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1、知识点大全第十二章分子发光分析法 1分子荧光和磷光的产生过程荧光发射：多为由第一激发单重态的最低振动能级回到基态的各振动能级间的跃迁所产生的辐射 (S1S0跃迁)。荧光的发射时间约为lO-7一 10-9s。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级到基态各振动能级的跃迁(T1S0跃迁) 产生磷光。三重激发态比单重激发态的能量还要低一些，故产生磷光的波长要比产生荧光的波长长。由于S0一 T1的跃迁属于禁阻跃迁，电子直接进入三重激发态的概率很小，发生T1S0的跃迁也较难进行，另外，磷光的产生包括了多个过程： S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫T1S0，所以磷光的发光速度与荧光相比很慢，约10
2、-4一 100 s 。光照停止后，各种过程仍在进行，且 T1S0的跃迁慢，故磷光发射还可持续一定时间。 2非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间约为10-12s。内转换：相同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交换称为内转换。如通过振动弛豫和内转换，激发电子可由S2可转移到 S1；T2转移到 T1。发生内转换的时间约为 10-12s。外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互碰撞而失去能量回到基态的非辐射跃迁称为外转换。外转换可使荧光或磷光减弱或发生“猝灭”。系间跨越：指不同多重态，在有重叠的转动能级
3、间的非辐射跃迁，如由S1到 T1的跃迁。系间跨越改变了电子自旋状态，属禁阻跃迁， 可通过自旋一轨道耦合进行。 3荧光光谱发射光谱： 固定激发波长，以发射波长为横坐标，发射光的强度为纵坐标的精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 7 页知识点大全谱图即为发射光谱图；激发光谱：固定发射波长，以激发波长为横坐标、激发光强为纵坐标的谱图即为激发光谱；荧光光谱的基本特征： 荧光光谱显示的某些普遍特征为荧光物质的识别提供了基本原则。包括三个方面。即Stoke 位移、发射光谱的形状与激发波长无关和镜像规则。 4荧光猝灭包括动态猝灭和静态猝灭。
4、 前者指猝灭剂和荧光物质分子的激发态相互作用导致荧光熄灭的现象， 后者则指猝灭剂和荧光物质在基态时发生配位反应导致荧光消失的现象。 5同步荧光光谱荧光物质既具有发射光谱又具有激发光谱，如果采用同步扫描技术( 两个单色器同步运行 ) ，记录所获得的发射谱图，称为同步荧光光谱。这种同步扫描又分为三种情况，即固定波长同步荧光扫描测定( ex一em=定值) ；固定能量荧光扫描测定 (hc ex一 hcem=定值)以及可变波长荧光同步扫描测定(即激发和发射单色器运行速率不同)等。一般而言，同步荧光扫描技术可以简化光谱和降低干扰。 6时间分辨荧光光谱时间分辨荧光光谱是一种测量技术， 它是基于不同发光体衰减
5、速率寿命的不同，采用时间延迟装置，用发射单色器进行扫描，所获得的发射光谱。本技术可以对光谱重叠但寿命存在差异的组分进行分辨和分别测定。 7荧光的量子产率与分子结构的关系并不是任何物质都具有可观察到的荧光发射，能产生荧光的分子称为荧光分子。产生荧光的分子必须具备一定的条件，即具有合适的结构和具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率()可以用来衡量荧光物质的荧光发射能力，即精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 7 页知识点大全 8内滤光作用和自吸现象内滤光作用是指溶液中含有能吸收荧光的组分，使荧光分子的荧光强度减弱的现象。如色胺酸中有
6、重铬酸钾存在时，重铬酸钾正好吸收了色胺酸的激发和发射峰，测得的色胺酸荧光强度显著降低。自吸收现象是指荧光分子的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠， 在溶液浓度较大时， 一些分子的荧光发射光谱峰被另一些分子吸收的现象。自吸收现象也使荧光分子的测定强度降低，浓度越大这种影响越严重。 9影响荧光强度的环境因素荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。如溶剂效应、 温度和溶液的 pH等。 (1)溶剂效应。通常，增大溶剂的极性，一*跃迁的能量减小，使荧光光谱向长波方向移动，即红移。 (2)温度。通常，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强度随温度降低而增大，并伴随光谱的蓝移。这一点在磷光分
7、析中表现得最为突出，大多数情况下，磷光分析要求在极低的温度下进行。(3) 溶液的 pH 。溶液的 pH对含有酸性或碱性基团的荧光物质有较大影响。此外，还有氢键因素，重原子效应和表面活性剂等的影响。事实上，正是由于荧光分子对环境因素的敏感，才造就了荧光分析法在生命科学研究领域的重要地位。 lO荧光定量依据与荧光测量方法发射的荧光或磷光强度F 与被测物质浓度的关系，可用下式表示： F=23I0 bc 但本式仅在 bc 三项积小于 0 05时成立。 当浓度较高，三项积大于 0 05时，荧光强度不再与浓度成正比。因此，荧光、磷光分析仅适用于微量和痕量分精选学习资料 - - - - - - - - -
