体外肝代谢系统

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1、体外肝代谢系统【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分 重要的作用。对肝药酶的研究方法中，以动 物肝脏或肝细胞为基础，构建体外肝代谢系 统是体外代谢研究中最重要的环节之一。对 体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、 基因重组 CYP450 酶系、肝细胞培养、肝组 织切片及离体肝灌流系统等方法。本文综述 近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统， 并对各体外代谢研究方法进行比较，指出根 据各系统的特性、不同的实验要求和目的， 选择适当的研究方法的重要性。【关键词】细胞色素 P450 酶；肝微粒 体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流药物代谢一般是指药物的生物转化。药 物经生物转化后，可引起药物的药理活性或

2、 /和毒理活性的改变。因此，研究药物的生 物转化，明确其代谢过程，对新药开发、新 剂型设计及制定合理的临床用药方案等方 面都具有重要的指导意义。肝脏是药物生物 转化的重要器官，含有参与药物代谢重要的 酶系组成，主要有 CYP1、CYP2、CYP3 三大 家族1。本文所介绍的各种体外代谢系统 均含有一种或多种 CYP450 酶的同工酶，为 研究药物体外代谢提供了研究的对象和基 础。动物肝体外代谢研究可以较好地排除体 内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择 性，为整体试验提供可靠的科学依据。以肝 脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒 体、基因重组 CYP450 酶系、肝细胞、肝组 织切片及离体肝灌

3、流。1 肝微粒体肝微粒体的制备多数采用差速离心法2，通过高速离 心使微粒体与其他成分分离，操作简单，无 需其他试剂辅助。但较耗时，设备要求高， 使该法的普及和深入研究受到一定的限制。 针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法 3，在离心前额外加入一定比例的 PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。此法 对设备要求降低，并缩短了实验周期。肝微 粒体的制备过程均应在4C下进行。正确、 合理地选择缓冲液，能起到良好介质的作用 按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才 可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。肝微粒体的主要应用 测定 CYP450 酶活性 测定原理是在特定酶催化下，底物在辅 助因子以及适合

4、的温度、时间作用下反应， 借助仪器测定生成的特定产物量。由于反应 可控和周期短，目前大多数 P450 酶以肝微 粒体作为反应体系进行酶活性的测定 2。 各种酶活性测定的步骤基本相同，差别主要 在于酶对应的底物和检测仪器的选择。一般 以底物及代谢途经来命名各种酶，如乙氧基试卤灵脱乙基酶4、氯0唑沙宗羟化酶5等。根据底物特性选择检测仪 器，常用的有紫外/荧光分光光度计，或联 用 HPLC 系统。考察药物对肝药酶活性的影响 某些药物在体内不同程度地诱导或抑 制肝药酶活性，这将影响到同时服用的其他 药物的代谢，如抑制 CYP3A 活性的药物，若 与其他经这一家族酶代谢的药物同时服用， 则可能减慢其代谢

5、，从而增强药效或毒副作 用6。近年来，关于考察中药成分对肝药 酶活性影响的报道增多，从体外分子水平来 评价它们对肝代谢的影响，可为中药配伍提 供依据。如代方国等7考察给以甘草、 甘遂、甘遂甘草配伍药液的大鼠的肝微粒体 中 CYP2E1 的活性，发现甘草组和配伍组对 CYP2E1 活性的诱导作用显著高于甘遂组；甘 遂可能通过诱导肝脏 CYP2E1 的表达与活性 上升；甘遂甘草配伍使用时，甘草对 CYP2E1 活性的诱导能力更强，故两者配伍时，可促 进甘遂所含前致癌物质和前毒物转化成为 致癌物和毒物的过程，并导致对机体毒性作 用的增强。进行药物体外代谢途径研究 将药物加入肝微粒体中进行孵育后，利

6、用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的结构， 包括药物不同位点上的羟化物或去烷基产 物，从而确定代谢途径。有报道指出 8， 新型抗焦虑药加入人肝微粒体中进行孵育，经AF分析，鉴定出两种主要代谢产物：&（羟基及羰基 。4AF 54AF 5在肝微粒体中代谢的主要产物为I, 甲在人肝微粒体中，可进一步转化为II,后 者不再被代谢。考察手性药物的代谢立体选择性 周权等9把手性药物与大鼠肝微粒 体相结合,对其立体选择性代谢作了详细的 考察。作者把普罗帕酮加入经地塞米松或B萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵 育，经提取及手性拆分后，进入HPLC系统 分析。结果显示,与对照组相比,在经诱导 的肝微粒体中，PPF的I相代

