2020年基因工程重组人干扰素

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1、（并购重组）基因工程重组人干扰素20XX年XX丿多年的企业咨询顾问经验经过实战验证可以落地执行的卓越管鯉75案，值得您下载拥育根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素：IFNa、IFNB、IFNT、IFN3来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节（较弱）其中IFN-a为多基因产物，有23种以上的亚型。II型干扰素：干扰素y（IFN） 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2. 根据动物来源确定分类

2、，例如人干扰素（HuIFN ），小鼠干扰素（MuIFN）。免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。 对巨噬细胞的作用：IFNy可使巨噬细胞表面MHCn类分子的表 达增加，曾强其抗原递呈能力It匕外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体， 促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。 对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂 量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量 干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂 量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适 宜

3、的条件下，IFNy对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能 促进其增殖IFNy能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对 TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNy不仅抑制 TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细 胞生成 IgE。 对其它细胞的作用：IFNy对其他细胞也有广泛影响：刺激中性 粒细胞，增强其吞噬能力；活化NK细胞，增强其细胞毒作用；使 某些正常不表达MHCn类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细 胞和结缔组织细胞）表达MHCn类分子，发挥抗原递呈作用；使静 脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸

4、 引循环的淋巴细胞。二重组干扰素的临床应用 广谱抗病毒活性（rhuIFNa） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNa）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNy） 多发性硬化症rhuIFNB对已知基因序列的干扰素,基因文库的调用可以用其序列 3端和 5端部分事先用同位素标记过的序列作为探针,通过杂交的方法进行调用。由于干扰素基因的 种属特异性不是很大,|可以用人的干扰素基因为同源探针,从鼠基因文库 中调出相应的干扰素基因,其方法将在下文 1 中提到。|对于扰素基因的取用,不仅可以使用构建基因文

5、库的方法,对已了解其 氨基酸或核昔酸割成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的DNA序列，再对 其进行表达。化学合|成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。与利 用基因文库的方法相比,化学合成法比较|复杂,由于每加入一个核昔酸就 会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况,并且在 l 整个合 成过程中这种错误不断积累,因此该方法适合比较短的基因,而对长的基 因则有目的产|物含量低、产物纯化困难的缺点。但它也有优点,如可根据 研究的需要对一些氨基酸进行定点|突变,或根据宿主菌的特性,在不改变 其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子,以提高|产物的产量。|对于不同亚型的干扰素,由于同

6、源性较高,可以用相同的引物从诱导的 小鼠细胞系中提取mRNA 混合物进行反转录和扩增,然后用亚型特异性探针对 CDNA 混 合物进行 Southern 印迹,这样便可将序列上相差较小的同种、不同亚型 的干扰素基因进行分离，为生产高纯度的单一干扰素提供了方法O三、表达方法随着对干扰素研究的深入 ,人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位 于氨基酸序列上的1040 位、78107 位、123166 位的 A、B、C 区,尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸对抗病毒|活性十分重要。而人 IFNt1 的 121136 位 对抗病毒活性作用较大,人 IFN 子的 N 端 10 个集|基酸也是保持其活性 所

7、必需的。对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。干| 扰素最初是用其外源序列进行表达的 ,但近年来的研究表明嵌合表达的 干扰素往往优于单一干扰素,因此出现了较多的嵌合表达形式,并取得了较好的效果。1.IFN-a的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、 生产周期短、夕阳基因表达量高的优点,同时由于家蚕为真核生物,能对表 达产物自行进行糖基化修饰,产生有生物活性的蛋白,并且在产物提取的 过程中只要将家蚕进行匀浆,再进行抽提即可,操作上十分方便,因此,它在 基因工程领域内被广泛应用。下面便以人IFN,a的生产为例介绍家蚕表 达体系在干扰素生产中的应用。用家蚕核型多角病毒BIII

8、NP V体外感染的家蚕传代细胞株BM-N通过 噬菌斑法纯化得到BmNPV的t3亚型。利用从感染脂肪体mRNA制得 的 CDNA 为探针,对其多角蛋白序列进行检验,其中 10.5kb 的 EcoRI 片 段及 3.9 灿的 HindE 片段可与探针杂交,将 10.5 灿的 EcoRI 片段克隆到 pBR322 中,产生质粒 pBmE360 对其用 HindE 切,得到 3.9kb 片段,其中 |含有多角蛋白全部序列（图 123 中为黑色框架）,将该片段插入 pUC9 的 HindE位点产生质粒p9H1 &将p9H18用EcoRI切后于50UBAL31 外切核酸酶缓冲液中23弋水浴10min,更|

9、掐锺油油菲如n入07倍他烈 的。气 mnlAdEDTA 终止反应。将截短的 p9H18 片段用 HindEi 切,并 通过琼脂糖凝胶电泳分离 2.7kb 的 Hind 皿平头末端片段 ,将其插入 pUC9 即 p9B310的 HindHI-SmaI 位点 O 另外,将 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片段连 接到pUC8上，得到质粒p8H225，用EcoRI及AatE切，得含有多角蛋白 基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段,将其连接到 p9H18 的 4.7kb 的 EcoRIAatE片段上，产生杂交质粒p89B310,它在启动子下游含有多聚接 头(EcoRI、BamHI

10、Smal、Sall、PstI位点)。将从基因文库中用183bp 探针调出的在ATG后含有SmaI位点(即有序列CCCGGGATG)的 IFNmaJ基因片段连接到p89B310上,便构建成质粒pIFN2B310。将 PIFN2B310与病毒基因组DNA便可共转染BM-N细胞系或家蚕幼体 其具体操作如下:向 2.5mL 含有 0.25molACaCl2、10|jgBmNPVDNA 及 65|jgpIFN2B310 的溶液中加含 0.28II1014NaCl、 0.7mmoi/LNa2C03、0.7IIIII1014Na2HP04、50mmol/LEfEPE(pH7.1) 的缓冲液，进行沉淀。取0.

