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1、几种细胞混合培养特点及应用高征摘 要：混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等 )下进行混合培养。根据实验不同的要求， 可采用不同种类的敏感细胞， 以细胞合适的比例进行混合培养。本文介绍了几种常见的细胞混合培养方法及其特点。关键字：混合细胞；培养；淋巴细胞；兔成骨细胞；兔骨髓基质干细胞；肝癌细胞；大鼠皮层神经元细胞；大鼠胶质细胞；表皮细胞；纤维细胞；U937；鼻咽癌细胞混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件 (如培养液、培养温度等 )下进行混合培养。根
2、据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。1.混合淋巴细胞培养1.1 混合淋巴细胞培养定义混合淋巴细胞培养（ mixed lymphocyte culture）是指同种异体的淋巴细胞在体外共同培养的现象。若一方(通常为供者 )淋巴细胞经灭活处理，则称“ 单向混合淋巴细胞培养 (one-way mixed lymphocyte culture)”。两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLA 类抗原中 D 和 DP 抗原不同，可相互刺激对方的T 细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养 (two way MLC) 。若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C
3、(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA 失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。1.2 混合淋巴细胞培养用途混合淋巴细胞培养 (MLC) 或称混合淋巴细胞反应 (MLR) 常用于器官移植前的组织配型， 以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA 抗原)相容的程度。 由于 MLC 中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页
4、 - - - - - - - - - 的细胞因子，促进NK、LAK 和 CTL 等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。两个个体间 HLA 抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或 3H-TdR 掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、 已知 D 位点抗原的纯合子分型细胞 (Homozygous typing cell，HTC)作为刺激细胞，则可检测待检者的 D 位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D 抗原相同， MLC 不发生增殖，此为 HLA-D 抗原阴性分型法。 EB 病毒转化的 B 淋巴母细胞表达高水平的 HLA 类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培
5、养中的刺激细胞。2.混合细胞培养在病毒学和肿瘤学研究中的应用2.1 混合细胞培养的具体应用方法根据实验不同的要求， 可采用不同种类的敏感细胞， 以细胞合适的比例进行棍合培养。 待细胞形成致密的单层后接种病毒，研究蚀斑形成的条件， 或以受染病毒的病人或尸解组织经胰酶消化成单个细胞后再与其它种类的敏感细胞进行棍合培养， 分离病毒， 或以正常人体细胞与癌肿病人的肿瘤细胞混合培养、观察细胞之间的相互影响，由此达到实验者所要研究的目的。2.2 研究进展研究病毒蚀斑的形成在探索影响流感病毒蚀斑形成的因素时，曾观察到流感病毒可对鸡胚肾单层细胞引起细胞病变，但鸡胚肾单层细胞在培养液中维持的时间短暂，尤其在琼脂
6、培养基复盖下细胞极易团缩，细胞间隙加大， 故不易形成明显的流感病毒蚀斑。 虽有关于流感病毒在鸡胚肾细胞上形成蚀斑的简报幻，但实验不稳定，数据不足，似乎不能重复。皮肌细胞对流感病毒虽不如鸡胚肾细胞敏感，但在琼脂培养基复盖下维持时间较长。综合鸡胚肾细胞对流感病毒比鸡胚皮刃细胞敏感以及鸡胚皮肌细胞比鸡胚肾细胞在琼脂培养基下维持时间较长的特点，将鸡胚肾细胞与鸡胚皮肌细胞各以适当的比例进行混合培养，结果流感病毒在此混合培养细胞上形成明显的蚀斑。 在鸡胚肾与鸡胚皮肌混合细胞上形成的流感病毒蚀斑(直径 23mm)比鸡胚皮肌细胞上形成的蚀斑 (直径 1Zmm)大而清楚。前者的蚀斑形成。单位(PFU)比后者高达
7、 100 倍。试验证明采用鸡胚肾与鸡胚皮肌混合细胞，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - 既保留了鸡胚肾细胞对流感病毒较为敏感的特点，又在与鸡胚皮肌细胞棍合培养时延长了鸡胚肾细胞在琼脂培养丛复盖下维持的时间，保证蚀斑的形成。 实验结果能反复重演且稳定。运用这一混合细胞培养技术对甲型流感病毒WS 株、原甲型的 PRS、亚甲型的洛 57 一 4、亚洲甲卫不敏感相的贵57 一 2、兰生 60 一 2 以及乙型的 Lee 等株
