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1、n n蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法n n蛋白质与DNA相互作用研究方法 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法一一一一. .酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid SystermYeast Two-Hybrid Systerm二二二二. .免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP)Co-immunoprecipitation (Co-IP)三三三三. .GST pull-down GST pull-down 技术技术技术技术四四四四. .荧光共振能量转移
2、荧光共振能量转移荧光共振能量转移荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Fluorescent Resonant Energy Transfer Transfer （FRETFRET）五五五五. .双分子荧光互补（双分子荧光互补（双分子荧光互补（双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Bimolecular Fluorescent ComplementComplement）BIFCBIFC六六六六. .蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术七七七七. .其它方法其它方法其它方法其它方法一一.酵母双杂交系统酵母双杂交系统1
3、.1 酵母双杂交技术的原理酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由FieldsFields和和和和SongSong等首先在研究真核基因转录调控等首先在研究真核基因转录调控等首先在研究真核基因转录调控等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子中建立。他的产生是基于对酵母转录因子中建立。他的产生是基于对酵母转录因子中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4GAL4性质的研究性质的研究性质的研究性质的研究. . 基因转录不仅需要有特定的基因转录不仅需要有特定的基因转录不仅需要有特定的基因转录不仅需要有特定的DNADNA顺式序列结构
4、顺式序列结构顺式序列结构顺式序列结构，而且也，而且也，而且也，而且也需要有反式需要有反式需要有反式需要有反式转录激活因子转录激活因子转录激活因子转录激活因子的参与。的参与。的参与。的参与。 转录激活因子往往转录激活因子往往转录激活因子往往转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成由两个或两个以上相互独立的结构域构成由两个或两个以上相互独立的结构域构成由两个或两个以上相互独立的结构域构成, ,其中有其中有其中有其中有DNADNA结合结构域结合结构域结合结构域结合结构域( (DNA binding domain,DNA binding domain, DBDB) )和转录激活结和转录激活
5、结和转录激活结和转录激活结构域构域构域构域( (activation domain,activation domain, ADAD), ), 它们都是转录激活因子它们都是转录激活因子它们都是转录激活因子它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。发挥功能所必需的。发挥功能所必需的。发挥功能所必需的。 单独的单独的单独的单独的BDBD或或或或ADAD都不能激活基因转录，但不同转录激活都不能激活基因转录，但不同转录激活都不能激活基因转录，但不同转录激活都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的因子的因子的因子的DBDB和和和和ADAD形成的形成的形成的形成的杂合蛋白杂合蛋白杂合蛋白杂合蛋白仍然具有正常的激
6、活仍然具有正常的激活仍然具有正常的激活仍然具有正常的激活转录的功能。转录的功能。转录的功能。转录的功能。 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两个蛋白分别与个蛋白分别与个蛋白分别与个蛋白分别与DBDB和和和和ADAD形成的形成的形成的形成的融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白。 与与与与DB DB 融合的蛋白称为融合的蛋白称为融合的蛋白称为融合的蛋白称为“ “诱饵诱饵诱饵诱饵” ”( (baitbait) )， 与与与与ADAD融合的蛋白称为融合的蛋白称
7、为融合的蛋白称为融合的蛋白称为“ “猎物猎物猎物猎物” ”( (preyprey) )。 如果这两个蛋白能发生相互作用如果这两个蛋白能发生相互作用如果这两个蛋白能发生相互作用如果这两个蛋白能发生相互作用, , 这两个融合蛋白上的这两个融合蛋白上的这两个融合蛋白上的这两个融合蛋白上的DBDB和和和和ADAD就能重新形成有活性的转录激活因子就能重新形成有活性的转录激活因子就能重新形成有活性的转录激活因子就能重新形成有活性的转录激活因子, , 从而激活从而激活从而激活从而激活报告基因报告基因报告基因报告基因( (reporter genereporter gene) )的转录与表达。的转录与表达。的
8、转录与表达。的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物通过检测报告基因的表达产物通过检测报告基因的表达产物通过检测报告基因的表达产物, , 可判别可判别可判别可判别“ “诱饵诱饵诱饵诱饵” ”和和和和“ “猎物猎物猎物猎物” ”这两个蛋白质之间是否存在相互作用。这两个蛋白质之间是否存在相互作用。这两个蛋白质之间是否存在相互作用。这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 1.1 1.1 酵母双杂交技术的原理酵母双杂交技术的原理同时将上述两种载体转化改造后的酵母，同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生产生GAL4，又不能合成，又不
9、能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。菌落。1.2 1.2 酵母双杂交操作主要流程酵母双杂交操作主要流程1.1. 分别构建分别构建分别构建分别构建BDBD和和和和ADAD融合蛋白载体融合蛋白载
