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1、细胞核、叶绿体、线粒体的分级分离及观察南昌大学一、实验目的v1，了解细胞器分离的一般原理与方法v2，掌握分级分离的原理和注意事项v3，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光v4，熟悉线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B 超活染色的方法二、实验原理v将组织研磨成匀浆后，悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的主要方法。v细胞的各组分在等渗溶液（0.35M NaCl或 0.4M蔗糖溶液）中进行离心可达到被分离开来的母的。 将匀浆液在1000 r/min 条件下离心2 min可去除组织残渣及未破碎的细胞。 在3000 r/min条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分的细胞核）。上清夜在高速冷冻条
2、件下10000 r/mim 离心10 min,所得沉淀即为线粒体，可重复离心一次。三、实验材料、试剂及仪器1、新鲜菠菜叶;0.35M NaCl、0.01%吖啶橙|、 1% 詹纳斯绿B。2、实验器材：光学显微镜、荧光显微镜、载玻片、研钵、胶头滴管、纱布等。、细胞核与叶绿体的分离与观察 1）选取新鲜菠菜叶，洗净后去除叶梗和粗脉，称30g进行研磨。 2）在研钵中加入150 ml 0.35M的NaCl溶液，研磨成匀浆。 3）将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中。 4）每小组取滤液于4 ml在1000 r/min的条 件下离心2 min。四、实验步骤5）取上清夜在3000 r/min的条件下离心5 min，沉淀
3、即为叶绿体（混有部分细胞核）， 上清液转入干净的离心管中用于后续线粒体的分离。6）叶绿体的观察：v将沉淀用少量的0.35 M NaCl溶液悬浮。（浓度不要太高，易观察）v取叶绿体悬浮液一滴于载玻片上，加盖玻片即可在普通显微镜下观察叶绿体形态。v取叶绿体一滴于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙，加盖玻片即可在荧光显微镜下观察。、线粒体的分级分离及超活染色观察1）取上一实验步骤5中获得的上清夜装入干净的离心管中，在高速冷冻条件下10000 r/min 离心10 min, 沉淀即为线粒体。2）留适量溶液将沉淀悬浮，即用0.35 M NaCl溶液。3）取一滴悬浮液于载玻上，用一滴1%詹纳斯绿B染液，染色时间为5-10 min, 线粒体为蓝绿色圆形颗粒。可在普通显微镜下观察。作业1、绘制在光学显微镜下所观察到细胞核、叶绿体及线粒体的形态结构图。2、思考为什么要加0.35 M的等渗溶液悬浮细胞器？
