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1、氨基酸分离的主要技术及原理林锦池董越范雪雪摘要：本文对氨基酸分离提纯常用的沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、 毛细电渗析法、膜分离法以及结晶法等方法的技术原理及研究进行较全面的总 结。1沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的 过程。该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。氨基酸工业中常用沉 淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。1. 1利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀法在生产中常利用各种氨基酸在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异，将氨基酸彼 此分离。如胱氨酸和酪氨酸在水中极
2、难溶解，而其它氨基酸则比较易溶；酪氨酸 在热水中溶解度大，而胱氨酸则无大差别。根据此性质，即可把它们分离出来， 并且互相分开。另外，可以利用氨基酸的两性解离有等电点的性质。由于氨基酸 在等电点时溶解度最小，最容易析出沉淀，所以利用溶解度法分离氨基酸时，也 常结合等电点沉淀法。1. 2特殊试剂沉淀法某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，利 用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸与沉淀剂沉淀 下来，达到与其它氨基酸分离的目的。较为成熟的工艺有：缬氨酸与苯甲醛在碱 性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，分离这种沉淀，用盐 酸水解除去苯甲醛，
3、即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻一二甲苯一4一磺酸反应， 生成亮氨酸的磺酸盐，后者与氨水反应得到亮氨酸；组氨酸与氯化汞作用生成组 氨酸汞盐的沉淀，再经处理就可得到组氨酸。特殊试剂沉淀法虽然操作简单、选 择性强，但是由于沉淀剂回收困难，废液排放污染严重，残留沉淀剂的毒性等原 因已逐渐被它方法取代。工业应用举例：选择性沉淀分离亮氨酸、精氨酸的方法该方法包括下述步骤：将二氯苯磺酸加入到毛发酸水解液中，所述二氯苯磺酸和所述水 解液之间的重量/体积比为二氯苯磺酸：水解液=1 ： 520；搅拌所述毛发酸水解液；将生 成的亮氨酸沉淀物进行分离以获取亮氨酸。选择性沉淀分离精氨酸的方法：将分离亮氨酸沉 淀物后的水
4、解液按一定比例补加上述二氯苯磺酸，连续搅拌1236小时，将生成的精氨酸 沉淀物进行分离以获取精氨酸。2离子交换法离子交换法是利用不溶性高分子化合物（即离子交换树脂）对不同氨基酸吸 附能力的差异对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离。离子交换树脂是 一种具有离子交换能力的高分子化合物。它不溶于水、酸和碱，也不溶于普通有 机溶剂，化学性质稳定。离子交换树脂作为固定相，本身具有正离子或负离子基 团，和这些离子相结合的不同离子是可电离的交换基团（或称功能基团）。在离子交换过程中，溶液中的离子自溶液中扩散到交换树脂的表面，然后穿过表面，又 扩散到交换树脂颗粒内，这些离子与交换树脂中的离子互相交换，交
5、换出来的离 子扩散到交换树脂表面外，最后再扩散到溶液中去。这样，当溶液和树脂分离后, 其组成都发生了变化，从而达到分离纯化的目的。在生产中，在适当的pH条件下, 如在pH=56的蛋白质水解液中，碱性氨基酸解离成阳离子，酸性氨基酸就解离 成阴离子，而中性氨基酸基本上呈电中性。选择适当的交换树脂，就能实现单一 的或者分组的选择性吸附。然后用不同pH的洗脱液，可把各种氨基酸分别洗脱下 来。离子交换法提取氨基酸处理量大，工艺较成熟。但由于该法是利用各种氨基 酸之间等电点的差异，所以只有当欲被分离的混合氨基酸之间的等电点相差较大 时才能较好的分开，对于等电点相近的混合氨基酸只能部分得以分开或根本就难 以
