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1、肿瘤生物治疗最新进展及产业化开发广州蓝星生物科技开发 王虹 增强机体抗肿瘤免疫； 诱导肿瘤细胞凋亡； 抑制肿瘤血管的形成； 提高宿主对肿瘤常规治疗的耐受力或加速损伤的恢复。肿瘤生物治疗主要策略表达在以下几方面： 单克隆抗体及其偶联技术 以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿瘤生物治疗产业化开发的热点。1997年美国上市的利妥昔单抗rituximab为重组嵌合抗CD20单克隆抗体，用于治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入临床应用阶段。 抗体药物销售趋势抗体药物销售趋势图图TypeTypeProductProductMarketerMarketerApprovedApprovedChimericChimer
2、icRituxan Rituxan Non-Hodgkins Non-Hodgkins lymphomalymphoma GenentechGenentech November 1997November 1997 ChimericChimericSimulectSimulectOrgan rejection Organ rejection prophylaxisprophylaxis NovartisNovartisMay 1998May 1998ChimericChimericRemicadeRemicadeRheumatoid Rheumatoid arthritis,Crohns dis
3、easearthritis,Crohns diseaseohnson & Johnsonohnson & JohnsonAugust 1998August 1998CDR-graftedCDR-graftedZenapaxZenapaxOrgan rejection prophylaxisOrgan rejection prophylaxisRocheRocheDecember 1997December 1997CDR-graftedCDR-graftedSynagisSynagisRespiratory syncytial virus Respiratory syncytial virus
4、MedimmuneMedimmuneJune 1998June 1998CDR-graftedCDR-graftedHerceptinHerceptinMetastatic breast cancerMetastatic breast cancerGenentechGenentechSeptember 1998September 1998CDR-graftedCDR-graftedHerceptinHerceptinMetastatic breast cancerMetastatic breast cancerGenentechGenentechSeptember 1998September
5、1998CDR-graftedCDR-graftedMylotargMylotargAcute myeloid leukemiaAcute myeloid leukemiaAmerican Home American Home ProductsProductsMay 2000May 2000Monoclonal Antibodies on the MarketMonoclonal Antibodies on the Market TypeTypeProductProductMarketerMarketerApprovedApprovedMurineMurineRadiolabeledRadio
6、labeledZevalinZevalinNon-Hodgkins Lymphoma Non-Hodgkins Lymphoma IDEC IDEC Pharmaceuticals Pharmaceuticals and Schering AGand Schering AGMarch 2002March 2002Phage DisplayPhage DisplayHumiraHumiraRheumatoid arthritisRheumatoid arthritisAbbott LaboratoriesAbbott LaboratoriesDecember 2002December 2002C
