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1、实验一 准备实验（一）分光光度计的使用一. 目的 通过电化教学方式学习分光光度计的工作原理 掌握比色测定的基本操作方法二. 原理光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分 析。I 7I0 C -I . - L分光光度法依据 Lambert-Beer 定律：KCL，A = -lgTA：吸光度（有时用光密度OD表示）I。：入射光强度L
2、：溶液的光径长度令 A = lg 如,T = ，则 A =I I 0其中：T：透光率I： 透射光强度K：吸收系数C：溶液的浓度从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液 中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时， 吸光度A与溶液的浓度C成正比。三. 实验材料及设备1. 仪器 分光光度计 放相机 电视机2. 器材普通试管：20mLX3移液管：5mLX2烧 杯：250mLXl洗 耳 球： 2 洗瓶、试管架、移液管架：各 l四. 试剂的配制重铬酸钾(K2Cr2O7)溶液(0.2mg/mL) 称取0.2g K2Cr2O7，蒸馏水溶解后定容
3、至lOOOmL。五. 操作步骤1. 在电教室中看录像 了解 72l 型分光光度计的工作原理。2. 在分光光度室中练习操作 详细步骤见附录六。3. 在实验室中应用练习取 3 支试管，按下表所示顺序操作。管号操作空白样品0III重铬酸钾溶液(mL)5.05.0蒸馏水(mL)5.0比色以0号管为空白参比，测定=450nm处的吸光度记录吸光度(a450)六. 结果处理1.求两个样品管a450的平均值50；2. 计算重铬酸钾的摩尔消光系数。七. 思考题1. 到分光光度室中进行比色测定应携带哪些器材？它们分别起什么作用？2. 比色时，设一个“0”号管的意义是什么？实验二 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的
4、含量一. 目的了解 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理掌握总糖定量测定的操作方法二. 原理 还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦 芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力， 烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。还原糖（碱）PhphOHh2cphHCCO 二 C_OHHC_OH (HC - OH)n h2c OH糖酸3,5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸黄色）棕红色）黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原 为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅
5、与还原糖的含 量成正比，在波长为 540nm 处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品 中还原糖的含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解 法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多 糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样 品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-旦=0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。三. 实验材料及设备1. 材料 面粉2. 仪器 分光光度计 电子天平 沸水浴3. 器材刻度试管：25mLX8容 量 瓶：100mLX2
6、锥 形 瓶：100mLX1移 液 管：1mLX2 2mLX2 10mLX2烧杯：250mLX 1 50mLX 1滴 管：2洗 耳 球：2滤 纸：11cm坐标纸漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80C烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯 中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4C保存期约一 星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。2. 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜
7、用高温促溶）， 接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸 钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。3. 碘液称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。4. 酚酞指示剂称取0.1g酚酞，溶于250mL 70% （V/V）的乙醇中。5. HCI 溶液(6N)取 500mL12NHCl，用水稀释至 lOOOmL。6. NaOH 溶液(6N)取240gNaOH,加水溶解，定容至lOOOmL。五. 操作步骤1. 样品中总糖的提取(1) 取材：称取0.7g面粉，准确记录实际质量(W),放入100mL锥形瓶中。(2) 溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入1
8、5mL蒸馏水；再加入10mL 6N HCl，搅匀。(3) 水解：置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如 已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。(4) 中和：加1滴酚酞指示剂，加入10mL 6N NaOH中和至微红色。(5) 定容：将溶液转移至100mL容量瓶(B1 )中，定容。(6) 过滤：用滤纸过滤。(注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。)(7) 稀释：精确吸取滤液10mL，移入另一个100mL容量瓶(B2)中，定容。(B2)液作为总糖待测液备用。2. 标准曲线制作及样品测定取8支25mL刻度
9、试管，按下表所示顺序操作。管号操作空白标准葡萄糖浓度梯度样品012345III葡萄糖标准液(mL)0.20.40.60.81.0样品待测液(mL)1.01.0蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.01.01.0DNS 试剂(mL)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至25mL比色以0号管为空白参比，测定=540nm处的吸光度记录吸光度(A540)六. 结果处理1. 由05号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘 制标准曲线；2. 求两个样品管A540的平均值A540；3. 由A540从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；4
10、. 计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。七. 思考题1. 在样品的总糖提取时，为什么要用浓HC1处理？而在其测定前，又为何要用NaOH 中和？2. 标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？实验三Folin-酚比色法测定蛋白质含量一.目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液, 相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2七蛋白质络合物；试剂 乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色 氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。在一定蛋白质浓度范围内
11、，钨蓝和钼蓝在 500nm 波长处的光吸收与蛋白质含量成 正比，以此可测定蛋白质的含量。该方法灵敏度高，测定范围为25隧250憾，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓 度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有 干扰作用。三. 实验材料及设备1. 材料绿豆芽2. 仪器分光光度计 电子天平器材普通试管：20mLX8容量瓶：lOOmLXl移液管： 1mLX4 5mLX1烧杯： 250mLX l 50mLX l滤纸：11cm滴管： 2洗 耳 球： 2坐标纸研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：
12、各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液(250 g/mL)精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至lOOmL。溶液 A： Na2CO3NaOH酒石酸钾钠2.Foli n-酚试剂甲10g=2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；0.25g溶液B： CuSO4 5H2O 0.05g用蒸馏水溶解后定容至10mL；使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。该混合液只能保持一天。3. Foli n-酚试剂乙在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO42电0)、25g钼酸钠 (NaMoO42H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，
13、 充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。 回流结束后，趁热加入 150g 硫酸锂、 50mL 蒸馏水及数滴液体溴，再继续开口沸 腾15分钟，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色。(若仍呈绿色，须重复滴加液体溴，再沸腾15分钟，直至呈黄色。)用蒸馏水定容到1000mL；过滤；用棕色试剂瓶保存。使用前稀释1倍，使其最终浓度相当于1N酸。五. 操作步骤1. 样品液的制备(1) 取材：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g左右，准确记录其质量。(2) 研磨：将取得的材料置于研钵中，研磨成匀浆。(3) 过滤：将匀浆转移至垫有滤纸的漏斗中过滤，收集滤液；用约10mL蒸馏水分三次洗涤研钵，洗涤液也过滤并收集其滤液。
14、(4) 定容：将滤液用蒸馏水定容到100mL，作为样品待测液。2. 标准曲线制作及样品测定取8支试管，按下表所示顺序操作。管号操作空白标准蛋白浓度梯度样品012345III牛血清白蛋白标准液(mL)0.20.40.60.81.0样品待测液(mL)1.01.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.2Folin-酚试剂甲各 5.0mL反应各管混匀，室温下放置10分钟Folin-酚试剂乙各 0.5mL反应及时混匀，室温下放置30分钟比色以0号管为空白参比，测定九=500nm处的吸光度记录吸光度(a500)六. 结果处理1. 由05号管的数据，以蛋白质含量(憾)为横坐标，A500为纵坐标，在坐标纸上绘制 标准曲线；2. 求两个样品管A500的平均值A500；3. 由A500从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量(隧)；
