Lolium 耳突病毒( Lolium enation virus) ;燕麦不孕矮缩病毒(Oat sterile dwarf virus ) 。(六)胞浆多角体病毒属(Cypovirus Cytoplasmic pol
103、yhedrosis viruses )代表株为家蚕胞浆多角体病毒(Bomby mori cytoplasmic polyhedrosis virus) 。其它成员根据RNA 基因组节段的电泳图相可以分为12 个型别:1 型:从 Bomby mori 分离2 型:从 Inachis io 分离3 型:从 Spodoptera exempta 分离4 型:从 Actias selene 分离5 型:从 Trichoplusia ni 分离6 型:从 Biston betularia 分离7 型:从 Triphena pronuba 分离8 型:从 Abraxas grossulariata 分离9
104、 型:从 Agrotis segetum 分离10 型:从 Aporophylla lutulenta 分离11 型:从 Spodoptera exigua 分离12 型:从 Spodoptera exempta 分离可能成员还包括从大约150 种昆虫分离的病毒。(七)未定名属(原划归环状病毒属)代表株为Colorado 壁虱热病毒(Colorado tick fever virus) 。其它成员有壁虱传播的Eyach 病毒。(八)未分属的其它成员1.叶蝉 A 病毒( Leafhopper A virus, LAV ) 。可能是玉米鼠耳病的病原,与斐济病毒相似,但它不能在Delphacid 昆
105、虫中和植物中繁殖,而能在Cicadellia 昆虫中繁殖。2.水稻粗糙矮化病毒(Rice ragged stunt virus ) 。类似于斐济病毒,但RNA 基因组不同,有8个节段。3.水生动物呼肠孤病毒。我国学者(Chen et al 1984)从草鲤鱼( Ctenopharyngodon idella )分离的一株可引起草鲤鱼严重疾病的呼肠孤样病毒。1981 年 Winton等从大马哈鱼(Oncorhynchus keta)分离的呼肠孤病毒(CSV ) 。1979 年 Meyers 从美国牡蛎中(Crassostrea virginica)分离的呼肠孤病毒( 13p2) 。1983 年
106、Nagabayashi 等从日本牡蛎中(Crassostrea gigas)分离的JOV1 病毒。1987 年 Winton等从3 种鱼类( Notemigonus crysoleucas, Oncorhynchus keta 和Ictalurus 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 18 页,共 31 页 - - - - - - - - - punctatus)以及美国牡蛎中分离的4 种呼肠孤病毒。 这四种病毒毒粒均呈二十面体,直径为 75nm,有双层衣壳,基因组均为1
107、1 个节段的 dsRNA ,分三类,即3 个 L,3 个 M,5 个 S。有 5 个主要结构蛋白,即135K,125K,70K,45K 和 34K。上述主要 6 个属的呼肠孤病毒的物理与生物学性质见表201。表 201 呼肠孤病毒科的物理与生物学性质毒粒直径RNA 节段数属代表株( nm)宿主以及( S)及总 MW (MD)正呼肠孤病毒呼肠孤病毒 I 型76(630)10(15)脊椎动物轮状病毒人轮状病毒70( 525)11(12)哺乳动物环状病毒兰舌病毒63( 550)10(12)昆虫,哺乳动物植物呼肠孤病毒水稻矮缩病毒70( 510)12(17)叶蝉,禾木科植物伤瘤病毒 * 70( 514
108、)12(15)叶蝉,双子叶植物斐济病毒斐济病病毒75 10 甘蔗,昆虫胞浆多角体病毒胞浆多角体病毒55( 440)10(13)昆虫*在自然宿主中不致瘤(引自 FraenkelConrat et al 1988)由上可见,正呼肠孤病毒和轮状病毒仅在脊椎动物中繁殖;环状病毒,原始是昆虫病毒,但同样可以感染许多哺乳动物;某些植物病毒和斐济病毒只在植物中繁殖,但也在它们的媒介昆虫中繁殖;胞浆多角体病毒仅在昆虫中繁殖。对人、动物和植物致病性的病毒见表202。表 202 对人、动物和植物致病的呼肠孤病毒病毒人动物植物正呼肠孤病毒?鸡关节炎?鼠严重的神经病变,鼠肝炎,鼠心肌炎,鼠脑炎和鼠肝炎,牛腹泻轮状病毒