6、分离。另外，氨基酸离子在树脂中的扩散速度较慢，因此一方面要求料液的流 速较低，另一方面对于氨基酸浓度较高的料液在上离子交换柱前还要进行稀释， 这就必然导致所需的设备太大。应用举例：加样平衡液阳离子交换树脂 尼龙网 或砂芯滤板收集收集高离子强度洗液收集高离子强度洗液收集离子交换柱层析原理示意分离步骤：1.树脂的处理将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L 的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同 上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。2装柱取直径1cm,长度1012cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经 处理的树脂悬浮液，关
7、闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一 些树脂，至树脂沉降至8 10cm的高度即可。3 平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留3 4cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。4. 加样揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1 2mm关闭出口，沿管壁四周小 心加入0.5m l样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近 树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓 冲液至液面高3 4cm左右，接恒流泵。5. 洗脱以缓冲液洗脱，开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集6080管。
8、3萃取法3. 1反应萃取反应萃取就是选择适当的反应萃取剂，其解离出来的离子与氨基酸解离出来 的离子发生反应，生成可以溶于有机相的萃取配合物，从而使氨基酸从水相进入 有机相。由于萃取剂与不同的氨基酸反应形成性质不同的萃合物，扩大了那些性 质相近的氨基酸的性质差别，从而达到彼此分离和提纯的目的。迄今为止，人们 采用了两种不同形式的反应萃取剂，一类是在低pH值下萃取氨基酸阳离子，以酸 性磷氧类萃取剂最为典型，如二（2-乙基己基）磷酸、十二烷基磷酸、十二烷基苯 磺酸等。且当这些萃取剂中添加诸如煤油、四氯化碳、苯、正辛烷、异戊醇时可 增加分相速度。另一种是在高pH值下萃取氨基酸阴离子、季铵盐，如甲基三辛
9、基 氯化铵是典型的阴离子萃取剂。3. 2溶剂萃取由于氨基酸是离子型化合物，它们在非极性溶剂中的溶解度很低，因此物理 萃取法难以用来提取氨基酸。早期采用正己胺和含45个碳原子的低级醇作为萃 取剂从蛋白水解液中萃取分离十几种氨基酸。但这种萃取剂的分配系数低，分离 系数差，对萃取柱的高度要求很高，一般要有3040理论级才能有满意的分离效 果。近些年来先后开发了化学萃取法分离提取氨基酸，其中有机胺类和以有机磷 酸为应用最多的两大类萃取剂，尤其是在有机磷酸为萃取剂的萃取过程研究很 多，并开发大量的工艺过程。采用高级脂肪酸，如月桂酸、硬脂酸、棕榈酸和油 酸可以有效地萃取分离碱性氨基酸。这些脂肪酸无毒、价廉
10、。但是，碱性氨基酸 比较容易用离子交换法有效地分离。萃取法分离碱性氨基酸恐怕难有商业应用前 景嗍。利用氨基酸不溶于水，而易溶于液氨的性质，发展了液氨萃取技术。应用 这种技术，在蒸发了氨后，可获得氨基酸的极好结晶。化学萃取法分离混合氨基酸主要也是利用不同氨基酸之间等电点差别，与离 子交换法相似，只有当混合氨基酸之间的等电点相差足够大时才能被萃取分离 开，对于等电点相近的氨基酸如中性氨基酸，它们的等电点几乎一致，因此化学 萃取法是难以分离混合中性氨基酸的。3. 3反向微胶团萃取反向微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体， 表面活性剂的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头