10、体融合蛋白载体融合蛋白载体2.2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞分别将重组载体转化酵母菌细胞分别将重组载体转化酵母菌细胞分别将重组载体转化酵母菌细胞3.3. 对酵母转化子进行自激活检测对酵母转化子进行自激活检测对酵母转化子进行自激活检测对酵母转化子进行自激活检测4.4. 将重组载体共转化酵母菌细胞将重组载体共转化酵母菌细胞将重组载体共转化酵母菌细胞将重组载体共转化酵母菌细胞5.5. 检测报告基因表达产物检测报告基因表达产物检测报告基因表达产物检测报告基因表达产物6.6. 分析酵母双杂交实验结果分析酵母双杂交实验结果分析酵母双杂交实验结果分析酵母双杂交实验结果BDADBDADBDADxYIden
11、tification and Characterization of FAM124B as a Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing ComplexComplex实例实例Method：ForyeasttwohybridstudieswegeneratedtheconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(transcriptvarian
12、t1)andFAM124B-1,2-pGADT7(transcriptvariant2)FAM124B-1,3-pGBKT7(transcriptvariant1,FAM124B-1,2-pGBKT7(transcriptvariant),Thesebothplasmidswereco-transformedintoY2HGoldstraincellstogetherwitheithertheCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181)ortheCHD8-pGBKT7(aminoacids17892302)plasmids.TserendulamBatsukh,
13、YvonneSchulz,et.al.IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex.PLoSOne.2012;7(12):e52640Yeasttwohybridassay.(A)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant1)andCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181,demons
14、tratingnodirectinteractionbetweenFAM124Btranscriptvariant1andtheCHD7part,while(B)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant1)andCHD8-pGBKT7(aminoacids17892302,showsadirectinteraction.ThesameexperimentswereperformedforFAM124Btranscriptvariant2.(C)Dir
15、ectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,2-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant2)andCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181,(D)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,2-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant2)andCHD8-pGBKT7(aminoacids17892302,FAM124Btranscriptvariant2interactsd
16、irectlywiththeCHD8part,whilenodirectinteractionwiththeCHD7partcouldbeobserved.酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术。主要有二类载体白质相互作用的技术。主要有二类载体:a含含DNA-bindingdomain的载体的载体;b含含Transcription-activatingdomain的载体。另外还需要特殊的酵的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如母菌株如GAL4缺陷型。缺陷型。1.3 1.3 应用应用 它可用于：它可用于：检验检验蛋白质间的相互作用；蛋白质间的相
17、互作用；分析分析蛋白质相互作用的结构域；蛋白质相互作用的结构域；发现发现新的作用蛋白质。新的作用蛋白质。 1.4 酵母双杂交技术的优点：酵母双杂交技术的优点：1.1.是一种是一种是一种是一种细胞内细胞内细胞内细胞内蛋白质相互作用研究技术，比蛋白质相互作用研究技术，比蛋白质相互作用研究技术，比蛋白质相互作用研究技术，比体外体外体外体外的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。2.2.基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和基于基因重组技术和分子遗传
18、学的原理，更便于观察和基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。检测实验结果。检测实验结果。检测实验结果。3.3.酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。生命现象和规律。生命现象和规律。生命现象和规律。4. 4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模酵母菌
19、生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模的组学研究。的组学研究。的组学研究。的组学研究。1.5 酵母双杂交技术的弱点酵母双杂交技术的弱点：1. 1. 假假假假阳阳阳阳性：自激活、多因子参与性：自激活、多因子参与性：自激活、多因子参与性：自激活、多因子参与2.2.假假假假阴阴阴阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白3.3.低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况
20、 酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括：，包括：，包括：，包括：1.1.体外相互作用验证体外相互作用验证体外相互作用验证体外相互作用验证 体外亲和纯化（体外亲和纯化（体外亲和纯化（体外亲和纯化（GST pull-downGST pull-down）、体外免疫共沉淀）、体外免疫共沉淀）、体外免疫共沉淀）、体外免疫共沉淀2.2.哺乳动物细胞内验证哺乳动物细胞内验证哺乳动物细胞内验证哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀亚细胞共定位、体内免疫共沉淀亚细胞共定位、