109、儿童或大多数动物的腹泻成人腹泻环状病毒羊兰舌病毒病等植物呼肠孤病毒水稻,玉米和其它谷物的严重疾病斐济病毒甘蔗病变胞浆多角体病毒蚕等昆虫疾病Colorado 壁虱热病毒轻热病二、呼肠孤病毒科的毒粒结构哺乳动物呼肠孤病毒的毒粒呈圆球形,有双层衣壳,每个核衣壳均二十面体对称,直径为6080nm,没有类脂膜。外衣壳由3 种蛋白组成:即1HA 、3 和1C,核心有 46 种蛋白,虽然可见子粒,但双层衣壳的精确结构尚不清楚。外衣壳为蛋白酶类消化之后留下的52nm 的核心,外观二十面体,其纵切面可见12 个粗短的突出物(5nm) (图 201) 。许多环状病毒似无明显的外衣壳,但也可见这些粗短的突出物,其核
110、心一般有蛋白包绕,核心中有依赖于RNA 的 RNA 多名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 19 页,共 31 页 - - - - - - - - - 聚酶。核心内含有线状dsRNA,分为 1012 个节段。呼肠孤病毒、环状病毒、斐济病毒和胞浆多角体病毒有10 个节段, 轮状病毒有11 个节段, 植物呼肠孤病毒和Colorado 壁虱热病毒有12 个节段。基因组总量,呼肠孤病毒为22Kb,环状病毒为18Kb,轮状病毒为1621Kb ,Colorado 壁虱热病毒为 27Kb
111、。轮状病毒和呼肠孤病毒可以通过直接接触而传播,环状病毒、植物呼肠孤病毒和Colorado 壁虱热病毒通过昆虫传播。图 201 正呼肠孤病毒3 型外壳的形态结构示意图(引自BasselDuby et al 1985)a:毒粒亚单位的大小;b:亚单位的排列;1 的螺旋区通过 2 的沟缝中进入病毒核心内,在2 沟缝的顶端则为1 的球形结构,与细胞受体相作用。毒粒中一般含有1012 个结构蛋白。其中研究得比较充分的是毒粒表面的1 蛋白。它是产生中和性保护抗体和血凝抑制抗性的重要蛋白,它具有血凝活性 (Weiner et al 1980; Lee et al 1981 ) ,可与敏感细胞的受体相结合,所
112、以,也是决定毒粒感染的重要蛋白。毒粒表面的蛋白结构常是致病机理的分子基础(Wener et al 1977, 1980) 。呼肠孤病毒3 型的 1 蛋白是由 S1 基因编码的, 它有 2 个 ORF:ORF1 自 131 377, 编码 455个氨基酸,分子量为49 071D,这相当于 1 蛋白; ORF2 自 71430,编码 120 个氨基酸,为s蛋白( BasselDuby et al 1985; Ernst et al 1985; Pelletier et al 1987; Ernst et al 1985; BasselDuby et al 1985) 。由 DNA 序列推导的 1
113、氨基酸序列中有3 个 N糖基化位点,特别有意义的是在多肽的N端第 28 和第 158 个氨基酸之间有7 个氨基酸的长重复区(abcdefg) ,这相当于N 端1/3 的大小。这一7 肽重复区的特点是a 和 d 是疏水性的(表203) 。另一个特征是,在这一长重复区的侧翼,即第3 位和第 176 位有两个 Pro,而在 7 肽重复区中无一Pro(表 203) 。可见这一在 7 肽重复中疏水性氨基酸位置的规律性,以及7 肽重复区无Pro 和芳香族氨基酸的特征是典型的螺旋结构(图201) ,其中a 和 d 处的疏水性氨基酸在螺旋之间形成界面(Crick 1953; McLachlan 1975) 。
114、这说明,这一区段是由一个 螺旋结构所组成。相类似的结构见于流感病毒(Ward et al 1980) ,这一结构被随后的晶体结构研究所证实,它大约占多肽的23%。表 203 呼肠孤病毒3 型血凝素( )氨基酸序列的7 肽重复区a b c d e f g 氨基酸序列Leu Gln Ser Arg 2831 Val Ser Ala Leu Gln Lys Thr 3238 Ser Gln Ile His Ser Asp Thr 3945 Ile Leu Arg Ile Thr Gln Gly 4652 Leu Asp Asp Ala Asn Lyn Arg 5359 Ile Ile Ala Leu