11、45ml沉淀加至4.5mi含3x106个细胞的培 养液中,12h后换液一次,再培养4d,即可得到重组病毒BmIFN2B310o 用两个噬菌斑单位的病毒感染3x106个BM-N细胞或用50pL3x105 个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体,培养 24h 后收集培养液便可得 到干扰素。2.IFN-目的表达将人IFN-R基因HimdE片段插人载体pSV2-dhfr中 SV40晚期启动子PL下游的PvuE位点。用此重组质粒与带有黄瞟岭磷 酸核糖转移酶(XGPRT)基因的质粒pSU-gpt共转染次黄瞟岭磷酸核糖 转移酶(HGPRT)基因缺陷小鼠的骨髓瘤(sp24)细胞O经过霉盼酸及氨基 喋岭培养基筛选，

12、便可得到表达人IFN-R。具体操作步骤如下:将含有人 IFN-p基因的重组质粒pBV-92用EcoRI及HindE酶切，分别作为探针模 板及插入片段同时用PvuII切载体pSVZdhfr质粒,使其线性化后将外源 基因插入。将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的 sp2/0 细胞在含有 10%小牛血清、10%青链霉素的 DLfEM 培养基中传 34 代后在小空斑 瓶中培养24h,成半悬浮状,400r/勺1in离心5min将细胞沉积加入新鲜 培养基，再培养24h。转染液中含目的基因 pSVHIF和标记基因 pSVZgpt(比值为 10:1),其中 DNA 浓度为 20|jg/IIIIo 在2IIIol

13、/LCaCI263 阵、10mmoIATris-HCI(pH7.1)428M 中缓 缓加入 2xHeBs 液 (EEPES50mmol 只 L、 NaCl280mmolA、 Na2HP040.75mmolA、 0.75IIIII1014Na2HP04,pH7.1)约 500L,加入 sp2/0 细胞培养物中，轻 轻摇匀37弋孵育8h。再更换为含有黄瞟岭250pg/mL、次黄瞟岭 15pg/mLs胸昔10ug/mL、氨基蝶岭。-2ug/mL、霉盼酸25问/mL 的DhEM培养基,37Ccq孵箱中选择性培养。一周后更换为含 250pg/mL黄瞟岭的D;旧M培养基，继续培养2周以上，检查IFN-P活

14、 性。3.IFN-Y的表达以鼠干扰素MuIFN-y为例(图12-3)。用含人IFNj 编码区基因的探针与噬菌体YMG9构建的鼠M600基因组DNA文库在 20%甲酷胶中进行低严格性的杂交膜用0.3moIANaCI、0.03II1014拧 棱酸纳及0.1%NaEbS04在室温洗涤两次。将结合的噬菌体用噬菌斑法纯化提取DNA后，用多种限制性内切酶切，以1%葡聚 糖凝胶电泳纯化后与人CDNA探针杂交，将YMG9中与探针可以杂交的 10.5kb 的 BamHI 片段亚克隆到 pBR322 的 BaIIIHI 位点,产生质粒 PMG10.5。通过电泳分出插入片段大于6000坤，即含有完整MuIFN-Y

15、的质粒,用 PvuII 酶切,六个切点中有一个位于 5端非编码区,取从此切点 到第一内元中 ClaI 的 348bP 的片段以及用 ClaI 及 BglH 酶切得的MuIFNmy3F端片段O将载体质粒p342E用EcoRI及BamHI酶切，并 用聚合酶I将EcoRI切点补成平头末端，与以上制得的两个片段混合一同 转化大肠杆菌294,选出AIIIP抗性菌株，从中提取质粒即为含有干扰素编 码基因的pSVEIIlIlY。用表面活性剂右旋糖所活化COEL1细胞,将质粒 转入并培养 48h 后离心,上清液中便含有干扰素。4.嵌合干扰素的表达嵌合干扰素大致可以分为两种类型 :一种是两种 不同类型或同类型而

16、不同亚型的干扰素间进行嵌合 ,另一种是干扰素或 其部分序列与其他活性物质,如抗体、白介素等进行嵌合,以便得到新的生 物活性产物。下面就这两种情况分别举例介绍。将从基因文库中调出的编码淋巴细胞干扰素B和D 的 CDNA连接到 大肠杆菌色氨酸启动子、操纵子、核糖体结合位点及起始密码子ATG后 面，分别构成表达载体pLYEN-B和PLy-IFN-D。为构建嵌合干扰素，可先 将亲代干扰素的编码序列在相同位点S1(Sa113AI)、Pv(PVUE)、S2(Sa113AI)切断，产生含有氨基端 160、192、6192、 93150、93166、151166 位氨基酸的片段,用 6%的聚丙烯酿胶凝 胶电泳分离(图 124)。将合适的片段连接,得到嵌合DNA,将含有嵌合DNA的质粒用HindE和PstI切后将酶切片段连接 到 pBR322