11、则排列在内形成极 性核，极性核溶于水后就形成了“水池”。当含有氨基酸的水溶液与含反相微胶 团的有机溶剂相混合时，氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的“水池”内或 微胶团球粒的界面分子膜层内而被分离。反相微胶团对氨基酸具有相当强的萃取能力。氨基酸是以离子状态被萃取 的，不同带电状态的氨基酸离子的被萃取能力不同。pH变化对氨基酸萃取分配比 的影响是通过改变氨基酸在水溶液中的电离状态而影响氨基酸的总分配比的。水 溶液中的离子强度变化则是影响氨基酸离子与表面活性剂之间的静电作用强弱 来影响氨基酸的被萃取能力的。反相微胶团对氨基酸的萃取由于反萃用的是离子 强度更大的盐溶液，所以反萃液尚需进一步将氨基酸与
12、无机盐分离，才能得到纯 的氨基酸。到目前为止大多数研究的只是适用于低盐浓度的氨基酸料液如发酵 液，对于同时含有多种氨基酸且盐浓度高的料液如胱氨酸母液则不能适用。 3. 4液膜萃取液膜萃取，也称液膜分离，是将第三种液体展成膜状以便隔开两个液相，利 用液膜的选择透过性，使料液中的某些组分透过液膜进入接受液，然后将三者各 自分开，从而实现料液组分的分离.液膜分离过程是由三个液相所形成的两个相 界面上的传质分离过程，实质上是萃取与反萃取的结合液膜萃取兼有溶剂萃取和 膜渗透两项技术的特点，按其结构可分为乳化液膜和支撑液膜两大类。乳化液膜为液体表面活性剂形成的球面，将溶液分为内相和外相，液膜只有 几个分子
13、厚，单位体积设备的表面积可达10003000m2/m3。乳状液膜萃取法提 取氨基酸是一种具有工业应用前景的分离氨基酸的新方法，它具有膜分离技术的 优点，在常温下操作，能耗少，又不象固体膜需要高压操作，存在膜污染老化而 需经常清洗、维修和更换的麻烦。但是，目前大多数研究仍处于实验室阶段，未 见工业报道。乳状液膜萃取法要实现工业化，还必须研究解决萃取过程的乳化问 题、低毒萃取剂的选择和萃取剂残留物对产品质量影响的问题及萃取平衡和传质 速率问题。支撑液膜是将起分离作用的液相借助毛细作用同定在多孔高分子膜中，由载 体、有机溶剂（或称稀释剂）和多孔高分子膜（或称支撑体）三个组分组成，其 体系由料液、支撑
14、液膜和反萃取液三个连续相组成，支撑液膜可以使萃取与反萃 取在液膜的两侧同时进行，从而避免载体负荷的限制、减少了有机相的使用量， 解决了乳化液膜的乳化液稳定条件及破乳等问题。而且支撑液膜因其结构简单的 特点，可用于研究确定传递机理。工业应用举例：翁连进以二异辛基磷酸铵表面活性剂形成的反胶团，在盐浓度高达4.5M的胱 氨酸母液中萃取精氨酸的分配系数可以达到3. 8,通过改变混合氨基酸水溶液中 无机盐的种类或浓度，使等电点相近的氨基酸在同一种反胶团中的分配系数产生 较大的差别，实现等电点相近的混合氨基酸的分离。根据这一观点，翁连进已经 成功地开发了从胱氨酸母液中提取精氨酸的工艺，该工艺采用4级萃取,
15、3级洗涤， 可使反胶团中精氨酸的纯度大于98%，整个工艺精氨酸的回收率大于98%，大 大高于目前工业上应用离子交换法从胱氨酸母液中提取精氨酸的回收率。4吸附法吸附法是利用恰当的吸附剂，在一定的pH条件下，使混合液中氨基酸被吸附 剂吸附，然后再用适当的洗脱剂将吸附的氨基酸从吸附剂上解吸下来，达到浓缩 和提纯的目的。常用的吸附剂有高岭土、氧化铝、酸性白土等无机吸附剂。吸附法具有很多优点，如：不用或少用有机溶剂；操作简便、安全，设备简单； 吸附过程pH变化小等。但是吸附法的选择性差，收率低，特别是一些无机吸附 剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大，尤其活性炭影响环境卫生。所以 吸附法曾有一段时间很
16、少采用，几乎被其它方法所代替。但随着大孔网状聚合物 吸附剂的合成和不断发展，吸附法又重新被人们重视。工业应用举例：活性炭吸附分离芳香族氨基酸方法：活性炭对芳香族氨基酸有选择性吸附特性，可 将芳香族氨基酸从寡肽混合液中分离出来易于实现工业化应用而成为首选。活性炭吸附芳 香族氨基酸的作用力是非极性苯环侧链与活性炭巨大表面积间的非极性吸附和氨基酸极性 基团与活性炭含氧基团间极性吸附的总和.吸附过程同时存在物理吸附和化学吸附.但以前 者为主。水解工艺流程：鸡蛋预处理双酶二步酶水解脱盐活性炭吸附浓缩高F值寡肽混合物。吸附条件为pH 3,吸附温度25C ,炭-液比1B 12，吸附时间120 min。根据活性炭吸附前后的蛋清寡肽混合物溶液的全波长紫外扫面结果发现活性炭对芳香 族氨基酸吸附作用较强。经氨
