酶解技术原理详解

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1、酶解技术原理详解第一步，脱色。考染条带用NH4HC03缓冲液/30%-50%有机溶剂（一般是乙腈）： 我们实验室用的是含有25mmol/L的NH4HCO3的50%的乙腈。多次水浴超声至 胶粒无色透明状，盐离子/有机溶剂的组成同时降低染料和蛋白的盐键和疏水相 互作用。银染条带用铁氰化钾或过氧化氢和硫代硫酸钠的混合溶液与胶粒充分混 合，胶粒颜色脱去后，用超纯水洗至无色。铁氰化钾或双氧水氧化银颗粒，产生 的银离子与硫代硫酸钠形成复合物除去。 10%的蛋白可能在这一步损失。第二步，二硫键还原和烷基化。为了让 typsin 充分的接近切割位点，并让酶切 后的肽段彼此分开。酶切之前用DTT还原二硫键，并用

2、碘代乙酰胺（IAM）将巯 基转化为-CH2-CONH2,防止打开的二硫键再结合。打开并还原二硫键可以提高酶 切的效率和质谱检测的灵敏度，这一步不是必须的，在某些情况下（比如说蛋白 主链对DTT处理敏感），可以省略。为了定量和均一的烷基化二硫键，IAM的处 理时间很关键，不多不少45分钟，一分钟都不要差！（说明最好是按1比1加 DTT与IAA）, IAM对光敏感，分装成小份保存在-20C，配制和加入都应快速避 光，反应在暗处进行，最好是用铝箔纸把管子包起来，如果IAM溶液呈粉红色， 说明已降解，就不要用了，IAM的光解产物对蛋白有不良影响。第三步：胶内酶解：typsin是最常用的酶typsin的

3、切割位点在碱性氨基酸（Arg, Lys）的C端，切割位点一侧有酸性氨基酸会降低酶切效率，如果是Pro则完全 阻止酶切。其他酶还有 endoproteases Lys-C, Glu-C 293031, Asp-N， 它们的名称代表酶切的位点，如Asp-N在Asp残基的N端切割。这些酶的切割仅 依赖于一个氨基酸的识别，比起typsin，可降低长肽段产生的概率。typsin的一个缺点是它的自切割活性，酶分子之间“自相残杀”，产生的肽段 干扰质谱结果。最初是通过加入钙离子避免这个问题。现在我们用的typsin是 修饰过的，在Lys上甲基化，一定程度上限制了自切割。修饰后的typsin最适 反应温度由3

4、545C上升为5055C。我们让酶进入胶内的方法是胶块用乙腈脱水，然后在酶液中泡胀，冰上放置后吸 去多余酶液以避免过多的酶自切割造成背景。对于酶分子进入胶块的机制说法不 一，大多数人相信酶液可以随着胶块泡胀进入胶内，但是有实验证明酶分子完全 靠渗透作用进入胶内，要提高渗透的效率，把胶块切小是个好办法。一般胶块泡 胀半小时已足够，但是要让酶分子扩散进入，最好放两个小时，这个过程中一定 要严格低温，否则酶这时候开始消化，造成肽段损失。酶切条件：37C过夜（约1215 h）。如果不想过夜，可以提高反应温度，55C 半小时就可以。在最适的温度和pH下，完全消化可以在30 min内完成。水浴加热过夜水分

5、会蒸发凝结在管盖上，所以加的缓冲液可以比淹没胶块多1020ul，如有可能，最好空气加热。表面活性剂的加入：表面活性剂可以提高蛋白的可溶性，变性蛋白，暴露酶切位 点，有利于蛋白酶的接近，如果你的蛋白是疏水性的，如膜蛋白，这一点就有用 了。Cleavable detergents是一种在一定条件（通常是酸性）下可以降解的表 面活性剂，不干扰后续的质谱鉴定。第四步：肽段抽提。在酶解的过程中，会有一些肽段从胶里游离出来。过夜酶切 的缓冲液加入0.1%甲酸终止酶切后（typsin在酸性条件下失活），液相部分被 吸出来保存。胶块中的肽段用含一定比例的乙腈的缓冲液反复超声萃取，疏水性 有机溶剂和离子的萃取液