7、谢呈显著的立 体选择性。总之,改进后的体外肝微粒体法耗时少 重现性好,易大量操作。适用于酶活性及体 外代谢清除等方面的研究,在实际工作中应 用较广。但同其他体外肝代谢方法相比,需 要的原材料较多,且与体内情况的一致性方 面存在不足,因而其结果是否有利预测体内 情况仍需进一步研究。2 基因重组人肝微粒体 CYP450 酶系 利用基因工程及细胞工程,将调控 CYP450 酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，再经培养可表达高水平的 CYP450 酶系，纯化后还可获得较单一的 CYP450 同 工酶。在明确某些药物经特定酶代谢后，即 以此酶进行单一代谢，更准确地观察代谢结 果，避免受其他酶共同参与

8、此代谢途径的干 扰。Ching等10通过在酵母中克隆方法， 得到高表达的人CYP1A1和CYP1A2，用于测 定普萘洛尔对映体的去烃基化和环羟化反 应的立体选择性和酶动力学参数，明确了 CYP1A2 均参与了 2 种途径，但 CYP1A1 只参 与了去烃化反应。有学者进一步运用重组人 肝微粒体，应用酶抑制剂对普萘洛尔对映体 的代谢途径进行对照实验11-13。其中 Yoshimoto 等12应用基因重组的及人肝 微粒体中的 CYP 酶系同工酶进行研究，发现 a 萘黄酮对普萘洛尔R/S对映体的 脱 异丙基化抑制作用分别为20%和40%；奎尼 丁对其2种对映体的环羟化代谢的抑制作用较完全；而其他酶抑

9、制剂对其对映体的 影响较小。基因重组 CYP450 酶系与前述的肝微粒 体在研究药物代谢方面具有一定的相关性。 但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上 优于其他的体外方法，并可在分子水平上， 为药物与酶在结合位点的相互作用研究提 供更多的信息。尽管该方法先进性较为突出 但由于受到设备条件和技术的限制，通过基 因工程获得的酶量与种类仍较有限，纯化程 度有待进一步提高，故其作为研究代谢的体 外系统的地位仍有待进一步提高。3 肝细胞培养 体外培养技术与细胞活性的维持 体外培养包括肝细胞株的培养和原代 肝细胞的分离与培养。根据细胞来源于不同 经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株， 满足各种实验需要。肝细

10、胞株容易贴壁存活 在相对稳定的培养条件下，传20一30代不 会出现明显衰老现象。原代细胞需经过从器 官中分离的过程，存在分离难度大、体外培 养要求条件高、存活时间短、增殖及传代困 难等问题。多数研究者采用改良的 Seglen 两步胶原酶灌注法。但此法操作繁琐，设备 及实验技术要求高，影响因素较多14， 包括灌注液的种类和速度、肝脏灌洗是否充 分、分离消化的酶、培养液的组成和肝细胞 悬液的离心清洗等。鉴于上述原因，刘友平 15等采用肝组织块贴壁法原代培养，即 只把组织块剪碎，不用胶原酶消化，直接按 肝细胞的培养方法进行贴壁培养，在传代时 加胰酶消化，只取上层细胞悬液继续培养。 该法简单快捷，无需

11、灌注、离心，所得肝细 胞活力高。为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题，Hengs tier 16 等研究优化肝细胞冷冻技术。同新鲜肝细胞相比，经过该技 术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜肝细胞的 80%以上，而其I相、II相代谢酶的活性60%, 可用于反应时间不超过 8h 的代谢研究，亦 可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一 步优化。肝细胞培养的主要应用 进行药物体外代谢途径与体内相关性 研究Nakagawa 等17将 BPA, 双丙烷加于大鼠肝细胞中，经质谱检测，BPA很快代谢为 单葡萄糖醛酸结合物及 2 个次要代谢物。在 BPA体内代谢研究中发现，约20%一30%的BPA 从尿中排泄，主要为

