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1、QPR原理及应用由于Realtie qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被reltme qPCR所代替。由于ralti aR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测,很多没有做过retimeqPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从realtim qPCR的发展史说起，包括realtime CR的原理，实验设计，实际操作，数据分析,常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-tme qP，彻底的从菜鸟到高手!一、Realime qP
2、CR发展史RealtieqPR就是在CR扩增过程中,通过荧光信号，对R进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据.由于常规的PCR的缺点,ral-time qPCR由于其操作简便,灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,NP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等.在ealtm qPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用.199年,美国PE公司（已经并入Ivitrogen公司)成功研制了Taqmn技术，1996年推出了首台荧光定量C
3、检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析从而荧光定量PR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有AI0、7300、700，770、790T、tepOnluT、eneTM、PRISMStepOneT系列;BI-AD的CFX9、iCyclei5、Myi、J Rseach hm4TMOpticon系列；SratagnexTM系列;cheLightCyle系列;pnfMsercycler；CorbetRotorGe;phidSmartCcr和BIO的LeGee系列随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的r
4、ete PC仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。二、Ral-ime qPCR概述. Rel-time PC原理实时CR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PC进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LE;荧光检
5、测元件常用两种方式:光电倍增管和冷光CD摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。在实时CR扩增过程中,荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光阈值和Ct值.2 eal-time qPCR的数学原理首先来看一个r-ime qR中的重要参数值（Ct value),阈值(reshold),和基线（basei)。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的0倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。那么为什么说t值跟初始模板的量成反比呢?我们来看C的扩
6、增方程：从线性方程上看,斜率(slope)为1/l（1+E),所以E=101/lope1如果从标准曲线上得到斜率（3.），就可以算出扩增效率(0。99）一般来讲PC扩增效率在90%-11都是可以用于数据分析的。效率低于10%，是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。3。 Real-ti PCR的种类根据ral-tme qPR的化学发光原理可以分为2大类:一类为探针类,包括TaMa探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;一类为非探针类，其中包括如YBRGree 或者特殊设计的引物(如LP) 通过荧光染料来指示产物的增加
7、.3. Tamn探针法aqman探针是最早用于定量的方法.就在PR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸:5端标记一个报告荧光基团，3端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,也就是FRE反应；PR扩增时,Taq酶的-3外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条D链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqanMGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。3.2
8、 分子信标法分子信标:一种在靶A不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近.分子信标的茎环结构中,环一般为1-3个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一般-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端分子信标必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后,分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。3.3 YBRrn 法RGreen 是一种结合于小沟中的双链DN结合染料,与双链DN结合后,其荧光大
9、大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想.SYBGn 的最大吸收波长约为49m,发射波长最大约为50n。在PC反应体系中，加入过量SRGreen荧光染料，YBRGre 荧光染料特异性地掺入D双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的YRGeen染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步.。4LUXPimes法UX （ligtpo ttion）引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构，使荧光淬灭.在有目标片断的时候,引物与模板配对，发夹结构打开，产生特
10、异的荧光信号。.Realte qP和常规PC的区别 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高需要样品少特异性高 精确定量三、Ralme qPC实验设计实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间!尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路,设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个real-tm qCR而言,首先就是实验材料的处理和准备;然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明)。1. 实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差
11、异分析为例。实验材料分为对照组(CO)和处理组（T）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品）。一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材.现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液 ,比如百泰克的RAfx。2。 引物设计一般realtime PCR引物的设计遵循下面一些原则： 扩增产物长度在80-150bp。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 产物不能形成二级结构。 产物长度一般在3碱基之间。 +含量在400之间。 碱基要随机分布。
12、 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续个碱基的互补。引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物端要避开密码子的第3位.Taan探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则： 尽量靠在上游引物； 长度30-4p，比引物高至少5;5端不要是,G会有淬灭作用,影响定量四、Raltime P操作过程1。 RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染由于RNA酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的.在实际的操作中应遵循下面一些原则：1. 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好
13、的微生物实验操作习惯预防微生物污染。2。 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RN,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用NA探针的实验室可能用RNA酶A或1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RN酶。3在提取裂解液中，RA是隔离在NA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿.玻璃器皿可以在10C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡1分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当然，这些也不是绝对的要求.如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA的提取。2。
14、Mix配制一般来讲,进行rel-time qPCRaserix都是2的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于ea-time PC灵敏度高，所以每个样品至少要做个平行孔，以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析.通常来讲，反应体系的引物终浓度为00-00m；模板如果是总RNA一般是1ng-500,如果c，通常情况下是1u或者1ul的1倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MstrMi,模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意：1. MaterM不要反复冻融,如果经常使用，最好溶解后放在4度。 更多的配制Mx进行，减少加样误差。最好能在冰上操作3.每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4。所有成分加完后,离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（rferncy,psse dye）常用的是XM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料,只要不影响检测PC产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差,提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把OXTM配制在Mastrix或者Premitr里.如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROTM染料校正.通常来讲
