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1、苦瓜类胡萝卜素含量和八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的表达 摘要苦瓜作为一种热带作物，其果实中包含的b-胡萝卜素含量是胡萝卜的5倍。为了研究苦瓜 中类胡萝卜素聚集的机制，检测了八氢番茄红素合酶(McPSY)和八氢番茄红素脱氢酶(McPDS)基因的表达水平。这些基因的表达量在苦瓜花中很高，在水果成熟过程中，八氢番 茄红素合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的表达量在中期有所下降，但在全熟期又有所增加。 此外，果皮中的类胡萝卜素在从绿变黄的过程中不断积累，因此，八氢番茄红素合酶和八氢 番茄红素脱氢酶基因的表达量在果实成熟过程中与类胡萝卜素的积累相关。主成分分析法 (PCA)也用于评估类胡萝卜素在果
2、实的七个成熟阶段的含量关系。成熟的果实比未成熟的 果实类胡萝卜素含量更高。1. 前言苦瓜属于葫芦科，是一种种植在热带和亚热带的药用作物。因为包括果实在内的整个植 株都很苦，故被称为苦瓜或苦葫芦。 (Grover & Yadav, 2004; Gurbuz, Akyuz, Yesilada, & Sener, 2000)。在传统医学中，苦瓜用于治疗糖尿病，近年来科学研究表明苦瓜是一种很有前途的 糖尿病治疗药物(Leung, Birtwhistle,Kotecha, Hannah, & Cuthbertson, 2009; Nahas & Moher, 2009;Platel & Srinivas
3、an, 1997)。此外，苦瓜还有其他的诸如抗癌(Nerurkar &Ray, 2010)，杀 菌(Mahomoodally, Gurib-Fakim, & Subratty,2010),排除肝毒素(Chang et al., 2010)，抗氧化 (Kumaret al., 2010)，抗病毒(Lee-Huang et al., 1995)，抗溃疡(Gurbuz et al., 2000)，和抗寄生 虫(Prabakar & Jebanesan, 2004)等功效。苦瓜的果实、种子乃至整个植株中都含有很多主要和次要代谢产物，特别是，未成熟的 苦瓜中含有大量的类胡萝卜素(Raman & Lau,
4、 1996; Zhang, Hettiarachchy, Horax, Chen, & Over,2009)。类胡萝卜素是一类在叶、花和果实中积累的，包含有超过600种自然产生红色、 橙色和黄色的色素(Sergio & Robert, 1999)，这些色素在植物生理过程中起重要作用。例如， 它们在光合作用膜中作为一种光的受体，可以防止光造成的损伤(Bartley & Scolnik, 1995; Penuelas & Munne-Bosch, 2005)，此外，在花和果实中，类胡萝卜素的颜色可以吸引动物以 传粉和传播种子(Howitt & Pogson, 2006)，另外，类胡萝卜素是植物激素
5、的前体，如调控发 育和压力的脱落酸(Koornneet,1986)。在人上，一些类胡萝卜素是重要的营养物质，有些有 显著的抗病效果。例如，类胡萝卜素A类，包括a-类胡萝卜素和b-类胡萝卜素，是可以防 止眼干、失明和早产儿死亡的维生素A的前体(IMFNB, 2000;Mayne, 1996)，此外，其他类 胡萝卜素的吸收也会显著降低肺癌(Holick et al., 2002)、前列腺癌(Giovannucci, 1999)、心血 管疾病、白内障和光敏性疾病(Botella-Pav & Rodriguez-Concepci, 2006; Kritchevsky, 1999)的 发生。类胡萝卜素的
6、生物合成通路已经被广泛研究，合成途径的第一步(图 1)是八氢番茄红素 合成酶(PSY)催化两个牻牛儿牻牛儿二磷酸(GGDP)的聚合，形成一个C40八氢番茄红素， 然后，两个脱氢酶，八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和n-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)将4个双键还原， 形成番茄红素，接下来，这个通路分成两支，其一是将番茄红素加上一个e-环和一个b-环， 形成一个a-胡萝卜素，用来合成叶黄素，另一支，则是在番茄红素上加了两个b-环，以合 成玉米黄素、百合黄素和堇黄素。编码所有在类胡萝卜素生物合成过程中的酶的基因已经在 不同的植物中被克隆和进行了特征测定(Castillo, Fernandez, & Gomez
7、-Gomez, 2005; Clotaultet al., 2008; Guo, Yang, Hu, & Yang, 2009; Ha, Kim, Park, Lee, &Cho, 2007; Kato et al., 2004; Kita et al., 2007; Pogson, McDonald,Truong, Britton, & DellaPenna, 1996; Ronen, Cohen, Zamir, & Hirschberg,1999)。特别是，PSY和PDS在控制类胡萝卜素生物合成中对合成速率的控制起重要作用，例如，在番茄果实成熟过程中，PSY和PDS的过量表达与番茄素的积
8、累(Bramley,2002; Cunningham, 2002)和类胡萝卜素的总量密切相关(Fraseret al., 2002),相反， 在拟南芥中对PDS的破坏会降低类胡萝卜素的合成量(Qin et al., 2007)。本研究中，苦瓜的果实成熟过程中在不同器官和不同阶段中探究了类胡萝卜素积累和 PSY、PDS 基因的表达量的关系，另外，运用主成分分析法评估了在果实成熟的七个不同阶 段的的含量关系GGDPOPPGGDPphytoene-carotenelycopenea-caroteneHO -luteinHQ图1植物中类胡萝卜素合成通路，PSY,八氢番茄红素合酶；PDS,GGDP, 牻