8、名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 7 页知识点大全析。荧光分析法可分为直接测定法和间接测定法两种。直接测定：对于自身具有荧光性质的物质，可以直接进行测定。如药物分析中的某些喹啉类衍生物。一般而言，应用不如间接测定广泛。间接测定法包括荧光增强法和荧光猝灭法。荧光增强法： 利用不发荧光或者具有微弱荧光的物质与待测物分子发生反应，从而得到能够发射较强荧光的产物( 可以是新的分子，但主要是配合物或超分子缔合物， 例如溴乙啶 EB与 DNA 的加合物就属于后者 ) 。形成配合物或者加合物的荧光分析法也叫做荧光标记法。荧光猝灭法：有些物质能使荧光体发生荧光猝灭，荧光强度降低值与猝灭剂
9、浓度具有线性关系， 可进行定量分析。 比较而言，荧光猝灭法干扰因素较多，应用不如荧光增强法广泛。 11低温磷光测量由于三重激发态的寿命长， 激发态分子与溶剂分子发生碰撞去激发的概率增大，使磷光强度减弱甚至完全消失，为减少这些去激发过程的影响，通常需要在液氮温度 (77 K) 下进行，所使用的溶剂应具有低的磷光背景，并在77 K 下具有足够的黏度以便能形成透明的刚性玻璃体，减少磷光的碰撞猝灭。 最常用的溶剂是 EPA ，是由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比2：5：5 混合配置而成。 12重原子效应外部重原子效应： 由含有重原子的溶剂所引起的磷光增强效应叫做外部重原子效应。内部重原子效应： 分子中引入
10、重原子取代基所产生的作用称为内部重原子效应。 13室温磷光测量精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 7 页知识点大全低温测量不可避免地带来操作上的不便和溶剂选择的限制，但也促进了室温磷光测量方法的不断建立。目前采用的室温磷光测量方法主要有以下几种。 (1)固体基质法该方法是将磷光物质吸附在固体载体上直接进行测量。吸附固化后消除了溶剂分子与三重激发态磷光分子间的碰撞，增强了磷光强度。常用的固体基质有纤维载体( 滤纸和玻璃纤维 )、 无机载体 (硅胶和氧化铝 ) 及有机载体( 乙酸钠、聚合物和纤维素膜) 等。 (2)溶剂胶束增稳法
11、在溶液中加入表面活性剂，当其浓度达到胶束临界值时，便相互聚集形成胶束。 室温下磷光分子与胶束形成缔合物，改变了磷光基团的微环境和定向的约束力， 使其刚性增强， 减小了内转换和碰撞能量损失等非辐射去激发过程发生的概率， 明显增强了三重态的稳定性， 从而实现溶液中的室温磷光测定。胶束增稳、重原子效应和溶液除氧构成了该方法的基础。 (3)敏化溶液法与溶剂胶束增稳法不同，敏化溶液法不加入表面活性剂，而是加入称为“能量受体”的组分，磷光不是由分析组分而是由能量受体发射， 分析组分作为能量给予体将能量转移给能量受体，引发受体在室温发射磷光。 14 化学发光基本原理化学发光是指在化学反应过程中由反应能激发物
12、质所产生的发光现象及生物体系中的化学发光现象。 利用这种发光现象建立起来了化学发光分析法。化学发光分析装置简单，试样本身即为发射光源，不需要额外光源和单色器， 是在无背景辐射影响下的检测，故灵敏度极高，在痕量元素分析、 环境监测及生物医药分析等方面有着重要应用。在化学反应过程中，某些化合物能够接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的可见光。 化学发光反应的机理比较复杂，可以用以下过程来表示：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 7 页知识点大全 16气相化学发光反应气相化学发光涉及臭氧的反应较多，它可与40 多种
13、有机化合物产生发光反应。气相化学发光多应用于监测大气中的O3、CO 、氮氧化物及硫化物等。如臭氧与罗丹明B 的发光反应最为灵敏，可用于大气中的微量O3的测定。乙烯与O3的发光反应对 O3特效，也可用于测定O3。 17液相中的化学发光反应液相中的化学发光反应在分析中应用最多，可测定H2O2及痕量的过渡金属离子等。一般过程是用氧化剂氧化发光试剂，使其生成激发态产物， 返回基态时给出光辐射。常用的氧化剂有H2O2、次氯酸盐或铁氰酸盐等。应用最多的发光试剂有鲁米诺 (3 一氨基苯二甲酰肼 ) 、光泽精 (N，N一二甲基二吖啶硝酸盐 ) 和洛粉碱(2，4，5 一三苯基咪唑 ) 等。化学发光反应效率为015005。鲁米诺在碱性溶液中与双氧水反应的发光过程为精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 7 页知识点大全 18 生物发光反应生物发光是涉及生物或酶反应的一类化学发光。生物体内的发光即是如此，具有非常高的发光效率(50) 。许多生化反应通常都涉及到H2O2的生成或有 H2O2参与反应，可利用鲁米诺发光体系来测定许多生化试剂或组分。例如精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 7 页
