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1、植物品种鉴定MNP标记法国家标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会2017年第二批国家标准制修订计划，项目编号“20171813-T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。本标准起草工作组由江汉大学等单位共同组成。二、目的和意义（一）国内外研究现状与存在的问题1、植物品种真实性鉴定植物品种鉴定分为田间性状鉴定与分子鉴定两种方法，田间性状鉴定称为DUS测定,即特异性、一致性和稳定性鉴定。我国种子法对依据田间性状表现对品种进行定义，因此，田间性状鉴定具有最终的法律效力。目前，我国田间测试的国家标准或者行业标准已经涵盖191种
2、农作物和206种林木。国际上主要的品种鉴定机构包括国际植物新品种保护公约组织（UPOV）和国际种子联合会（ISF），他们的制定的田间性状鉴定标准涵盖了近700种植物。虽然田间鉴定是品种鉴定的金标准，但田间鉴定需要种植2-3个生长季节，周期需要2-3年甚至更长的时间。田间鉴定的结果中包含了环境的影响，不能够完全反应品种遗传的因素。分子鉴定技术可以克服田间鉴定的不足，具有快速且不受环境影响的优势，被逐步用于植物品种鉴定中。早期的分子标记鉴定方法采用蛋白标记法，但由于蛋白标记可用特征少，已基本被放弃。后期分子标记逐步发展为DNA分子标记。在DNA分子标记中，早期有RAPD标记法、ISSR标记法、RF
3、LP标记法、AFLP标记法等。早期的这些DNA标记法具有分型不稳定、基因型过多无法分辨、非共显性等缺陷，基本上都没有被纳入品种鉴定标准。经过数十年的植物品种鉴定标准的发展与实践，只有SSR标记法和SNP标记法被保留了下来。SSR标记法的主要优点在于多态性高和共显性。同时，SSR标记法可以在普通的实验室通过电泳的方法进行检测，获得了迅速的推广。现有的大部分植物品种鉴定标准都是基于SSR标记法建立的。然而，聚合酶在扩增SSR标记中的简单重复序列时，存在“滑动”现象，导致产生大量的不存在的错误基因型；SSR标记法依据片段长度进行检测，但电泳方式很难精准判定片段长度，为了进行品种间的准确比较，需要将待
4、测样品与对照样品在同一个电泳胶上的相邻泳道上进行电汸检测，称为平行实验。很多品种鉴定需要与成千上万的已知品种进行比较，比如近似品种的筛选、品种权侵权对象的认定、实质性派生品种判定等工作，要求结果精准就意味着需要无数次平行实验，不具有现实的可行性。基于SSR标记法存在的问题，SNP标记法在近年来被提出且被逐步用于了植物品种鉴定的标准中，如水稻品种鉴定标准。SNP标记法获得的是具体的碱基序列，因此，不需要平行实验，可以同时比对上千个品种，改进了SSR标记法的缺陷。然而，SNP标记法也有自身固有的缺陷。首先，不同于SSR标记，SNP标记是二态性标记，单个标记位点区分力有限。第二，由于单个SNP标记位
5、点区分能力有限，需要检测大量的SNP标记位点才能实现品种区分的目标，因而需要高通量的检测手段，例如基因芯片。基因芯片生产工艺复杂，需要一次合成大量的芯片才能降低单位成本，不适合普通实验室或者小作物等中使用，推广应用范围受到了限制。除SSR标记法与SNP标记法各自的缺陷外，它们还具有一些共同的不足。第一，准确性问题。SSR标记法存在7%左右的错误率，SNP标记法的错误率低于SSR标记，为1%左右，也有报道为2%甚至在杂交种中，可以达到6.7%。然而，由于SNP标记法检测位点多，即使是1%的错误率，错误位点数量也较大，可能严重影响品种鉴定结论。第二，污染问题。SSR标记法与SNP标记法都需要PCR