115、 Glu Gln Ser 6066 Arg Asp Asp Leu Val Ala Ser 6773 Val Ser Asp Ala Gln Leu Ala 7480 Ile Ser Arg Leu Glu Ser Ser 8187 Ile Gly Arg Leu Gln Thr Val 8894 Val Asn Gly Leu Asp Ser Ser 95101 Val Thr Gln Leu Gly Ala Arg 102108 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2
116、0 页,共 31 页 - - - - - - - - - Val Gly Gln Leu Glu Thr Gly 109115 Leu Ala Glu Leu Arg Val Asp 116122 His Asp Asr Leu Leu Ala Arg 123129 Val Asp Thr Ala Glu Arg Asn 130136 Ile Gly Ser Leu Thr Thr Glu 137143 Leu Ser Thr Leu Thr Leu Arg 144150 Val Thr Ser Ile Gln Ala Asp 151157 Phe 158 89 17 22 99 10 34
117、10 疏水性氨基酸(%)引自( BasselDuby et al 1985)鉴于 螺旋是彼此环绕的,因而预测呼肠孤病毒血凝素至少是二聚体。研究表明,每一毒粒有 24 个血凝素分子,位于外衣壳12 个突起上( Joklik 1983) 。化学计量表明这种螺旋结构支撑这种血凝素的二聚形式。1 蛋白的 C 端则与 N 端不同,它是短螺旋, 折叠和不规则盘绕的混合物,并含有许多转折,这一区段含有12 个 Pro,以及宠大的芳香族氨基酸。这些现象说明,1 蛋白的 C 端是球形结构(图20 1) ,它是受体结构区段。1 蛋白的结构与功能总结于表204。表 204 呼肠孤病毒 1 蛋白(血凝素)的结构与功能
118、位置N 端区段C 端区段结构 螺旋球形功能插入核内与受体相作用特征 螺旋的盘绕蛋白免疫压力的点突变株发生受体结合位点的改变大量芳香族氨基酸,12 个 Pro (引自 BasselDuby et al 1985)呼肠孤病毒血凝素与线虫肌浆球蛋白(Nematode myosin )和家兔原肌球蛋白(Rabbit tropomyosin )有很高的同源性。这两种蛋白都由螺旋所组成( Haring ton et al 1984; McPhillips et al 1984) 。正呼肠孤病毒可以凝集红细胞,并从红细胞溶离,但是,它与流感病毒不同,它不能破坏红细胞表面的受体。 其受体不能被霍乱弧菌的受体破
119、坏酶所水解,但能被 1:1000 的过碘酸钾所破坏。N乙酰 D葡糖胺可以通过与病毒的核衣壳相结合而阻断与红细胞凝集。三、呼肠孤病毒科的基因组结构图 202 呼肠孤病毒3 型的 dsRNA 节段与相对应的编码蛋白(引自Beck 1983)如上所述呼肠孤病毒科的基因组是线状dsRNA,分 1012 个节段。以哺乳动物的呼肠孤病毒为例,有 10 个 dsRNA 片段,分为三组:大(L)组有 3 个节段, L1、L2 和 L3,共约 2.52.7MD ;在(M)组有 3 个节段, M1、M2 和 M3,共约 1.21.4MD ;小( S)组有 4 个节段, S1、S2、S3和 S4,共约 0.60.8
120、MD 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 21 页,共 31 页 - - - - - - - - - 每个 dsRNA 节段基本上编码1 个蛋白,也分为三组:大()组有 3 个蛋白, 1、 2 和3;中( )组有 4 个蛋白, 1、NS、2 和1C,后者是 1C 端的裂解物;小()组有5 个蛋白, 1、 s、NS、2 和3。S1 基因有 2 个 ORF,这也说明,真核mRNA 是单顺反子的说法是错误的。同一编码框架和不同读码框架的双重翻译早在小噬菌体和植物病毒中发现。所