7、DR-graftedCDR-graftedXolairXolairModerate to severe Moderate to severe persistent asthmapersistent asthmaGenentech and Genentech and NovartisNovartisJune 2003June 2003MurineMurineRadiolabeledRadiolabeledBexxarBexxarCD20 CD20 positive, positive, follicular, follicular, Non-Hodgkins Lymphoma Non-Hodgk
8、ins Lymphoma Corixa and Corixa and GlaxoSmithKlineGlaxoSmithKlineJune 2003June 2003CDR-graftedCDR-graftedRaptivaRaptivaChronic Chronic moderate-to-moderate-to-severe psoriasissevere psoriasisGenentech and Genentech and XomaXomaOctober 2003October 2003ChimericChimericErbituxErbituxColorectal cancerCo
9、lorectal cancerImclone and Imclone and Bristol-Myers SquibbBristol-Myers SquibbFebruary 2004February 2004CDR-graftedCDR-grafted AvastinAvastin（BevacizumabBevacizumab）colon and rectum colon and rectum cancercancer GenentechGenentechFebruary 2004February 2004Monoclonal Antibodies on the MarketMonoclon
10、al Antibodies on the Market 2 0 0 3年 治 疗 用 单 抗 的 销 售 总 额 已 超 过5 2亿美元。 2 0 0 6年预计5 0 6 0个治疗性单抗上市。 2 0 2 1年预计单抗销售额200亿美元。 美国已占全球单抗市场90%一支独秀。 完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段。抗单抗药物两大类抗肿瘤单抗拮抗血管生成单抗Avastin2004年抗肿瘤单抗偶联物抗生素与单抗偶联Mylolarg2001年性单抗Zevalin2002年 内皮因子Endoglin： 膜结合性糖蛋白； 分子量180KD； 肿瘤组织边缘血管，尤其是新生血管内皮细胞高表达。近年来单抗药物
11、研究具有以下特点：第一、寻找新的分子靶点 内皮因子Endoglin又称CD105作为生成血管内皮细胞特异标记物，正成为抑制肿瘤血管生成、治疗肿瘤的重要靶分子；动物实验说明：抗CD105单抗与免疫毒素连接，可使肿瘤完全消失，现已进入临床试验阶段。多种内皮细胞生长因子的单抗也显示了较好的实验效果，如人抗血管内皮生长因子VEGF现已进入了人体临床试验。 目前人源化单抗的产业化技术已较为成熟。 转基因小鼠产生人源化单抗1997年； 核糖体展示技术1999年; 噬菌体表达系统； 第二、抗体的人源化转基因小鼠：转基因小鼠： 灭活小鼠灭活小鼠Ig基因；基因； 克隆并完整转入全部或大局部人克隆并完整转入全部或
