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1、实验二、二、PCR产物的物的T-A连接及接及连接接产物物转化化第一部分：第一部分：PCR产物的物的电泳及回收泳及回收第二部分：第二部分：PCR产物与物与T T载体的体的连接（接（T-A连接）接）第三部分：第三部分：连接接产物的物的转化化1. 1. 电泳样品制备：电泳样品制备： 在在50 l PCRPCR产物中，加入产物中，加入 6 ul 上样液上样液，混匀。，混匀。 （上样液上样液：10Loading buffer 或 6Loading buffer） 2. 2. 上样：上样： 将上述样品加入凝胶加样孔中。将上述样品加入凝胶加样孔中。 注意：上样注意：上样DNA Marker。3. 3. 电泳
2、：电泳：100 100 伏，伏，3030分钟。分钟。实验第一部分第一部分PCR产物的物的电泳及回收泳及回收GAPDH gene 片段片段 (746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker 1 2？4. PCR4. PCR产物的电泳结果观察及分析产物的电泳结果观察及分析GAPDH gene 片段片段 (746bp)750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpMarker 1 2（1）在在UV灯灯下下，用用手手术术刀刀片片将将含含DNA片片段段的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶切切下下，放入放入封口膜封口膜中中； （2）将将切切下下来来的的胶胶块
3、块，标记好好姓名，姓名，-20冰箱中冰箱中 。（3）放放在在封封口口膜膜内内直直接接挤挤压压，用加样器吸取挤压后得到的液体。用加样器吸取挤压后得到的液体。5.5.挤胶法回收挤胶法回收PCRPCR产物产物3 3 A-AT - VectorTT5 5 -3 3 -DNA Ligase TTRecombinant vector1. Taq DNA聚合酶：聚合酶：PCR产物产物的的3端突出一个端突出一个A2. 商业化的商业化的T载体：在载体：在3端多端多出一个出一个TAA3. 两者的互补碱基先退火结合两者的互补碱基先退火结合(粘粘性末端连接性末端连接)，然后，然后连接酶连接酶在在缺口形成磷酸二酯键。缺
4、口形成磷酸二酯键。T-A 连接原理：连接原理：实验第二部分第二部分PCR产物与物与T T载体的体的连接接1.连连接接反反应应的的关关键键:目目的的基基因因片片段段与与载载体体的的比比例例，一般片段与载体的比例为一般片段与载体的比例为3:1（摩尔比摩尔比摩尔比摩尔比）。）。注意事注意事项：2. 使用使用T-载载体体时时，避免反复，避免反复冻冻融，防止融，防止T的断裂的断裂丢丢失。如果目的片段与失。如果目的片段与T载载体体连连接后，主要以自身接后，主要以自身环环化化为为主，要考主，要考虑虑T 可能已可能已经丢经丢失。失。 1. 按下列配方进行连接反应：按下列配方进行连接反应： 回收的回收的PCR产
5、物（产物（DNA片段）片段） 7 l T-载体载体 1 l 10 X Ligation buffer 1 l T4 DNA ligase 1 l 终体积终体积 10 lT-A连接的步骤：连接的步骤：注：注：最后加入工具最后加入工具酶（T4 DNA ligase ）2. 轻弹管底混合，离心机甩一下。管底混合，离心机甩一下。3. 将将连接反接反应管置管置25水浴水浴20min。（1）原理：）原理： 大肠杆菌在低渗大肠杆菌在低渗 CaCl2 溶液的条件下，细菌变得膨胀溶液的条件下，细菌变得膨胀而而易于外源基因的导入易于外源基因的导入。1. 1. 感受态细胞的制备感受态细胞的制备 （2）注意事项：）注
6、意事项： （1）在冰上在冰上操作。操作。 （2）无无菌菌操操作作。超超净净台台的的火火焰焰附附近近是是无无菌菌区区。枪枪头头、微微量量离离心管、心管、试剂试剂等均已高等均已高压压消毒，并已消毒，并已经经放置于超放置于超净净台中。台中。实验第三部分第三部分连接接产物的物的转化化1.将大肠杆菌在将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置琼脂培养基上划线，置37oC孵箱培养孵箱培养12-16小时；小时；2.从从琼琼脂脂平平板板上上挑挑取取单单菌菌落落，接接种种于于2ml LB培培养养基基中中，37oC, 225rpm水水浴摇床中震荡培养浴摇床中震荡培养12-16h；3.取取1ml上上述述培培养养物物接接种
7、种于于100ml LB培培养养基基中中，37oC, 225rpm水水浴浴摇摇床床中震荡培养，直至中震荡培养，直至OD值为值为0.5左右左右(约约3小时小时)。 4.取取1ml 菌液，冰浴菌液，冰浴 5 min；5.6000rpm离心离心 3 min，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，加入，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，加入500l 冰冷的冰冷的100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟；分钟；6.重复步骤重复步骤5，感受态细胞制备完毕。感受态细胞在，感受态细胞制备完毕。感受态细胞在4oC可保存可保存1周；若周；若长期保存：加甘油至终浓度长期保存：加甘油至终浓度15%，
8、分装后置分装后置-70oC。（3）操作步骤：）操作步骤：l10 l 连连接接产产物可以物可以进进行行 14 次次转转化化。l转转化化时时一一般般要要加加入入少少量量的的DMSO，作作用用：防防止止细细胞被胞被胀胀破、提高破、提高转转化效率。化效率。l热热热热休克作用休克作用休克作用休克作用原理原理： Ca2+ 诱导诱导大大肠肠杆菌成杆菌成为为感受感受态细态细胞，胞， 感受感受态细态细胞胞经经热热休休克克（42o oC C，4560 s） 发发生收生收缩缩作用，使作用，使细细胞膜出胞膜出现现空隙，空隙， 细细胞外的胞外的DNA进进入入细细胞。胞。2. 2. 连接产物的转化连接产物的转化实验第三部
9、分第三部分连接接产物的物的转化化1.在在冰冰上上，向向感感受受态态细细胞胞中中加加入入 3 l DMSO，轻轻弹弹管管底底混混匀匀。再加入再加入10 l 连接反应液，连接反应液，温和温和混匀。混匀。 置冰上置冰上10分钟；分钟；2. 2.4242o oC C，4545秒。秒。秒。秒。然后然后迅速迅速放回冰中放回冰中 5 分钟；分钟；3.将转化后细菌加入到将转化后细菌加入到1ml LB培养液中；培养液中；4.37oC, 225rpm 摇床中震荡培养摇床中震荡培养 30min；5.6,000rpm离心离心 20s，弃掉，弃掉800 l上清上清, 用剩余液体重悬菌体；用剩余液体重悬菌体；6.将上述菌液涂匀于含有将上述菌液涂匀于含有Amp的的LB琼脂培养板；琼脂培养板；7.待菌液被平板吸收后，将平皿倒置于待菌液被平板吸收后，将平皿倒置于37oC孵箱中培养孵箱中培养12-16h。播放录像播放录像: 1、2 。 操作步骤：操作步骤：思考题：思考题：1. 影响影响T-A连接效率的因素有哪些？连接效率的因素有哪些？2.2.感受感受态细胞制胞制备、转化化过程中的主要注意事程中的主要注意事项是是什么？什么？转化后的平皿化后的平皿为什么需要倒置培养？什么需要倒置培养？实验结束：实验结束：整理实验台；整理实验台；值日生值日；值日生值日；写实验报告。写实验报告。
