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1、第7章纳米基因药物7.1概述自20世纪70年代DNA重组技术诞生以来，以重组DNA技术为核心的现代生物技术 产业蓬勃发展。1976年，世界上第一家应用生物技术开发新药的公司（Gentech公司）建 立，开创了现代生物技术产业发展的新纪元。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志世界第一个基因工程药物的 诞生。接着，美、日、英、瑞士等国先后批准了 10余种基因工程药品上市。例如，EPO、 G-CSF、tPA等，在治疗肿瘤等一系列疾病上取得明显的疗效。此后，以基因工程药物为主的各种基因工程产品和细胞工程产品层出不穷，并陆续商 品化。基因工程药物因其疗效好，副作用小，应用范围广泛而
2、成为各国政府和企业投资开 发的热点领域，大量的基因工程药品连续问世，年产值达数十亿美元。基因工程药物是将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细 胞（微生物、动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得以表达，最后将表达 的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白质药物或疫苗。这就称为基因工程药物。现 有或正在开发中的基因工程药物大致有以下几类：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、干 扰素、白介素、生长因子、重组可溶性受体、反义药物、人生长技术、组织纤溶酶原激活 剂、凝血因子、集落刺激因子、促红细胞生成素及超氧化物歧化酶（SOD）等，若目的基 因直接在人体组织靶细胞中表达，就
3、成为基因治疗（Gene therapy）。广义基因治疗是指利用基因药物的治疗。通常所说的基因治疗，即狭义基因治疗，是指 用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列。主要的治疗途径是体外（ex vivO基 因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内。自1990 年较成功地进行了腺苷脱氨酶（ADA）缺乏引起的免疫缺陷病的人体基因治疗至今，大部 分基因治疗临床试验都是体外基因治疗，即先从病人体内获得某种细胞（例如T淋巴细胞）， 进行培养，在体外完成基因转移后，筛选成功转移的细胞扩增培养，然后重新输入患者体内。 这种方法操作复杂，但效果较为可靠。此外，基因治疗也可以用基
4、因药物进行直接体内治疗， 所用的基因药物可以是完整基因或基因片段（包括DNA或RNA）；治疗途径可以是替代治 疗或抑制性治疗。例如，1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗 遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr转入患者肺组织中。这种直接往人体组织细胞中转移 基因的治病方法叫做体内(in vivb基因治疗。在基因治疗过程中，外源基因及其构建体多为纳米尺度的DNA分子，因此这种转基因 方式大多涉及纳米技术。另外外源基因只有整合到细胞染色体中，变为其中一部分才有可能 得到持续的高表达。由于人体内只有少数几种细胞或组织可接收直接导入的裸露DNA，而 其它细胞或组织对此法有抗性。因此
5、，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因有效地转移 到人体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是关系到基因治疗成败的关键。经过 近二十年的努力，各种帮助外源性基因进行转移的方法相继问世。这些方法包含物理学、化 学和生物学方法。物理方法主要有电穿透法、显微注射法、基因枪法和碳化硅纤维介导法等; 化学方法主要包括磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖介导法、聚乙二醇介导法和脂质体介导法等; 生物学方法主要包括以病毒(如腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒和疱疹病毒等)为载体进 行基因转移，以及农杆菌介导法等；生物物理方法主要有电击法和胚胎干细胞法等。在前述 的各种转导方法中，除了电穿透法、显微注射法、基因枪法