6、保证了亲水和疏水的肽段都能被萃取出来。第一次萃取 能够回收大多数肽段，重复的萃取大约提高5-10%产率。有的时候，为了提高酸 性/碱性肽段的抽提效率，胶块分别用NH4C03缓冲液和低浓度的甲酸萃取。第五步：真空干燥。合并最初的消化buffer和各次萃取液，真空离心抽干。LC /MS样品用0.1%甲酸溶解，MALID-TOF样品用0.1%TFA溶液溶解。由于萃取体系 中含不同比例的乙腈和水，抽干的时间似乎不和液体体积成比例，可能是因为乙 腈和水以一定比例混合后，达到平衡状态，此时气化最慢。（100 ul 的纯乙腈 和水不到半小时就能抽干，而我的样品在最初30分钟内由200 ul减至100 ul，

7、 接下去的完全抽干要12h）建议a.将样品在-20C冻结后再抽干；b.蒸发进行 到“困难”阶段时，往体系中加一点超纯水，破坏平衡再干燥。抽干后的肽段一 般是看不见的，重溶时要将液滴在管壁上滚动几圈，避免肽段粘附在壁上损失。注意事项质谱兼容的银染：银染的方法有上百种，选用时注意是否会干扰质谱结果。我用 的是AMERSHAM的方法，敏化不加戊二醛，染色时不加甲醛，在显色时加。（戊 二醛造成蛋白交联而低浓度甲醛不会。）使用的缓冲液：In-gel digestion时使用的NH4HCO3缓冲液，提供弱碱性环境， pH值正好在typsin的最适作用范围内，NH4HCO3真空干燥时分解挥发，不影响 后续的

8、质谱鉴定。一般用25mM，也有用50或100mM的。角蛋白污染：打质谱的样品，从跑胶的那一步就要注意避免角蛋白污染，人的皮肤，头发上的脱落细胞，说话时的唾液，都可能污染样品。胶板，染色用的培养 皿都要洗干净。整个过程中带手套，穿工作服，不要对着管子说话。最好还戴帽 子，女生的长头发要扎起来！角蛋白几乎是不可避免的，不小心，就等着鉴定出 四五十个角蛋白来吧。样品损失问题：质谱检测，特别是银染条带，经常样品的量就在检测限附近，样 品处理过程的损失可以决定了鉴定的成功与否。洗胶块时中的振荡，超声，肽段 在管壁，tip上的吸附，不完全的萃取，质谱时不完全离子化都可导致损失。整 个过程中丢失的样品大约在

9、15%50%范围内，决定于个人操作的不同和蛋白、 肽段的性质。吸去液相时可以在大tip上再打上10ul tip，特别是1ml蓝tip 一定要加小ti p,否则很容易把小胶块吸走。最后萃取肽段时，更不能吸上胶块，否则有可能 堵仪器，至少降低了你的样品检测灵敏度吧。凝胶蛋白质点的酶解一. 蛋白质点酶解准备工作：1. 检查冻干机，调好水浴锅(37C, 56C)2. 检查各种试剂的量是否足够(DTT IAA NH4HCO3)3. 检查酶解房卫生状况每一步注意事项：1. 每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来3. 每次打开 EP 管盖

10、子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量 轻巧，以免胶块弹出。4. 在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。酶解前配制1 )、100 mmol/L 的 NH4HCO3参考配制10mL 称79.06mg NH4HCO3溶于10mL水中以后每一步 25 mmol/L 的 NH4HCO3 可用 100 mmol/L 的 NH4HCO3 稀释。2)、 1mol/L 的 DTT参考配制1OML称1.55gDTT溶于10 mL水中，1mL分装，避光贮存(锡 箔包)， -20度永久保存考染酶解步骤：调水浴锅到37C以便做脱色用，此外，调水浴锅到57C，以便做还 原用。1.