21、体内免疫共沉淀亚细胞共定位、体内免疫共沉淀优点：生理条件下的结合优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用二、免疫共沉淀二、免疫共沉淀2.1 定义及原理定义及原理免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：）：是以抗体是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。生理性相互作用的有效方法。原理：原理：当细胞在非
22、变性条件下被裂解时，完整细胞内当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀x，那么与，那么与x在体内在体内结合的蛋白质结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。定蛋白质的新的作用搭档。2.2方法方法1)收获培养的细胞（收获培养的细胞（11071108）冷）冷PBS洗涤洗涤2次次2）细胞裂解液裂解细
23、胞，冰浴）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3)12000rpm离心离心30min4）收集上清并加入适量抗体，）收集上清并加入适量抗体，4C摇动摇动1h过夜过夜5）加入）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶)悬液，悬液，4C摇动摇动1h6）细胞裂解液洗涤）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液混合液7）离心弃上清）离心弃上清8）沉淀加）沉淀加2蛋白蛋白LoadingBuffer煮沸煮沸510min9）离心，上清液跑）离心，上清液跑SDS-PAGE胶胶10）考马氏亮兰染色、银染）考马氏亮兰染色、银染WesternBlot质谱分析质谱分析3.注意
24、事项注意事项1）细胞裂解）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。经验确定。不能用高浓度的变性剂（不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3)
25、对照实验的设计。对照实验的设计。Identification and Characterization of FAM124B as a Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing ComplexComplex实例实例(A)Usingtheanti-CHD8(abcam,ab84527)ortheanti-CHD7(abcam,ab31824)antibo
26、dyforprecipitation,wedetectedwiththeanti-HAantibody(Roche)anapproximately51kDabandcorrespondingtotheestimatedsizeofFAM124Btranscriptvariant1.Lane1:co-transfectedCo-IP,lane2:untransfectedHeLacellsasnegativecontrol.三、三、GSTpulldown技术技术3.1 定义及原理定义及原理定义：定义：该技术是通过以适当标签该技术是通过以适当标签 和目的基因进行融合和目的基因进行融合表达作为诱饵从
27、细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作表达作为诱饵从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标签系统完成。琼脂糖树脂的反标签系统完成。原理：原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽-s-转移酶转移酶(glutathione-transferase，GST）标签融合表达，一步）标签融合表达，一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育利用纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育利用谷胱甘谷胱甘肽琼脂糖球珠肽琼脂糖球珠将将GST-融合蛋白融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来，目的蛋白复合物沉淀下来，然
28、后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE) 鉴定与诱饵鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质蛋白质相互作用的蛋白质 两种应用：两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用知蛋白质间可疑的相互作用3.2 3.2 方法：方法：方法：方法： 1 1） GSTGST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, a, 单一明单一明单一明单一明
29、确的重组蛋白；确的重组蛋白；确的重组蛋白；确的重组蛋白；b b，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白混合液；c, c, 体外翻译体外翻译体外翻译体外翻译cDNAcDNA表达得到的未知蛋白）表达得到的未知蛋白）表达得到的未知蛋白）表达得到的未知蛋白） 2 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h4C 2h 3 3）离心弃上清）离心弃上清）离心弃上清）离心弃上清 4 4）沉淀加入）沉淀加入）沉淀加入）沉淀加入2 2 蛋白蛋白蛋白蛋白Loading Buff
30、erLoading Buffer煮沸，离心煮沸，离心煮沸，离心煮沸，离心 5 5）取上清进行）取上清进行）取上清进行）取上清进行SDS-PAGESDS-PAGE电泳，电泳，电泳，电泳， 6 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western BlotWestern Blot来确定沉
31、降的蛋白中是否有目的蛋白来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立注意：该实验设立注意：该实验设立注意：该实验设立GSTGST对照，反应均在对照，反应均在对照，反应均在对照，反应均在4C4C进行进行进行进行右边为GST对照3.3 GST 融合蛋白沉降实验结果CK2GST-TP1GST Fig10GSTpulldownassayM:proteinmolecularweightstandardLane1:GSTLane2:GST-TP1+CK2Lane3:CK23.4 GST pull-down技术优缺点优点：优点：融合蛋白亲具