8、均能成功地在鸡胚肾与鸡胚皮肌棍合细胞。_L 形成蚀斑。3. 兔成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养3.1 研究背景对骨髓基质干细胞进行改造， 使其在保持快速生长的同时向成骨细胞方向分化是目前国内外研究的热点。 实验发现，成熟的成骨细胞可以通过细胞间的直接接触作用促进骨髓基质干细胞增殖， 此外成骨细胞可产生多种生长因子促进其骨髓基质干细胞的增殖、 分化。但骨髓基质干细胞通过诱导向成骨细胞分化后，难以再与原有的成骨细胞区分开。3.2 试验方法实验组：取第 3 代成骨细胞与第 3 代骨髓基质干细胞以11 比例直接混合培养，一定时间后测定细胞的增殖及成骨情况。对照组：分别取上述两种细胞在与混合培养细胞完全
9、相同的条件下单独进行培养，按测定混合培养细胞相同的方法分别测定该两种细胞的相应指标。将混合培养细胞与同期两种对照细胞相应指标的平均值进行比较。3.3 试验结果在细胞增殖和细胞成骨能力等方面均是实验组明显高于相应的平均值。3.4 试验结论将第 3 代成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养，可以使其中一种或两种细胞增殖加快，成骨能力加强。 该方法可能成为一种新的骨组织工程种子细胞的获取方法。4. 淋巴细胞与肝癌细胞混合培养名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 -
10、- - - - - - - - 4.1 试验目的通过肝癌细胞和淋巴细胞混合培养， 体外诱导产生高活性的肝癌特异性细胞T 淋巴细胞(H S CTL)。4.2 试验方法采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养技术，在 IL 1，IL 2 ，IL 4 和 IL 6 刺激下 ，诱导产生 H S CTL ，应用间接免疫荧光法和51Cr 释放法检测其对靶细胞的杀伤效应。4.3 试验结果H S CTL 与自身 LAK 相比 ，CD3+，CD4+和 CD8+细胞明显增多，抗肿瘤效应明显增强。4.4 试验结论采用淋巴细胞和肝癌细胞混合培养同时应用白细胞介素可获得大量扩增的高活性的 H S CTL。5. 大鼠皮层神经元和胶
11、质细胞混合培养5.1 试验目的建立大鼠皮层神经元胶质细胞混合培养牵张损伤模型。5.2 试验方法提取出生时间 24h到 48h 的 SD 大鼠大脑皮层组织行神经元和胶质细胞原代混合培养，根据 Ellis 方法采用 CIC型细胞损伤装置建立大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养牵张损伤模型， 根据硅胶膜的变形距离将实验组分为轻度组、中度组和重度组。 同时设立对照组， 不作牵张损伤。 分别在不同时间进行神经细胞的 PrI 染色和测定培养上清液中的LDH 含量，以确定损伤的程度。5.3 试验结果随着牵张损伤程度加重， PrI 红染细胞数逐渐增多，同时细胞培养液中LDH释放量也逐渐增多。5.4 试验结论成功建
12、立了大鼠皮层神经元胶质细胞体外牵张损伤模型，可分别模拟轻、中、重度损伤。 使用方便， 可重复性好， 可用于颅脑创伤的病理机制和药物作用的进名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 一步研究。6. 表皮细胞、纤维细胞与淋巴细胞混合培养6.1 研究目的异体、自体皮肤混合移植是提高大面积三度烧伤治愈率的有效方法。根据烧伤后皮肤混合移植的病理生理变化和组织学特点的研究，通过表皮细胞、 纤维细胞与淋巴细胞混合培养，进一步证实人体表皮
13、细胞的组织特异性和较强的抗原性。根据这个特点， 可在今后皮肤混合移植的过程中识别异体表皮，从而可更深入地探讨混合移植的排异规律。6.2 试验原理皮肤表皮细胞、 淋巴细胞混合培养与淋巴细胞混合培养一样，它们之间的反应强度均能反映出组织相容性差异程度。组织相容性相同的同卵双生间反应均为阴性，皮肤移植能长期存活，组织相容性差异越大，反应亦越强，皮肤移植存活时间越短。7.U937 与鼻咽癌细胞的混合培养7.1 试验背景U937 是一种前单核细胞， 其主要是以悬浮生长为主， 细胞形态成圆球状，表面光滑，没有突起。在PMA、内毒素或生长因子的刺激下细胞可由悬浮状态衍变为贴壁生长，细胞形态由圆球状变化为多边
14、型，细胞表面有突起伸出。本实验采用流式细胞术检测了U937 与鼻咽癌细胞 CNE- 2 混合培养对其CD36表达的影响。7.2 试验结果U937与 CNE- 2混合培养以促进U937对CD36 的表达 ， 共同培养 24小时 ，CD36 表达显著增加。7.3 试验结论前单核细胞与肿瘤细胞混合培养可促进前单核细胞向单核细胞的分化。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - 参考文献1 张汉荆.混合细胞培养在病毒学和肿瘤学研究中
15、的应用J. 国外医学 . 1986年06期. 2 蔡国锋,章庆国 ,黄开. 兔成骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养的实验研究J. 现代医学 . 2005年 04期3 李均乐,叶小鸣 ,程权永 ,等. 淋巴细胞与肝癌细胞混合培养诱导特异性细胞毒T 淋巴细胞的形成 J. 中华普通外科杂志 . 2003年 03期. 4 范东东,钟春龙 ,夏蓉,等. 大鼠皮层神经元和胶质细胞混合培养牵张损伤模型的建立 J. 立体定向和功能性神经外科杂志. 2010 年 04 期.5 李映月,韦巧妹 ,杨之骏 . 表皮细胞、纤维细胞与淋巴细胞混合培养-异体、自体皮肤混合移植的研究 J. 上海医学 . 1981 年第 05 期. 6 冷启新,李瑞祥 ,刘执玉 . U937 与鼻咽癌细胞混合培养对其CD36 表达的影响J.四川解剖学杂志 . 2000 年 02 期 . 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 6 页 - - - - - - - - -