12、大局部人Ig基因座，基因座，并在小鼠体内表达；并在小鼠体内表达； 产生单抗具有产生单抗具有“鼠糖基化模式；鼠糖基化模式； 操作程序复杂。操作程序复杂。核糖体展示 (ribosome display) 核糖体展示技术的核心是利用体外核糖体表达载体构建 sc Fv抗体库 ,并于体外转录为 m RNA,体外翻译表达 ,随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体 -m RNA-sc Fv复合物中的高亲和力 sc Fv。这种技术在实验中不用任何细胞 ,是第一个完全在体外筛选有功能蛋白的方法。 该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术 (如噬菌体展示 )需转化细菌或真核细胞 ,因效率不高而降低库容 ,减少抗体多样性
13、的局限 ,并防止了宿主随细胞基因组复制过程中可能丧失而产生的库容下降 ,同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丧失这一难题。由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点 ,大大缩短了实验周期 ,具有省时省力、方便快速的特点。v噬菌体抗体库原理：采用RTPCR技术将全套人抗体重链V区基因克隆出来，在噬菌体外表以抗体外壳融合蛋白的形式表达分泌，经筛选后获得特异性抗体。该技术不经过繁杂的杂交瘤途径，即可获得全人源化抗体。从理论上讲该抗体库可筛选出任何一种单抗。v噬菌体抗体库 与传统杂交瘤技术相比有极大的优越性，现正取代杂交瘤技术。主要特点： 简单易行，采用经典的PCR分子克隆等技术，
14、即可操作； 在短期内数周可筛选106108个克隆； 筛选获得的抗体库抗体可用原核表达系统表达，无需组织培养，极大降低了本钱； 制备的抗体通常为Fab片段或ScFv抗体，没有Fc段，亲和力有一定影响某些肿瘤治疗性单抗亲和力太强反而不好，但如果对某些抗体基因进行改构，同样可获得亲和力强的抗体。第三、偶联物分子的小型化 研制小型化单抗药物对提高药物疗效有重要意义，通过酶切方法获得的Fab片断，其分子量相当于完整单抗的1/3，而通过基因工程技术制备的单链单抗ScFv，相当于完整单抗的1/6。例如单抗Fab片段与平阳霉素构成的偶联物有显著抑制肿瘤生长和转移的作用。 近年发现抗肿瘤抗生素Calicheam
15、icin对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素强1000倍。Calicheamicin与单抗构成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；2000年美国FDA批准用于治疗免疫髓性白血病的Mylotarg就是单抗与Calicheamicin的偶联物。第四、单抗药物的高效化第五、双特异性抗体以激活宿主效应细胞 双特异性抗体的理想目标是当细胞毒性效应细胞接近肿瘤细胞时增强抗体介导的肿瘤杀伤功能，是改善抗体治疗效果的又一开展方向。该抗体的特异性一方面是针对肿瘤细胞，另一方面是针对宿主细胞上的某些受体。理论上，使用双特异性抗体可征募众多效应细胞。第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力 定向诱变可变区的特定氨基酸，可以提高抗体
16、的亲和力，这可通过分子遗传手段结合噬菌体展示文库来实现。先创立一个突变体文库，别离对特定抗原具有最高亲和力的噬菌体。这种方法一般需耗时46个月，抗体的亲和力可提高约50倍左右。当然抗体亲和力太高，抗体易聚体在肿瘤组织外周，反而影响活性。第七、抗体导向的酶活化前体药物技术 前体药物Prodrug是指该药物无治疗活性或仅有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才可显示药物活性；其优点是可降低毒性和延长药物体内的作用时间。在单抗治疗中运用此策略是将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联物，间隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部位活化以杀伤肿瘤细胞。现已有单抗碱性磷酸酶偶联物合并磷酸丝裂霉素，单