121、有基因在正链的5 端带甲基化帽,而在负链有ppG。呼肠孤病毒3 型的 dsRNA 节段与相对应的编码蛋白见图202。正呼肠孤病毒的RNA 和蛋白特性见表205,206。表 205 正呼肠孤病毒dsRNA 的特性基因组节段分子量( MD)转录时间L 1(L1)2.7 早 期2(L2)2.6 晚 期3(L3)2.5 晚 期M 4(M1)1.8 晚 期5(M2 )1.7 晚 期6(M3 )1.6 早 期S 7(S1)1.1 晚 期8(S2)0.85 晚 期9(S3)0.76 早 期10(S4)0.71 早 期表 206 正呼肠孤病毒蛋白的特性蛋白种类相应的 RNA 分子量( KD )每颗粒的分子数位
122、置功能1 L3 155 105 核心复制酶?2 L2 140 90 核心突起外衣壳突起3 L1 135 12 核心结构蛋白1 M2 80 20 核心结构蛋白1C M2 72 400 外衣壳2 M1 70 12 核心结构蛋白1 S1 42 24 外衣壳血凝素2 S1 14 ?非结构蛋白酶?3 S2 38 200 核心复制酶?4 S4 34 1000 外衣壳3(NS)M3 75 ?非结构蛋白4(NS)S3 36 ?非结构蛋白RNA 合成?轮状病毒的基因组有11 个节段,它的基因组和编码的蛋白特性见表207。表 207 猴轮状病毒 SA11 的 RNA 基因组和编码的蛋白RNA 基因组编码的多肽节段
123、分子量 (MD) 名称分子量 (MD) 位置功能1 2.05 VP1 125 核心2 1.68 VP2* 94 核心VP2* 88 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 22 页,共 31 页 - - - - - - - - - VP4* 84 3 1.60 NSCP1(?) 4 1.60 VP3* 88 外衣壳血凝素VP5* 60 次要中和抗原VP8* 28 5 0.98 NSVP2 53 6 0.81 VP6 41 核心7 0.50 NSVP3 34 8 0.50 NS
124、VP4 35 9 0.50 VP7 32 外衣壳主要中和抗原(?糖蛋白,成熟) 10 0.30 NSVP5 20 11 0.20 VP9 29 外衣壳* :前体蛋白;* :切割产物。(引自 Dulbecco et al 1988; Welch et al 1989 )其中大部分节段的核苷酸序列已经清楚,包括猴SA11 病毒的第 6、8、9、10RNA 片段,英国牛轮状病毒的第7、8、9RNA 片段以及人轮状病毒Wa 株的第 11 个 RNA 片段。它们发现RNA基因组的末端序列是保守的,每个片段编码一个多肽,基因组RNA 3 端无聚( A)尾。猴SA11病毒与英国牛轮状病毒的NS35 即 NS
125、VP4 有 96%同源, 它们的第7 个基因,在核苷酸序列上有77%的同源性,在氨甘酸水平上有85%的同源性。19821983 年之间,我国洪涛发现了一种新的能引起人严重腹泻的B 组轮状病毒, 称为 ADRV(Hung et al 1984 ) 。ADRV 蛋白分析表明,64、61 和 41KD 多肽组成外衣壳蛋白,与SA11 比较,分别称为 VP5、VP5a 和 VP7。ADRV 的 47KD 多肽为内衣壳成分,与 SA11 比较称为 VP6。ADRV的 41KD 多肽是一种糖蛋白, 相当于 A 组轮状病毒的VP7。 ADRV 的 47KD 多肽是最丰富的ADRV结构蛋白,可能相当于A 组轮
126、状病毒的VP6。B 组轮状病毒不同的人和动物毒株制备的抗血清可以识别 ADRV 的 47KD ,可能是B 组轮状病毒共同的抗原成分。另外,ADRV 的 136KD 蛋白为VP1,113KD 蛋白为 VP2。某些 10072KD 的蛋白则是VP3 和 VP4(Fang et al 1989) 。四、呼肠孤病毒科基因组的转录和复制呼肠孤病毒繁殖的黑暗期较长,为69 小时,根据接种的量和型别有所不同,比其它二十面体 RNA 病毒要长。 在感染后 15 小时,病毒滴度达高峰, 每细胞平均有2502 500PFU(图 203) 。图 203 正呼肠孤病毒的繁殖曲线(引自Dulbecco et al 19