32、有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。缺点：缺点：该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰。四、荧光共振能量转移四、荧光共振能量转移（FRETFRET）Fluorescenceresonanceenergytransfer4.1 4.1 荧光信号的产生荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。生一个更长波长的发射光。4.2 4.2 什么是什么是FRET? FRE
33、T? 荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm10nm范围以内时，就会发生一种范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，非放射性的能量转移，即即FRETFRET现象，使得供体的荧光强度比它单独现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）实
34、际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽化荧光）实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。4.3绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白60年代，年代，Shimomura等首先从水母等首先从水母（AequoriaVictoria）中分离出一种）中分离出一种水母发光水母发光蛋白蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即蛋白即绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水后经研究表明，在水母体内母体内Ca2+和
35、肠腔素与水母发光蛋白结合后，和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激在蓝光的激发下，产生绿色荧光发下，产生绿色荧光。 人们在人们在人们在人们在GFPGFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，其中兰色荧光蛋白和
36、绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移发生荧光共振能量转移Tsien & MiyawakiTsien & Miyawaki采用采用FRETFRET技术检测细胞内技术检测细胞内Ca2+Ca2+的浓度变化。他的浓度变化。他们将们将CFPCFP和和YFPYFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+Ca2+浓度时，浓度时，钙调蛋白钙调蛋白和钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发结合肽结合，可诱发FRETFRET，使受体蛋白，使受体蛋
37、白YFPYFP发出黄色荧光，因此发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内细胞呈黄色。当细胞内Ca2+Ca2+浓度低时，浓度低时，FRETFRET几乎不发生，因此检几乎不发生，因此检测时测时CFPCFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。4.4 应用n n在生命科学领域，在生命科学领域，在生命科学领域，在生命科学领域，FRETFRET技术是检测活体中生物大技术是检测活体中生物大技术是检测活体中生物大技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，分子纳米级距离和纳米级
38、距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在针的距离在针的距离在针的距离在10nm10nm范围以内时，就会产生
39、范围以内时，就会产生范围以内时，就会产生范围以内时，就会产生FRETFRET现现现现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在在在在10nm10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在之内，一般认为这两个蛋白质分子存在之内，一般认为这两个蛋白质分子存在之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。直接相互作用。直接相互作用。直接相互作用。五、双分子荧光互补技术（五、双分子荧光互补技术（BiFC） (Bimolecular Fluorescence Complement
40、ation)基本原理：基本原理：方法利用绿色荧光蛋白方法利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接，再分别与目标蛋白连接.如果两个如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是
41、否具有相互作在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱等情况。发生的时间、位置、强弱等情况。将荧光蛋白分割成两个将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子不具有荧光活性的分子片段片段分别与目标蛋白连接分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光成活性的荧光基团而发出荧光Iden
42、tificationoftheSIRTUIN1(SIRT1)-bindingdomainofBMAL1.BindingofSIRT1toBMAL1deletionmutantswasanalyzedbybimolecularfluorescencecomplementation(BiFC).COS7cellsweretransfectedwithplasmidsencodingSIRT1-N-terminalofVenus(VN)andBMAL1-C-terminalofVenus(VC)wildtype(WT)oritsvariousmutants(nuclearlocalizationse