17、抗胞嘧啶脱氨酶偶联物合并5Fu；在临床试验中取得了较好效果。 尽管美国在治疗性单抗的研究方面处于绝对优势；但大多数单克隆抗体药物的靶标没有专利保护或者专利保护已过期。更为重要的是，单抗药物的研发具有自己的特点，即众多公司可以针对同一靶标研究单抗药物，它可以根据同一靶标的不同抗体表位研发具有自主知识产权的药物而又不侵犯别人专利，这一点也会被我国SFDA认证为新药，因此治疗性单抗在我国其有广阔的应用前景。v肿瘤治疗性疫苗 具有良好前景，目前研究主要集中在：对肿瘤免疫原的研究，包括寻找新的肿瘤特异性抗原，以及利用基因工程方法制备或改构某些肿瘤抗原。以到达激活免疫效应细胞。应用细胞因子作为疫苗佐剂可明
18、显增加疫苗的治疗效果，如：GMCSF、CD40L作佐剂，可活化CTL细胞。v肿瘤治疗性疫苗树突状细胞DC在肿瘤疫苗诱发机体免疫反响过程中发挥关键性作用。因此用抗原改敏的DC治疗肿瘤被认为最具有开展前景。基因工程亚单位疫苗、抗原表位的选择是新型肿瘤疫苗设计的关键。肿瘤疫苗主要以诱导细胞Ci为主；因此T细胞表位预测分析在疫苗设计中显得尤为重要。v肿瘤治疗性疫苗肿瘤的异质性及肿瘤抗原的多样性，使相关抗原的特异性不高，免疫原性不强；用免疫缺陷的裸鼠建立的异体人类肿瘤模型用于肿瘤药物筛选包括疫苗。vDC疫苗肿瘤抗原肽或蛋白体外致敏DC 可产生保护性抗肿瘤T细胞介导的免疫，并引起肿瘤消退，如PSMP2肽致
19、敏DC用于37例前列腺癌治疗，30%明显好转。 细胞溶解物致敏DC 由于肿瘤抗原不清，采用全血细胞溶解物致敏DC，可以诱发广泛的T细胞反响。 此法最大的缺点是：细胞提取物中含有自身抗原，可诱发自身免疫反响。vDC疫苗DC与肿瘤细胞融合 采用电穿孔法将DC与肿瘤细胞融合，保存了DC的生物学特征，可以诱导T细胞对该肿瘤的细胞毒性作用。 目前该方法用于个体化治疗，将肿瘤病人的肿瘤细胞与脐血干细胞来源的DC融合后回输给肿瘤病人体内，具有明显的抗肿瘤效应，临床有效率可达70%以上。vDC疫苗细胞因子基因或肿瘤抗原基因修饰DC 如将IL18、IL12基因转染DC，可明显增加特异性T细胞数量。 用肿瘤相关抗
20、原TAA基因修饰DC，导致T细胞活化，其诱导的抗肿瘤免疫反响效果优于抗原肽致敏的DC疫苗。vDC疫苗DC永生化技术 目前DC回输疗法已经试用于临床，并取得了其它方法无可比较的疗效，在国外正用于各种肿瘤，但作为治疗手段有一重要难题如何大量扩增及保存DC。 DC永生化技术: 转染癌基因myc基因 转染病毒基因HPV E7基因肿瘤治疗性疫苗上市产品：黑色素疫苗Corixa公司，加拿大。 临床期：IMCBEC2Imclone公司，用于肺癌。 临床期：HER/Neu基因蛋白疫苗 Corixa公司， 用于乳腺癌2003年6月； 质粒DNA疫苗 Corixa公司，用于肺癌。 目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有
21、待于解决，主要表现在以下几个方面：第一，众多实体肿瘤缺乏特异性抗原，尽管目前已在实体肿瘤中发现了500多种肿瘤抗原，但只有少数抗原较为特异，且这些抗原免疫原性较弱。在近几年的研究中发现：仅激活CD8+ T细胞缺乏以产生有效的细胞免疫，同时需要CD4+ T细胞参与。而目前的疫苗缺乏这种设计。 第二、疫苗缺乏有效的抗原递呈。现有的疫苗在此环节上存在两个严重问题：一是进入的大局部疫苗与APC不能充分接触难以实现抗原递呈；二是即使有少量疫苗被APC捕获，也因抗原表达量甚微难以发挥有效的抗原递呈。 第三、如何打破机体免疫耐受。肿瘤细胞通过下调Fas的表达来逃避Fas介导的细胞凋亡。尽管目前通过采用共刺激
22、分子修饰的疫苗有可能打破机体对肿瘤的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的实验数据。v新的肿瘤靶基因 针对肿瘤相关抗原的靶向治疗又称分子靶药物是提高肿瘤治疗效果的重要途径。随着分子生物学的开展，肿瘤新靶基因被不断发现。 生存素Survivin是近年来新发现的凋亡蛋白抑制因子；阻断生存素的活化如采用反义核酸技术，可导致肿瘤细胞的凋亡。v新的肿瘤靶基因 2002年美国科学家在胚胎干细胞、神经干细胞、多种人类肿瘤细胞中发现了一种大量存在于细胞核中的蛋白质nucleostemin及其基因，该基因位于人类3号染色体，表达550个氨基酸；目前众多的科学家一致认为该基因亦是某些肿瘤治疗的又一靶基因。 综上所述，疫苗、