127、88 )随着病毒的大量复制,受染细胞并不很快溶解,感染性病毒的释放是不完全的。病毒具有利用宿主细胞上 肾上腺素能受体的能力,借以接触细胞,并进入细胞,即病毒毒粒通过受体介导的内吞饮作用进入细胞。毒粒进入细胞后与溶酶体连接,后者的水解酶类可使大约一半的毒粒外衣壳水解掉,形成所谓次病毒颗粒(Subviral particle) ,它比毒粒要小,比病毒核心(即内衣壳加 RNAs)要大。所以,此时病毒核心仅部分脱衣,其双链RNA 基因组节段还没能释放出来,进入胞浆。病毒毒粒RNA 不具备 mRNA 的功能,所以,它象DNA 一样,先要转录。转录是以保留方名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - -
128、 - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 23 页,共 31 页 - - - - - - - - - 式进行的,仅以负链作为模板。转录物加工后成为单链mRNA 。保留方式的转录机制不同于半保留方式的转录机制,后者是真菌病毒和噬菌体6 的转录模式(图204) 。图 204 半保留和保留转录模式图(引自FraenkelConrat et al 1988)实线代表亲代RNA ,虚线代表转录物。转录过程完全发生在次病毒颗粒内,后者在脱衣后即离开溶酶体。起先,即在感染后24 小时内,虽然所有基因组节段都可复制,但病毒基因组的4 个节段
129、( 1,6,9 和 10)优先转录,毒粒的核心内含有RNA 多聚酶(即转录酶) ,后者可用于早期转录。在毒粒内的另外4 个酶,即核苷酸磷酸水解酶、鸟苷转移酶和二个甲基转移酶,可合成mRNA 5 端及帽子结构。在感染后6 小时,病毒基因组的所有10 个节段均以同样的速率转录,大多数新合成的单链RNA 分子离开次病毒颗粒,很快与多核糖体结合,作为单顺反子mRNA 。这些 mRNA 均戴帽,虽然毒粒内有寡(A)合成酶的活性,但mRNA 无聚( A)尾。呼肠孤病毒的dsRNA 复制是保留性复制,这与dsDNA 的半保留复制不同。每个RNA 节段中负链合成的数量超过正链,后者是作为模板合成负链。未发现游
130、离的负链,因为它与其负链模板形成不同的双链RNA 节段。病毒RNA的复制需要连续的蛋白合成,后者虽然是病毒编码的复制酶和转录酶。在受染的细胞内可以发现这些10 种大小的新合成的RNA 分子。鉴于呼肠孤病毒基因组是分节段的,所以,它有较高的重组率,一般为3%5%。新合成的正链RNA 大约有75%与细胞的多核糖体相结合,以合成病毒蛋白。在感染后3 小时,受染的细胞内可以发现所有8 个病毒结构蛋白。在感染后67 小时,可以出现新合成的毒粒,但是这 10 个基因组节段是如何均匀地包装在毒粒内的,其机制尚不清楚。未装配的,新合成的dsRNAs 和过剩的病毒抗原大量积贮而形成特征性的胞浆内包含体。正呼肠孤
131、病毒在感染的头6 小时内,可抑制宿主细胞DNA 和蛋白的合成。呼肠孤病毒的dsRNA 因与蛋白相结合,这可能是不能刺激干扰素产生的原因。轮状病毒与环状病毒的复制方式与正呼肠孤病毒相似。但是环状病毒适宜的转录温度是28,而其它动物呼肠孤病毒则是在45。环状病毒的基因产物称为P1 P10。五、正呼肠孤病毒正呼肠孤病毒常可从健康人的粪便和呼吸道分泌液中分离出来,也可从不同病症的患者,特别是轻上呼吸道和胃肠道疾病的患者中分离到。本病毒与疾病的关系始终未能最终肯定。人体志愿者试验表明,只有1/3 的志愿者有无热性呼吸道感染,症候不规则,疾病很轻(Dulbecco et al 1988) 。呼肠孤病毒可在