12、首过效应中生成的葡萄 糖醛酸结合物，其中硫酸结合物占尿液中总 代谢物的2%3% 18。因此BPA肝细胞体 外温孵与体内过程很相似，具有一定的代表 性。进行药物体外代谢清除研究Shibata 19等人运用冷藏保存的人 肝细胞混悬于 100%的人血浆中，将预测的肝 利用度及清除率与 14 种临床常用的药物的 生物利用度和血浆清除率进行比较时，发现 不同的细胞来源，内在清除率存在极大的个 体差异性。同时在基础的生物定标系数下， 用外推法将体外实验结果应用于体内实验 的预测，往往会出现明显的偏低现象，因此 计算的定标系数应比基础生物大3一5倍。 为获得更可靠的定量预测结果，通过预试验 来确定校正的定标

13、系数是至关重要的环节。由于在新鲜分离的肝细胞中，介导药物 代谢的 CYP450 酶系存在时间依赖性衰减的 现象，所以一般的肝细胞培养都要求在肝细 胞生存时间跨度内进行。Griffi n和Hous ton 20对体外单层肝细胞培养的内在清除能 力与新鲜游离肝细胞悬液的清除能力进行 比较，发现其内在的清除能力与代谢速度有 关，单层肝细胞体外实验更适合于代谢速度 慢的药物。总之，用肝细胞培养方法作为评价药物 代谢的体外系统，存在一定的偏差。其结果 与体内的情况相近程度，很大程度上取决于 研究者的经验。参与新型多器官共培养的研究在很长一段时间内，研究者都只是单纯 考察药物代谢在某一种器官中的作用情况。

14、 而实际上，药物在体内的过程是多因素综合 作用的。根据最新报道21，肝细胞参与 整体非连续性多器官共培养体系，即把肝细 胞和来自于其他多个器官的非肝原代细胞 一起培养，为在药物代谢和毒副效应方面评 价多器官之间的相互作用提供可能性。肝细胞同肝微粒体相比，在代谢物生成 体外代谢清除等研究方面有许多相似性，但 针对代谢物种类、主要代谢物及所反映的代 谢特性上存在着质或量的差异。随着肝细胞 冷冻技术的发展，因其体外活性维持时间短 而造成的应用限制会不断得到改善。4 肝组织切片 在各种器官组织切片中以肝切片的应 用最多，可在较长的孵育时间内保持代谢活 性。据报道，小鼠肝切片可培育35d22。 组织切片

15、的实验与培育条件使得其重现性 比灌注器官的重现性容易得多。切片制备相 对快捷而简便。但其缺点为切片机的大量使 用受限，而且价格昂贵。DeKan ter 23 等 利用利多卡因、睾酮及乙氧基香豆素为探针药物，进行了器官切片实验，结果表明, 该系统具有多相代谢途径，且易于比较不同 器官组织的代谢差别。研究发现不同种属及 不同器官间代谢类型及速度不同。Vickers 24用肝組织切片研究环孢 素A的代谢，CSA本身是CYP3A4的底物，但 在人肝切片中加入l10mol/LCSA培育24h, 使 CYP3A4 活性降低了 25%，说明在 CSA 高浓 度时可减少本身的清除率而提高血药浓度。 若用某些疾

16、病的标记物加入肝组织切片中 培育，也可研究药物的不良反应如对肝的损 害或对脂质代谢的影响等。组织切片完整地保留了所有的肝药酶 及细胞器的活性，而且保留了一定的细胞间 质。这些特点相比于分子水平和细胞水平， 更具宏观性与整体性，更能反映药物在体内 生理情况下的实际代谢过程，为分子理论与 离体器官之间，乃至临床应用架起了桥梁。5 离体肝灌流 肝脏灌注的特点 肝脏灌流技术作为一种与在体肝脏最 具可比性的体外系统，有其突出的优点是可 以在接近生理状况的条件下进行肝功能研 究，保持完整细胞的天然屏障和营养液的供 给，能排除其他组织、脏器的干扰及便于动 态定量分析受试物及其代谢产物。因而离体 器官灌注处于体内与体外的临界点。然而肝 脏灌流技术亦存在缺陷，如受时间的限制、 易受其他因素的干扰,手术及插管操