9、牛儿牻牛儿二磷酸。(没错，就是这个名)2. 材料与方法2.1. 植物材料p-carotenep-cryptoxanthiniHantheraxanthinHviolaxanthin八氢番茄红素脱氢酶苦瓜种子购买于亚洲种子公司(韩国首尔)，储存在4 摄氏度，苦瓜种子在温室中孵育 发芽，然后被转移到韩国Daejeon的Chungnam National University的试验田中，五个月后， 6个阶段的果实都被采收下来(图2,补表S1),根、茎、叶、花和果实被收集并储存在-80 摄氏度。2.2. 苦瓜八氢番茄红素合酶基因和八氢番茄红素脱氢酶基因的RT-PCR方法使用植物RNeasy Mini试
10、剂盒(QIAGEN, Valencia, CA)从苦瓜不同器官中提取总RNA， 然后用 ReverTra Ace-a- kit 试剂盒(ToyoboQsaka, Japan)反转录成 CDNA，使用 Primer3 软件 (http:/frodo.wi.mit.edu/primer3)根据苦瓜 PSY(GenBank 序列号 AY494789)和 PDS(GenBank 序列号AY494790)的 CDNA序列设计定量RT-PCR的引物(补表S2)。苦瓜环抱素a受体基 因(GenBank序列号HQ171897)是一个管家基因，作为内参。各基因的表达量用各基因与管 家基因的拷贝数即RQ(相关表达
11、量)显示,RT-PCR在一个Mini Opticon RT PCR系统(BioRad, Hercules,CA)中进行，使用 SYBR Green Real-time PCR Master Mix 试剂盒(Toyobo)在如下 条件下进行扩增：94摄氏度5分钟，随后是94摄氏度15秒、 56摄氏度15秒、 72摄氏度 20秒的循环40个，每个实验进行三次，实验条件与先前描述相同(Tuan et al., 2010)。2.3. 苦瓜类胡萝卜素的提取和高效液相色谱分析苦瓜样本(0.1 g)中的类胡萝卜素萃取后溶于3ml含0.1%抗坏血酸(w/v)的乙醇中，混合 物漩涡震荡20秒，在85摄氏度水浴中
12、孵育5分钟。接下来加入120“氢氧化钾(80% w/v) 以皂化可能会有的油脂，漩涡震荡并在85摄氏度孵育10分钟后，样本置于冰上，加入1.5ml 冷的去离子水和0.05ml b-Apo-80-胡萝卜醛(12.5 |J g/ml)。然后，类胡萝卜素被1.5ml己烷 提取两次，每次在1200g离心以分层，接下来提取物在氮气流下冻干，并悬浮于50:50 (v/v) 的二氯甲烷/甲醇混合液中，分析类胡萝卜素的提取法与之前所述的相同(Howe & Tanumihardjo, 2006)。进行高效液相色谱(HPLC)之前，胡萝卜素在Agilent 1100 HPLC系统中用C30 YMC分 离柱(250
13、 X4.6 mm, 3 J m; Waters Corporation,Milford, MA)分离，并用光敏二极管阵列在 450nm检测。溶剂A包括甲醇/水(92:8 v/v)和 10mM乙的酸铵，溶剂B包括100%的甲基三 丁基乙醚(MTBE),流动速率为1ml/min,样品以以下顺序洗脱：0 min, 83% A/17% B; 23 min, 70% A/30% B; 29 min, 59% A/41% B;35 min, 30% A/70% B; 40 min, 30% A/70% B; 44 min, 83% A/17% B;and 55 min, 83% A/17% B。类胡萝卜素
14、的识别和峰值分配主要基于他们保留的 时间的对比和紫外 -可见光光谱数值与标准值的关系，在先前所描述的顺序下显示 (Fraser, Pinto, Holloway, &Bramley, 2000; Howe & Tanumihardjo, 2006。)2.4. 主成分分析苦瓜果实不同成熟阶段的类胡萝卜素含量主成分分析使用不进行预处理的SAS9.1软件 包(SAS Institute, Cary, NC)，主成分使用相关系列矩阵进行检测，主成分的数值使用其本征 值进行标定，最后，数据使用绘制的主成分值和载荷进行显性化，所显示的数据指示了结果 中每种类胡萝卜素的分布情况。(没弄懂)2.5. 统计分析
15、每个实验结果均取三次实验所得出数据的平均值，实验结果的显著程度使用标准差进行 评估。3. 结果与讨论3.1.苦瓜不同器官的八氢番茄红素合酶(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的表达量PSY (McPSY)和 PDS(McPDS)在苦瓜花中的表达量比其他器官中高，尽管McPDS在新 叶中的转录量几乎与花中一样多，此外，在苦瓜中McPSY的表达率在雄花中比雌花中更高。 然而，McPDS在雌花中的表达率比雄花中高(图.2A和B)。McPSY和McPDS在根、茎和 新叶中的表达量适中，在老叶中表达量最少。在植物中，类胡萝卜素的含量在绿色组织中是稳定的，而在其他组织中却有所不同。例如，绝大部分植物的叶中包含大量光合作用必需的 叶黄素、堇黄素和b-胡萝卜素(Yamamizo, Kishimoto，& Ohmiya, 2009在本研究中，苦瓜老 叶和新叶中都富含光合作用类型的类胡萝卜素。然而， McPSY 和 McPDS 在叶中的表达量 则偏低。因此，苦瓜可能使用其他的酶或McPSY和McPDS的其他亚型来合成类胡萝卜素， 在番茄中也有类似的情况，即PSY有两种功能不同的亚型：PSY-1负责有色体中的类胡萝 卜素结构，而PSY-2则与叶绿体光合作用通路有关(Fraser, Kiano, Truesdale,Schuch, & Bramley, 1999)。然而，苦瓜也中类