6、扩增富集标记位点，由于这两种方法采用染色或荧光信号显示标记位点的等位基因型，因此，需要较多的扩增产物和较大的PCR循环数，比如30个循环以上。大量的扩增产物对实验室空气造成污染，称之为气溶胶。大量气溶胶又容易掉入PCR反应中，加之PCR循环数多，少量的气溶胶可能被大量扩增，被检测出来产生错误的基因型。由于SSR标记法与SNP标记法都无法定量检测，加剧了错误基因型被检测的可能性，加剧了错误的基因型出现的频率。第三，操作与实验室要求问题。为了避免无处不在的气溶胶，对实验室洁净级别与实验操作要求都极高，限制了SSR标记法与SNP标记法在普通实验室与普通操作人员中使用。2 实质性派生品种鉴定品种B来源
7、于原始品种A且与原始品种A差异不大时，品种B就成为了原始品种A的实质性派生品种。简单地理解，同质化严重的品种为实质性派生品种。实质性派生品种制度要求实质性派生品种及其产品在生产、运输、销售与加工过程中与原始品种权人分享权利。因此，实质性派生品种制度的本义是保护原始创新，限制同质化品种。中国目前没有实行实质性派生品种制度，因此，只需要对原始品种稍作改变，即使这种改变没有任何进步意义，也可以获得与原始品种权人相同的权利。例如，仅通过简单的回交育种或者诱变育种的方式，改变了原始品种的颖尖颜色，就可以获得与原始品种权人一样的权利，“窃取”原始品种权人几年甚至是几十年的努力。这是导致中国目前品种同质化严
8、重，育种水平徘徊不前，整体落后于国外发达国家的重要原因。世界上已有有70多个国家或组织实行了实质性派生品种制度，中国是仅有的少数两三个没有正式实施这一制度的国家。可喜的是，中国已经投入实际行动，准备试行这一制度。实行实质性派生品种制度的前提是要有实质性派生品种判定的方法与标准，但中国目前实质性派生品种判定的方法与标准，严重阻碍了这一重大农业制度的实施与安排。（三）项目的意义为了充分解决现有标准中所采用的SSR标记法和SNP标记法所存在的问题，以及解决中国缺乏实质性派生品种制度实施所必须的实质性派生品种鉴定方法与标准的问题，本标准综合了分子生物学、计算机科学、统计学的知识与原理，发明了MNP标记
9、法，用于品种真实性鉴定与实质性派生品种鉴定。MNP标记法具有以下优势：（1）等位基因型丰富。MNP标记有多至2n种等位基因型（其中，n为MNP标记中的SNP标记的数量），远大于SNP标记的21=2种等位基因型，具有SSR标记等位基因型数量丰富的特点，品种区分能力强。（2）避免了SSR标记的局限。MNP标记中没有SSR标记的简单重复序列，避免了PCR扩增时产生的“滑脱”错误；MNP标记法获得的是碱基序列，十分标准，不同实验条件下的结果间可以自由且准确的比对。（3）避免了SNP标记的局限。在混合DNA分型中，MNP标记出错的概率为各个SNP标记同时出错的概率，错误率低且灵敏度高。MNP标记等位基因
10、型丰富，品种区分能力强，品种鉴定时需要的MNP标记数量少，减少了出错标记的数量，可以采用成本较高的测序技术进行检测，避免了SNP芯片杂交背景引起技术误差。（4）可以定量。同一个MNP标记位点利用二代高通量测序技术重复抽样检测了数百个测序片段，可以定量等位基因型比例、转基因含量、多倍体基因剂量等。（5）效率高。一次PCR反应同时扩增了数百个MNP标记位点；一次高通量测序可同时检测数百个样本的数千个MNP标记，效率极高。例如，我们2个人10天内检测了600份早稻DNA样本的700个标记位点。（6）品种真实性鉴定中的核心引物、扩展引物和实质性派生品种鉴定方法合为一体。UPOV和ISF等组织利用遗传相
11、似度判定实质性派生品种，其核心是要求检测的标记位点数量足够且多态性高，才能准确计算遗传相似度。MNP标记法具有多态性高的特点，同时，MNP标记法检测效率高，本标准中为每一个作物规定了500个以上的标记位点。因此，本标准中规定的品种真实性鉴定方法与实质性派生品种鉴定方法合二为一，统一了标准，同时为我国实质性派生品种制度的实施奠定了技术基础。基于以上技术特点，MNP标记法具有准确、高效、通用等特点，可以用于植物品种权精准授权、打假与维权，为种子法的实施提供了可靠的标准手段。将品种真实性鉴定与实质性派生品种鉴定合二为一，有助于规范了种业知识产权、市场秩序、提升中国种业育种水平和国际竞争力。三、标准制