23、细胞因子、肿瘤血管生成抑制剂及单克隆抗体已成为肿瘤治疗的有效方法。它们均涉及到生物医药的重要领域蛋白质表达与纯化技术，这正是生物医药产业化开发的关键所在。 我国目前生物技术产业化最大难点。v蛋白表达载体 原核大肠杆菌表达体系 真核a 酵母 b 哺乳动物细胞CHO细胞 c 昆虫 大肠杆菌表达是目前最成熟的表达体系。具有操作简单、本钱低产量高表达量10%70%。 缺点：a、大多以包涵体形式出现尽管设计成分泌型 b、产物缺乏糖基化 c、含有大量内毒素，给纯化带来极大不方便酵母是外源基因表达最理想的真核表达体系它具有许多优点：遗传背景清楚 具有翻译后修饰加工系统，如糖基化 不产生毒素，不含特异性的病毒
24、 大规模发酵简单，本钱低 表达产物分泌到胞外，有利于纯化 表达量可达菌体蛋白10%30%v蛋白质表达蛋白一级结构的改构 改变或不改变氨基酸 增加生物活性或和减毒 改变与某些物质的亲和力 增加在体内的半衰期 增加在表达体系的表达量 原核或真核表达增加生物活性或和减轻毒性反响 肿瘤的治疗，主要是增加细胞免疫功能。 如CEA肿瘤病人体内的CEA是抑制患者细胞免疫功能的蛋白。但如果对CEA的某些氨基酸改构可以明显增加活化T细胞的功能。增加生物活性或和减轻毒性反响 人TNF突变体较原型TNFN端缺失7个氨基酸第8位脯氨酸 精氨酸第9位脯氨酸 赖氨酸第10位脯氨酸 精氨酸 其生物学活性提高数百倍，毒性减少
25、几十倍。生长因子受体EGFR 的突变株 EGFRV 第27外显子中801碱基被去除胞外区6273位氨基酸缺失，而在融合部位新产生一个甘氨酸。这种缺失融合仅在使肿瘤细胞检测到EGFR 。 因此EGFRV 单抗在动物实验中证实仅能结合EGFR 阳性的肿瘤细胞，其特异性较好。改变与某些物质的亲和力 1L18是1995年发现的新细胞因子，在结构和功能上与IL12相似。 1L18的前体蛋白Pro-1L-18为193个氨基酸，24KD。无生物学活性，成熟的1L-18为153个氨基酸，18KD，并以单体形式表现生物学活性，具有抗肿瘤及抗病毒活性。目前的实验说明，1L-18有极强的抗肿瘤作用，并由CD4+T细
26、胞和NK细胞介导的。1L18有两种拮抗剂1L18受体1L18R 可溶性1L18结合蛋白 1L18 BP 1L18与1L18受体的结合力要明显低于其它细胞因子与受体的结合力。 1L18与1L18R结合蛋白的解离常数KD为/ L。而其它细胞因子一般为45 nmol/ L左右，1L18BP能消除1L18 消杀的生物学活性反响， 1L18 BP这1L18 的主要拮抗剂，维持1L18 在体内的活性水平。1L18BP 某些肿瘤组织可持续分泌查溶性1L18 BP，从而明显降低血清中1L18 的水平。如果单纯采用1L18 治疗肿瘤病人， 1L18 BP含大量中和1L18 而达不到治疗效果。 如果将1L18 未
27、点突变 1L18 突变株，而维持或增加1L18 的生物学活性而这种1L18 突变体与1L18 BP的结合力大为降低，即可到达“一石二鸟的作用。增加在体内的半衰期 黑色素瘤相关的抗原MART1肽表位氨基酸进行置换，该抗原刺激靶CTL活性在3h内失活，而原抗原的半衰期仅22秒。单链抗体SCFV 是抗体可变区的重链和轻链通过连接肽约20aa左右相连的融合蛋白。具有： 分子量小，可迅速渗透到肿瘤内部或其它靶组织； 防止了FC段引起的非特异性细胞毒性及负段原性； 制备工艺简单。 尽管ScFv在肿瘤生物治疗中具有极其广泛的应用前景，但在临床中仍存在几个主要问题： 缺乏Fc段，亲和力大多下降 半衰期短，很快
28、从血液去除 稳定性不够 ScFv基因改构ScFv与人IgG1Fc段连接成融合蛋白，改构后ScFv半衰期延长30倍，生物活性没有下降。 在ScFv轻链和重链的可变性适当各参加一个半胱氨酸形成以二硫键固定的Fc段而构成DsFv，证实DsFv结合能力与稳定性均优于ScFv蛋白纯化 不同的治疗目的对不同载体表达蛋白的纯度要求不一样。 如肿瘤疫苗 原核表达95% 真核表达98%双水相萃取技术 方法：向水相中参加溶入水的高分子大化合物PEG等，可形成密度不同的两相。因两相均含有水，称为双水相。 轻相含某种高分子化合物 重相含盐类或一种化合物 体系：PEG/盐硫酸铵等； PEG/葡聚糖。双水相萃取技术从实用
