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1、. . *文件文件名称微生物限度检验操作规程文件编号SOP-ZL65-2制 定 人审 核 人审 核 人制定日期审核日期审核日期批 准 人批准日期生效日期颁发部门品管部印 数份分发部门品管部目的 建立微生物限度检查操作规程，规操作，保证结果的准确性。围 成品、辅料、包装袋与纯化水的检验。责任 品管部微生物限度检验人员容概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法进行检查。微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。2、计数方法 本法包括平皿法、
2、薄膜过滤法。3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。4、菌种与菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。4.2菌液制备 按表1规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入
3、3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时使用；若保存在2-8，可在24小时使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8，在验证过的贮存期使用。表1 试验菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数霉菌和酵母菌总数需氧菌总数霉菌和酵母菌总数金黄色葡萄球菌Staphylococcus
4、 aureus CCMCC(B) 26003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间1824h胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC(B) 63501白色念珠菌Candida albicans CMCC(F) 98001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖
5、液体培养基，培养温度2025，培养时间23天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。黑曲霉菌Aspergillus niger CMCC(F) 98003沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间57天，或直到获得丰富的孢子4.3阴性对照 为确认试验条件是否符合要求
6、，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。4.4培养基适用性检查 按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2围，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。5、计数方法适用性试验5.1供试品制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。制备时若需加温应加热均匀且温度不得超
7、过45。供试液从制备到加入检验用培养基不得超过1小时。5.1.1成品、辅料供试液的制备 取供试品，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液体培养基或稀释制成1:10供试液，若需要，调节供试液PH至6-8，必要时用同一稀释液将供试液进一步10倍稀释系列。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。5.1.2包装膜、袋：取供试品100cm2，剪碎，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1:10供试液。若需要，调节供试液PH至6-8，必要时用同一稀释液将供试液进一步10倍稀释系列。5.2接种
8、和稀释 按以下要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中微生物能被充分检出，应首先选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。5.2.1试验组 取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液所含菌量不大于100cfu。5.2.2供试品对照组 取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。5.2.3菌液对照组 取不含中和剂与灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。5.3供试品中微生物的回收 表1所列的计数方法适用性试验的各试验菌应逐一进行微生物回收，微生物回收采用平皿法。5.3
9、.1平皿法 采用倾注法，表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿。取照上述“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml温度不超过45熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养、计数。同法测定供试品对照组与菌液对照组菌液，计算各试验组的平均菌落数。5.3.2薄膜过滤法 采用的滤膜孔径不大于0.45um。滤膜直径一般为50mm。滤器与滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液与冲洗液覆盖整个滤膜表面
10、。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，按表1规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。6、结果判断 计数方法适用
11、性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2围。若各试验验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法与计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。若存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，应选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品检查。二 供试品的检查1、检验量 即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。一般随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取10g、10ml或100cm2进行检验。2、供试品检查 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。胰酪大豆胨琼脂培养基
12、或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。2.1阴性对照试验 以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。若有菌生长应进行偏差调查。2.2平皿法 取规定量的供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。2.2.1培养和计数 胰酪大豆胨琼脂培养基平板倒置于3035培养箱中培养35天。沙氏葡萄糖琼脂培养基平板倒置于2025培养箱中培养57天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数并报告。菌落蔓延成片的平板不宜计数。点计菌落数后计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌落数
13、。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。2.2.2菌数报告规则 需氧菌总数宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最高平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品中所含微生物，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均茵落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。2.3薄膜过滤法 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试液制备。取相当于每滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜
14、稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上培养。2.4培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每滤膜上的菌落数应不超过100cfu。2.5菌数报告规则 以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。3、结果判断3.1需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙
15、氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时应进行培养基适用性检查。3.2各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：101cfu：可承受的最大菌数为20；102cfu：可承受的最大菌数为200；103cfu：可承受的最大菌数为2000，以此类推。3.3若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的 规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。控制菌检查法l、简述控制菌检查法是用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在某些特定微生物。本标准的控制菌为大肠埃希菌CMCC(B) 44102、铜绿假单胞菌 CMCC(B) 10104和金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，