12、定原则（一）标准编制原则1、高度可重现性利用标准中的方法获得的结果高度可重现，确保不同实验室的结果可以进行精准比较。2、高效性一个人利用标准中的方法在一周内，可以鉴定数百个品种，每个品种鉴定数千个位点。3、通用性在品种真实性鉴定与实质性派生品种鉴定中通用。将品种真实性鉴定的核心引物与扩展引物合二为一。在多种植物中通用，包括自花授粉植物、异花授权植物、常异花授粉植物、二倍体植物、多倍体植物、农作物、园艺植物、果树、中药等。（二）标准制订主要依据1、标准编写遵循GB1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则的有关要求。2、标准编写内容参考我国相关的法规、标准，包括种子法，以及水稻
13、、玉米、小麦、马铃薯等农作物品种的SSR标记与SNP标记鉴定的行业标准或国家标准。四、标准主要技术内容（一）MNP标记筛选在标记筛选中，遵守扩增区多态性高、引物区保守、扩增区尽量选择单拷贝区域、在不同品种中的缺失率低等引物筛选的通用原则；引物在参考基因组上的扩增长度不超过250 bp等其它特殊要求。（二）样品类型在正常体细胞组织中，父母本等位基因型拷贝数多为1:1，因此，均容易被检出。在种子胚乳中，父母本等位基因型拷贝数多为2:1，因此，母本等位基因型容易在检测中丢失。为了避免这一问题，样品类型宜选用叶、根、茎、胚等以体细胞倍性为主的幼嫩且新鲜的样本，也可以选用种子。但种子中由于等位基因型拷贝
14、数不均衡，更可能出现等位基因型丢失。幼嫩且新鲜的组织提取的DNA量大且不容易降解，因此应该优先考虑。（三）样品纯度已有的国家标准中，本标准适用范围中的所有作物的种子纯度都不低于95%，本标准的要求与国家标准对大田用种的纯度要求保持一致，以避免杂种子对分型结果的影响。（四）实验操作本标准中多重扩增循环数在20个以下，处于线性增长期。采用二代高通量测序对扩增的线性产物进行检测，可以实现等位基因型间的相对定量。利用定量结果，可以排除实验室的气溶胶污染。因此，本标准对防止气溶胶的污染要求并不是十分严格，只要求实验分区、单向流动、设备器具专用且保持通风，这些要求在普通实验室可以满足，降低了本标准实施条件
15、的要求，使得本标准可以在更多实验室更方便地实施。（五）多重PCR扩增循环数根据的我们的大量实验的结果，PCR循环数20个时，等位基因型的比例在重现性实验中保持稳定，避免了由于等位基因型消失造成的实验不可重现性，因此，本标准规定多重PCR循环数20个。（六）测序量与质量控制我们利用本标准的方法，从2016年到2019年鉴定检测了1万多个植物品种样本。当将平均测序量设置为700倍以上时，95%以上的样品的平均覆盖倍数都可以达到规定的500倍。当平均覆盖倍数达到500倍及以上时，99%以上的样品在一次实验中，R1或R2的值可以达到95%及以上，以保证在以上参数的规定下，绝大部分品种鉴定实验可以一次性地通过测序数据量质量控制。图一到图八列了几种具体物种在几千个品种的检测中，测序片段数与R1（纵坐标）之间的关系。图一、龙眼的测序片段数量和标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图二、蕃茄的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图三、棉花的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图四、荔枝的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图五、玉米的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图六、水稻的测序片段数量和与标记位点的检出率。（注：横坐标为品种）图七、黄瓜的测序片段