43、quenceNLS,BMAL1withoutafunctionalnuclearlocalizationsignal;basic-helix-loop-helixbHLH,encodingBMAL171to140;Per-Arnt-SimPAS-A,BMAL1210to320;PAS-B,BMAL1350to480;transcriptionalactivationdomainTAD,BMAL1553to625).Theimageswerecapturedbyfluorescenceimagingmicroscopyusingspecificfiltersetsforyellowfluores
44、centproteinandredfluorescentprotein.六、蛋白质芯片技术六、蛋白质芯片技术蛋蛋白白质质芯芯片片可可以以用用来来大大规规模模筛筛选选蛋蛋白白之之间间的的相相互互作作用用。将将荧荧光光标标记记的的探探针针蛋蛋白白与与蛋蛋白白质质芯芯片片孵孵育育，洗洗脱脱非非特特异异性性结结合合的的蛋蛋白白后后，可可以以通通过过扫扫描描芯芯片片上上的的荧荧光光点点检检测测到到稳稳定定的相互作用蛋白点的相互作用蛋白点。GongW.etal.(2008)MolecularPlant1:27-41.其它蛋白互作技术其它蛋白互作技术串联亲和纯化（串联亲和纯化（TAP）表面等离子共振（表面等
45、离子共振（SPR）噬菌体展示技术噬菌体展示技术(phage display approach)融合蛋白亲和色谱法融合蛋白亲和色谱法(protein fusion affinity chromatography)原子作用力显微技术(atomic force microscopy, AFM)蛋白质与蛋白质与DNA相互作用相互作用（ 一一 ） 酵酵 母母 单单 杂杂 交交 系系 统统 （ Yeast one-hybrid system）该该技技术术是是上上世世纪纪90年年代代中中发发展展起起来来的的研研究究DNA-蛋蛋白白质质之之间间相相互互作作用用的的新新技技术术，在在酵酵母母细细胞胞内内研研究究
46、真真核核生生物物中中DNA-蛋蛋白白质质之之间间的的相相互互作作用用，并并通通过过筛筛选选DNA文文库库直直接接获获得得靶靶序列相互作用蛋白的编码基因。序列相互作用蛋白的编码基因。基基本本原原理理：将将顺顺式式作作用用元元件件与与最最基基本本启启动动子子（minimalpromoter，Pmin）相相连连并并将将报报告告基基因因连连到到Pmin下下游游，将将待待测测转转录录因因子子cDNA与与酵酵母母转转录录激激活活结结构构域域（transcription-activatingdomain,AD）融融合合表表达达载载体体导导入入酵酵母母细细胞胞，该该基基因因产产物物如如果果能能够够与与顺顺式式
47、作作用用元元件件相相结结合合，就就激激活活Pmin启启动动子，报告基因表达。子，报告基因表达。从从拟拟南南芥芥cDNA文文库库中中筛筛选选与与顺顺式式元元件件DRE结结合合的的转转录录因子示意图。因子示意图。（二）噬菌体展示技术（二）噬菌体展示技术基本原理：基本原理：将已知的启动子将已知的启动子DNA片段与固相支持物结合；片段与固相支持物结合；以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段（以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段（编码启动子编码启动子DNA结合蛋白的结合蛋白的cDNA）定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，形成）定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，形成的融合蛋白表达在噬菌的表面，不影响噬菌体的生活周期及
48、天的融合蛋白表达在噬菌的表面，不影响噬菌体的生活周期及天然构型。外源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面，与固定或固相然构型。外源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面，与固定或固相支持物结合，通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体支持物结合，通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体(即即亲和富集法亲和富集法)，选出目的噬菌体，而编码基因作为病毒基因组的，选出目的噬菌体，而编码基因作为病毒基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序得知测序得知.（三）（三）DNAaseI足迹实验足迹实验足迹试验不仅能找到与特异性足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而结合的目标蛋白
49、，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，足迹试验的方法较且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，足迹试验的方法较多，常用的有多，常用的有DNase足迹试验、足迹试验、硫酸二甲酯硫酸二甲酯足迹试验足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，二者原理基本相同，二者原理基本相同.DNase足迹试验的足迹试验的基本原理基本原理为为:蛋白结合在蛋白结合在DNA片段上，保护片段上，保护结合部位不被结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了片段上留下了“足迹足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没
50、有放射性标记条带。结合的部位没有放射性标记条带。技术流程为：技术流程为：(1)待检双链待检双链DNA分子用分子用P32作末端标记，通常只标记一端作末端标记，通常只标记一端;(2)蛋白质与蛋白质与DNA混合，等二者结合后，加入适量的混合，等二者结合后，加入适量的DNase，消化，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设未加蛋白质的分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设未加蛋白质的对照对照;(3)从从DNA上除去蛋白质，将变性的上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列位的核苷酸序列.（四）（四）CHIP(ChromatinImmunoprecipitation)染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术,一种可用来确定与某一特定蛋白结合一种可用来确定与某一特定蛋白结合或蛋白定位所在的特异性或蛋白定位所在的特异性DNA序列的技术序列的技术（五）（五）EMSA(电泳迁移率实验电泳迁移率实验)