11、冲洗胶块：用水洗衣胶块2 次，2. 脱色：用含有25mmol/L的NH4HCO的50%的乙腈37C保温30min。如第一次脱43色不完全可再脱一次色2. 干燥： 吸出液体后，先加 50%的乙腈，再加 100%的乙腈调水浴锅到57C，以便做还原用。4. 还原：加入还原剂，封口，57C水浴一小时，还原蛋白质。还原剂：25mmol/L 的 NH4HCO3 （含 10mmol/L DTT）参考配制方法（4mL）: 6.2mgDTT 溶于 4mL 25mmol/L 的 NH4HCO3 中注意事项：1. 注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的 协调和发生停电等意外情况时别的

12、同学帮助临时处理样品。2.水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此 处造成不必要的失误。5. 烷基化 将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基化试剂室温暗处放置45min,使之碘乙酰胺化。烷基化试剂：25 mmol/L 的 NH4HCO3 （含 55 mmol/L IAA）参考配制方法（4mL）： 40.69mg IAA 溶于 4mL 25 mmol/L 的 NH4HCO3 中注意事项: 1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂的样品先放入暗处并，记住放入顺序和 时间，以便取出时按时间顺序处理。2、注意实验时暗处的卫生情况，应该

13、放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再 做后续实验。6. 反应完成后去掉液体，依次用25mmol/L的NH4HCO3溶液,50%的乙腈，100%的乙腈冲洗胶块，每次振荡后放置10min，去掉液体。7. 重复6的操作。8. 最后加 100%的乙腈时要充分吸干，如没有吸干可先离心一下，再用 10ul 的枪吸 净9. 酶解 每管加入适量的酶液一般加8ul （切胶仪切的胶块每管加4uL酶液），冰 上放置 30min。酶液的配制如下：取酶buffer加入Trypsin酶中，配成1ug/uL的原液，按10uL每管分装，按每2uL酶液用98uL覆盖液（10%乙腈，25mmol/L的NHHCO ）

14、稀释到430.02ug/uL,现用现配。参考覆盖液配制（2mL） 100mmol/L NHHCO 500uL43100%乙腈200 uL双蒸水1.3mL注意事项：酶从冰箱取出后所有操作过程，包括样品加酶后，都要放到冰上。10检查酶液吸胀情况，多余的酶液吸走，酶液不够，即胶块中仍有白色，则再加 入适量酶液。11.加覆盖液50uL封口，37C保温16-18小时。蛋白质酶解后样品的提取1. 将样品从 37 度水浴锅中取出后， 10000 g/1 min.2. 将上清转移到洗干净的 EP 管中。3. 在剩余胶块中加入萃取液(2.5 % TFA ,67% ACN for MALDI ,5% Formic

15、 Acid67% ACN for ESI/HCT) ,37%保温 30min。4. 超声15min,间隔5min重复超声15 min。水温不超过40度。5. 10000 g/1mi n，合并上清。6. 冷冻离心干燥至2-5 ul供质谱检测。二. 银染蛋白质点酶解准备工作：4. 检查冻干机，水浴锅能否正常使用5. 检查各种试剂的量是否足够6. 检查酶解房卫生状况每一步注意事项：1. 每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和震荡在管壁上的液滴甩下来3. 每次打开 EP 管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量轻 巧，以免胶块弹出。4. 在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。酶解前配制 100 mM 的 NHHCO43参考配制10mL 称79.06mg NH HCO溶于10mL水中43以后每一步25 mM的NHHCO可用100 mM的NHHCO 份，加3份4343水稀释。酶解步骤：1. 水洗：用双蒸水洗银染以后的胶, 摇床上洗 2-3 次,每次10 分钟2. 成像，取点 （如果还没有成像的话，以及用自动取点仪操作时，但一般情况下， 胶是做完后便要扫描的）3. 脱色，水洗脱色工作液：30mmol/L KFe（CN） : 100mmol/L Na