132、许多不同的宿主内繁殖,如鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊。在猴、牛、狗、豚鼠、雪貂、地鼠、乳鼠体内也能增殖。在许多人和动物的组织培养上,如人、猴、猪、牛、羊、狗等原代细胞中繁殖良好,对HeLa、KB、 FL 等传代细胞也很敏感。病毒分离滴定常用猴肾细胞(任中原1986) 。正呼肠孤病毒有共同的补体结合抗原,而血凝抑制抗体和中和抗体有型特异性,它的血凝素可以凝集人O 型红细胞或牛红细胞。根据抗体调查结果证明,正呼肠孤病毒在人和野生动物以及家畜中广泛存在。在Toronto 进名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - -
133、- - - - - 第 24 页,共 31 页 - - - - - - - - - 行的一次调查表明,10 岁儿童中半数以上带有一个型以上抗体,成人中有80%100%带有一个型以上抗体。正呼肠孤病毒虽然对人类的疾病并不很重要,但它是研究病毒感染过程中分子病理的良好模型。现已知呼肠孤病毒的致病性原始取决于其毒粒外衣壳蛋白1、1C 或3。 1 蛋白如前述,它与细胞表面的受体相作用,以决定细胞和组织的嗜性。呼肠孤病毒3 型的受体现已分离,证明是一种 67KD 的糖蛋白, 它具有 肾上腺素样的受体功能。1 蛋白具有宿主体液免疫和细胞免疫的主要决定簇。 1C 蛋白决定病毒在感染原始部位(胃肠道)繁殖的能
134、力,以及随后的全身性扩散。它同时调节对1 蛋白的免疫反应。3 蛋白负责抑制宿主细胞RNA 和蛋白的合成,它控制病毒杀死和溶解细胞的能力。这说明呼肠孤病毒毒粒表面蛋白在致病机理方面起有决定作用。至于病毒的毒力,则是多基因决定的(Jawetz et al 1987) 。六、轮状病毒1973 年 Flewett 等用电镜检查胃肠炎患儿粪便时发现有一种特殊形态的病毒颗粒,建议命名为轮状病毒。 1975 年国际病毒命名委员会正式定名为轮状病毒。现在已知人、牛、马、猪、羊、狗、猴、小鼠、鸡和鸟等多种脊椎动物都发现有轮状病毒。它的形态结构虽与其它呼肠孤病毒科成员基本类同,大小为6075nm,无外衣壳的粗糙型
135、颗粒为 5060nm,内核直径为3340nm,但是轮状病毒具有非常清晰明确的双层壳膜和典型的车轮辐条结构。双层衣壳颗粒是病毒的感染型颗粒,用蛋白酶如胰酶处理可以增加毒粒的感染力,因而这一方法常被用于组织培养分离病毒。实验室研究表明,人的轮状病毒可使断乳的动物如小猪和牛产生腹泻。猪轮状病理可以感染新生猪和断乳小猪。轮状病毒感染小肠细胞的绒毛,病毒在胞浆内繁殖,损坏了它们的搬运机制。受损细胞可以脱落至肠腔而释放大量病毒,出现在粪便中。引起腹泻的原因可能是由于损伤了钠和葡萄糖的吸收,因为损伤细胞被没有吸收功能的未成熟细胞所代替。轮状病毒繁殖需用蛋白酶处理。病毒在试管内繁殖,高峰一般在感染后1820
136、小时,在48小时内在受染细胞的胞浆内可以发现抗原。轮状病毒在内衣壳上具有共同的抗原,外衣壳上则具有型特异性抗原。在人的轮状病毒中至少有 4 个血清型,某些动物和人的轮状病毒具有共同的血清型特异性。引起人类腹泻的主要是A型,以及我国发现的B 型。分子流行病学研究表明,不同地区、不同时间分离毒株的RNA电泳图相常有差异,反映了抗原性的变异。轮状病毒编码蛋白的抗原特异性见图205。图 205 轮状病毒基因编码蛋白的抗原特异性(引自Kapikan et al 1986 )轮状病毒有11 个 RNA 节段, 编码 VP18(在毒粒内) 以及 NS53、NS35、NS34 和 NS28(在受染细胞内)。轮
137、状病毒有3 种毒粒,完全的感染性颗粒含有两层衣壳,去除外蛋白以后产生单一衣壳,它含有 VP1(125K) 、VP2(90K) 、VP3(88K)和 VP6(41K) ,这些颗粒用促溶剂(Chaotropic agents)处理后, 可去除单一衣壳颗粒的主要蛋白VP6,从而产生核心颗粒,有 3 种多肽与此核心有关(Liu et al 1988) 。VP2 是核心的主要成分,它与RNA 结合, VP1 只占完全毒粒蛋白成分的2%,含量不高。Cohen 等(1989)就牛轮状病毒VP1 基因进行了序列分析,结果表明VP1 的分子量为124 847,它与某些RNA 病毒的 RdRp 序列十分相似(图2
