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1、细胞自噬检测的具体步骤及方法细胞自噬检测的具体步骤及方法、自噬体介绍自噬(Autophagy)，或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成个扁平的类似脂质体样的膜结构，称为Phagophore。随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为自噬体(autophagosome)。自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或
2、被排出细胞外或滞留在胞浆中。自噬信号通路：Aut啪h砸牌如#3AT?MfnbrjM-“.LUI*-甲孤1I明钞11Phajahflw二、自噬研究策略和方法praiw正常细胞基础水平自噬活性比较低，对自噬研究通常需要进行人工调节和干预，常用药物有:1、自噬诱导剂a) BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin:模拟内质网应激；b) Carbamazepine/L-690，330/LithiumChloride(氯化锂)：IMPase抑制剂(即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶)；c) Earles平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-
3、D-sphingosine(C2-ceramide):ClassIPI3KPathway抑制剂；e) Rapamycin:mTOR抑制剂；f) XestosponginB/C:IP3R阻滞剂。2、自噬抑制剂a) 自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA):(ClassIIIPI3K)hVps34抑制剂；b) BafilomycinA1:质子泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine(羟氯喹)。3、自噬检测1) 透射电镜；电镜作为自噬检测的金指标。由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下观察不到自噬体的形成，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特
4、征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体AV1)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体AV2)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。2) WB检测标志物LC3/Atg8、p62/SQSTM1、Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1;a）利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/比值的大小可估计自噬水平的高低。b）利用WesternBlot检测p62蛋白来评价自噬以及自
5、噬流的强弱：p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。3）组织蛋白酶Cathepsin活力检测；4）IF检测自噬潮autophagicflux。三、自噬研究常规思路通常情况下，除了研究自噬现象本身，大家更多的是将自噬与各种生命活动或者疾病结合起来，把自噬作为这些方向的一个机制来研究。比如研究自噬如何参与肿瘤的发生发展、如何参与肿瘤的耐药性与复发转移、如何参与肿瘤免疫治疗的效果、如何参与炎症反应、如何参与氧化应激，如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等，通常的研究模式：1）证明自噬参与了相关研究表型（电镜、LC3II/I-WB、LC3亚细胞定位、LC3荧光示踪监测自噬流等）2）证明自
6、噬在表型中起到关键作用（通过自噬抑制剂、激动剂进行关联研究）3）找到表型与自噬桥梁分子（检测pl3K通路、Beclin-1、ATG家族各成员）4）在基因层面通过gainof/lostoffunction研究桥梁分子在自噬中的作用。研载生物可以为客户提供从自噬领域的课题设计到实验操作包括后续实验结果的整理等服务。四、自噬相关研究领域1）自噬起始和终止的分子机制2）细胞自噬与肿瘤3）细胞自噬与免疫4）自噬参与炎症信号通路的调节5）细胞自噬与神经退行性疾病6）激活自噬促进免疫化疗和放疗7）表观遗传学与细胞自噬的关系8）药物治疗自噬五、自噬病毒工具多种自噬病毒研究工具可以提供，便于直接感染目的细胞后直
7、观地观察细胞自噬的整体水平。1、GFP-LC3单荧光自噬指示病毒系统GFP-LC3病毒系统可高效感染目的细胞，表达GFP-LC3,感染感染后细胞可在荧光显微镜下实时观察自噬的整体水平；由于电镜耗时长，不利于监测自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出TGFP-LC3指示技术：无自噬时GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。研载生物已开发出高效的评价用GFP-LC3病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评价自噬流。2、mRFP-GFP-LC3双荧光自噬指示病毒系统mRFP用于标记及追踪LC3,GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。