29、角度来讲，细胞碎片分配在下相适宜。 核酸等大局部杂质一般在下相，可以同时除去 下相为无机盐，去除本钱低 蛋白质位于上相有利保护活性PEG保护，而下相的高浓度盐会造成蛋白失活。 双水相萃取技术特点 去除细胞碎片的效率优于一般的离心法和过滤法 ； 该方法关键是把蛋白产物层尽可能分在上层，而细胞碎片分在下层； 别离的纯度与色谱层析还有一定的距离。因此该技术用于初步纯化。高效疏水色谱HIC 原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水局部与填料外表的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。HIC的特征 对基质没有特殊要求，基质
30、外表具有较弱的疏水基团，孔径在25100um 防止使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被别离物质的生物活性。 具有“一石四鸟的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达产物时具有除去变性剂盐酸胍、使蛋白质折叠复性去除杂蛋白，便于变性剂回收。HIC：采用高盐时上样、低盐时洗脱。故大多在硫酸铵沉淀或离子交换层析后使用。洗脱条件温和-降低盐浓度调整溶液的pH可调整该蛋白的疏水性，因为蛋白在接近等电点时具有最大的疏水性。HIC疏水柱经过再生后，通常可使用2030次；具有高蛋白质的结合容量10100mgml；操作简单，自动化程度高；产业化程度极高，目前正广泛用于生物制药。高效亲和液相色谱HPAC 1978年，Dhls
31、on首次报道采用HPAC别离LDH同工酶及人血清白蛋白。 特点：配体与别离物特异性亲和力别离选择性强，纯化倍数优于其它层析与其它HPLC不同，HPAC不遵循其它色谱具有的理论塔板规律HPAC柱子的专用性强。载体为能耐高压的硅酸、有机聚合物目前仅HPAC常常在纯化的最后一步或中间来使用以提高产品纯度，适用于小批量样品分析和制备，目前产业化有一定难度。HPAC 亲和柱的制备交联配体到介质上 分两步：第一步活化介质 第二步将配体交联到介质上。HPAC配基合成基团 亲和配基 金属离子Zn、Ni 染料三嗪类染料专一性差、价廉、稳定性好。HPAC配基 天然基团配基化学稳定性差 核苷酸配基ATP 氨基酸配基
32、组氨碱 植物凝集素能可逆性结合碳水化合物的蛋白质，由于凝集素洗脱条件温合，易于操作，现应用日渐广泛，有较好的产业化趋势。凝集素至少每个分子有两个碳水化合物结合部位，可以用作糖蛋白的亲和配基。每毫升年度可偶联1100mg凝集素，这种活化的介质溴化氢等既有商品购置，也可自行活化，可降低本钱5060倍；上样时减慢速度有助于凝集素糖蛋白结合；增加柱温到37 有助于结合，降低柱温有助于洗脱。凝集素上样前用高盐洗柱可减少非特异性结合；硼酸盐缓冲液有助于困难的洗脱。因为它能结合某些糖蛋白；在整个过程中应防止使用磷酸盐缓冲液。因为它易于二价离子产生沉淀。HPAC配基 生物专一性配基优点：抗原抗体专一亲和作用，
33、结合力；缺点： 洗脱困难，添加变性剂会影响蛋白活性； 一种蛋白质一种别离柱，本钱高； 单抗与载体的偶联有时不太牢固，会在剧烈洗脱时脱落。HPAC配基由于配基的脱落，对蛋白质的纯度有较大影响，增加了纯化步骤；这种介质的使用寿命只能使用23次尽管说明书说明可使用510次；目前在科研上采用的竞争性洗脱，尽管洗脱条件温和，但又一次增加了纯化步骤及本钱；目前HPAC用于产品化报道的文献极少，而用于科研的报道极多。配基活化化合物及介质配基结合基团 偶联试剂 适合的介质 供给商氨基 溴化氰 琼脂糖 pharmacia 聚丙烯氨基 戊二醛 聚丙烯酰胺-琼脂糖 IBF Sepracor氨基 羟基琥珀酰胺 交联琼脂糖 pharmacia氨基或硫基 甲苯磺酰基或tresyl氯化物 琼脂糖 Pierce Sigma氨基或羧基 碳二亚胺 琼脂糖 Bio-Rad pharmacia 交联琼脂糖 Pierce碳水化合物 酰肼 交联琼脂糖 Bio-Rad Pierce 聚苯乙烯 Sigma目前广州蓝星公司生物治疗药物产业化开发CEA T细胞表位改构疫苗在原核与真核表达体系的表达高效低毒突变型TNF-在原核系统的表达类风湿性关节炎融合蛋白在真核系统的表达广州蓝星生物科技开发限公司 ：020-87644610 61647224 电邮：电邮：