138、06) 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 25 页,共 31 页 - - - - - - - - - 图 206 牛轮状病毒VP1 与其它 RNA 病毒的 RNA 多聚酶序列的相似性相同序列用框划出Polio: Polio virus EMC: encephalomyocarditis virus FMDV: foot and mouth disease virus SNBV: sindbis virus IBV: infections bronchitis viru
139、s IBDV: infections bursal disease virus Rota: rotavirus (引自 Cohen et al 1989)轮状病毒引起的婴幼儿腹泻是仅次于呼吸道病毒的第二个重要疾病。19821983 年我国又发现了新的轮状病毒,引起成人腹泻。所以,轮状病毒在我国具有重要地位。典型的临床症状包括腹泻,发烧,腹痛和呕吐,并导致脱水。婴幼儿腹泻如不治疗,由于电解质和体液的损失可以引起死亡。轻型病例病程35 天,可完全恢复,无症状感染可使血清抗体阳转。实验室诊断可用早期粪便材料进行免疫电镜以及早期抗体检查,特别是CF 和 ELISA 。轮状病毒引起的腹泻是一种世界性传染
140、病,全世界因急性胃肠炎而住院的儿童中有50%60%是由轮状病毒引起的(Jawetz et al 1987) 。婴幼儿腹泻的流行主要在冬委,潜伏期24 天。常见于6 月12 岁婴幼儿, 主要是粪一口传播。60%90%的 6 岁儿童有至少一个型别的血清抗体。在抗体存在的条件下,人和动物都能感染。局部免疫因素,如SIgA 或干扰素,对防止再感染可能起重要作用。另一方面,有血清抗体的再感染也可能反映存在不同型别的病毒。曾有报导口服轮状病毒活疫苗可使儿童获得保防(Jawetz et al 1987) 。七、环状病毒环状病毒通常感染昆虫,通过昆虫可以传给脊椎动物。但是,本属病毒不引起人类严重的疾病。环状病
141、毒可以引起动物严重疾病,如羊的兰舌病和非洲的马病。在许多脊椎动物中包括人可检出环状病毒抗体。环状病毒毒粒有一双层蛋白衣壳,其中有一模糊不清的层覆盖着主要衣壳,后者有 32 个环状子粒排列成二十面体对称,故名环状病毒。其基因组由10 个 dsRNA 节段所组成,复制方式同正呼肠孤病毒。Colorado 壁虱热病毒,原属环状病毒属,其基因组总计有27Kb,远比环状病毒(18Kb)为大,有人建议另立一个属,属名未定。它可引起人类的轻型热病,无皮疹,由壁虱传播。急性期有病毒血症,可用组织培养或乳鼠分离病毒。其抗原性不同于其它呼肠孤病毒。潜伏期一般为46 天。突然发病,伴有寒冷感和肌痛。症状包括头痛,深
142、部眼痛,肌肉和关节痛,腰背痛,恶心和呕吐,双峰型体温升高,病程56天。本病限于分布有森林壁虱Dermacentor andersoni 的地区,特别是 Colorado, Oregon, Utah, Idaho, Montana 和 Wyoming 。主要参考文献徐为燕等, 1992。兽医病毒学( 第十一章 ) ,北京:农业出版社B. W. Calnek主编 ( 高福等译 ) ,1991。禽病学 ( 第二十六、二十七章) ,第九版。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 26
143、 页,共 31 页 - - - - - - - - - 北京:北京农业大学出版社H. Graham Purchase主编 ( 唐桂运等译 ) ,1993。禽病原分离鉴定实验室手册。北京:北京农业大学出版社,197-202 Babiuk, L. A.et al., 1977. Rotavirus isolation and cultivation in the presence of trypsin. J. Clin. Microbiol., 6: 610-617 Banatvala. J. E. et al., 1975. In vitro detection of human rotavir
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