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1、RNARNA提取及常见失败原因提取及常见失败原因1. Trizol试剂含有苯酚，具有试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性毒性和刺激性，注意操作。，注意操作。 2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意配带注意配带手套手套，样品尽可能盖严；，样品尽可能盖严； 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和
2、骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作低温下操作，防止在操作过，防止在操作过程中释放的内源程中释放的内源RNase降解了降解了RNA。 4. 酵母和一些细菌由于酵母和一些细菌由于细胞壁细胞壁的特殊结构，可以加入的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。细胞裂解充分。 2-8 避光避光保存一年。保存一年。 准备工作准备工作 RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制
3、剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套手套。2. RNase 的又一污染源是取液器取液器。根据取液器制造商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。 处理的步骤如下：处理的步骤如下：在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙
4、基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37 或室温下处理过夜。 将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸 汽灭菌至少30分钟。 灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。 （2） 玻璃和金属物品玻璃和金属物品250 烘烤3小时以上。 DEPC是是RNA酶的化学修的化学修饰剂,它和它和RNA酶的活性基的活性基团组氨酸的咪氨酸的咪唑环反反应而抑制而抑制酶活性。活性。DEPC与氨水溶液混合会与氨水溶液混合会产生致
5、癌物生致癌物,因而使用因而使用时需小心。需小心。试验所用所用试剂也可用也可用DEPC处理理,加入加入DEPC至至0.1%浓度度,然后然后剧烈振烈振荡10分分钟,再煮沸再煮沸15分分钟或高或高压灭菌以消除残存菌以消除残存的的DEPC,否否则DEPC也能和腺也能和腺嘌呤作用而破坏呤作用而破坏mRNA活性。活性。但但DEPC能与胺和能与胺和巯基反基反应,因而含因而含Tris和和DTT的的试剂不能不能用用DEPC处理。理。DEPC(二乙基焦碳酸酯二乙基焦碳酸酯)实验步骤如下：实验步骤如下：1. 取取50100mg的组织的组织,加入加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器试剂，用匀浆器打匀打匀(Triz
6、ol 先放于冰上先放于冰上)。2. 将匀浆室温放置将匀浆室温放置5 min。3. 加入加入200 ll 氯仿氯仿,剧烈剧烈震荡混匀震荡混匀30s，冰上静置，冰上静置3 min。4. 12000 rpm，4 离心离心15 min。5. 将上清液小心转移到新的将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取离心管中（取400 ll ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置温下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中间。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）层物质，宁缺勿烂。）6. 12000 rpm， 4 离心离心15 m
7、in 。 7. 小心移去上清液，防止小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。沉淀丢失。8. 用用70%乙醇（乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤处理的水配制）洗涤1次，加入次，加入700 ll乙醇，将乙醇，将RNARNA沉淀弹起，漂洗。（此时沉淀弹起，漂洗。（此时RNARNA是是不溶解的）不溶解的） 9. 8000 rpm，室温离心，室温离心10min。10. 尽可能彻底地吸走上清，尽可能彻底地吸走上清，防止防止RNA沉淀丢失。沉淀丢失。11. 真空离心干燥真空离心干燥35分钟，或放在室温下使乙醇完全分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。挥发掉。12. 沉淀用沉淀用30 l DEPC-Hl DEPC-H
8、2 2O O溶解。如发现沉淀难溶，溶解。如发现沉淀难溶，68 68 处理处理10 10 min。13. RNA检测检测 (1)测定样品在测定样品在260 nm和和280 nm的吸光值的吸光值 按按1OD=40 g/ ml RNAg/ ml RNA计算计算RNARNA的产量。的产量。 OD260/OD280OD260/OD280在在1.8-2.0 1.8-2.0 。 (2)(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳, ,确定确定 RNARNA的完整性和污染情况。的完整性和污染情况。 28S18S5S低得率低得率A A样品裂解或匀浆处理不彻底样品裂解或匀浆处理不彻底B B最后得到的
9、最后得到的RNARNA沉淀未完全溶解沉淀未完全溶解A260/A2801.65A260/A2801.65A A检测吸光度时，检测吸光度时，RNARNA样品不是溶于样品不是溶于TETE，而，而 是溶于水。低离子浓度和低是溶于水。低离子浓度和低pHpH条件下，条件下，A280A280值会较高。值会较高。B B样品匀品匀浆时加的加的试剂量太少。量太少。C C匀匀浆后后样品未在室温放置品未在室温放置5 5分分钟。D D水相中混有有机相。水相中混有有机相。E E最后得到的最后得到的RNARNA沉淀未完全溶解。沉淀未完全溶解。RNARNA降解降解A A组织取出后没有马上处理或冷冻组织取出后没有马上处理或冷冻B B样品或提取的样品或提取的RNARNA沉淀保存于沉淀保存于-5-5-20-20，未在未在-60-60-70-70保存。保存。C C细胞在胰酶处理时被破坏。细胞在胰酶处理时被破坏。D D溶液或离心管未经溶液或离心管未经RNaseRNase去除处理。去除处理。结束！结束！