6、和碳化硅纤维介导法等物理方法， 其他各种转导技术都是利用纳米级载体携带外源基因进入受体细胞，因此属于典型的纳米操 作范畴。随着基因治疗研究的不断深入，尤其是伴随着基因治疗临床实验的广泛开展，人们已认 识到理想的基因载体应当具备如下特点：靶向特异性，且不被免疫系统识别；有利于 基因高效转移和长期表达；高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；无毒副作用，可生 物降解，对病人和环境安全无害。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector) 和非病毒载体(non-viral vector)两种。基于本书为“纳米药物”故本章重点阐述与纳米技 术关系密切的非病毒载体。非病毒纳米基因载体的研究在
7、近几年愈来愈受到人们的重视。到目前为止，研究者们已 设计了多种类型且各有特点的非病毒纳米基因载体，主要包括脂质体(liposome vector)和 阳离子聚合物(cationic polymer vector)，如壳聚糖、多聚赖氨酸、树状大分子等。非病毒纳米基因载体的本质是将基因治疗中的基因看作药物，然后从药剂学和生物药剂 学的角度来考虑如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。由于常用的DNA为超螺 旋或开环结构，空间体积太大，并且不能有效主动地进入细胞，因此必须进行压缩(condensation)或利用其它分子或技术的辅助。DNA分子在加入诸如多价阳离子(Ca2+、 Co3+、La3+
8、等)、脂质体、阳离子聚合物、酒精或碱性蛋白后通过压缩过程可以组装成高度 有序的结构，使体积缩小为原来的百分之一以下，从而可以有效地进入细胞并进行转染。7.2纳米脂质体纳米脂质体介导的基因转移有以下的优势:Q纳米脂质体与细胞膜融合将目的基因导入 细胞后即被降解，对细胞无毒副作用，可反复给药；拦纳米脂质体与基因的复合容易，制备 简单，重复性好，易于大量生产；0纳米脂质体不激活癌基因和免疫反应；QDNA或RNA 与纳米脂质体复合后，不易被灭活或被核酸酶降解；Q纳米脂质体携带的基因可转运至特定 部位，操作简单快速，重复性好。纳米脂质体介导的基因转移面临的主要问题是脂质体对靶细胞缺乏识别能力，基因透过
9、细胞膜的能力较低，以及脂质体在血浆中的稳定性较差。为了解决以上问题，研究人员根据 需要对脂质体进行了适当的修饰来制备各种类型的纳米脂质体，如阳离子纳米脂质体、聚阳 离子纳米脂质体、免疫纳米脂质体、融合纳米脂质体、pH敏感纳米脂质体和长循环纳米脂 质体等1-5，其中有关阳离子纳米脂质体的研究最为广泛。本节重点介绍阳离子纳米脂质体 (cationic nano-liposome)。7.2.1阳离子纳米脂质体的组成1987年，Felgner等6首次将等量的氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)和 二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)制成小单层脂质体，即转染试剂Lipofectin。实验结果
10、表明 此转染试剂可有效地用于DNA转染。1989年将该转染试剂用于RNA的转染，发现其可高 效转移RNA到人、鼠等多种动物细胞内。这一发现大大促进了阳离子脂质体作为一类新型 高效基因载体的广泛应用研究。目前使用的阳离子纳米脂质体通常由一种阳离子脂质和一种中性辅助脂质在适当的条 件下复合而成7。阳离子脂质体转基因的效率与阳离子脂质的组成密切相关8。下面将分别 对一些常见的阳离子脂质、辅助脂质和脂质体的结构进行介绍。1 阳离子脂质阳离子脂质分子在结构上由四个部分组成：一个或多个阳离子头部(head)、连接链 (spacer) 连接键(linker bond)和疏水烃尾(hydrophobic ta
11、il)。阳离子脂质的头部大都包含胺类基团(除一种脂质含脒基外)，从简单的氨基到被甲基 或羟乙基团取代的季铵盐。阳离子脂质的极性头起着脂质体与DNA、脂质体-DNA复合物 与细胞膜或细胞内其它组分相互结合的作用。在阳离子胆固醇衍生物中，带有叔胺基团的阳 离子胆固醇化合物比季铵盐化合物有更高的转染活力，并且毒性小得多。带有多价极性头基 团或具有多个正电荷极性头的阳离子脂质体转染效率较高，这可能是因为它与DNA的结合 较牢固。连接链的长度能影响阳离子纳米脂质体与粘膜表面的相互作用，从而影响转染活力。一 般来说，带有长连接链的阳离子纳米脂质体能显著增强与粘膜表面的相互作用，转染效率高。连接键是类脂分子
12、很重要的组成部分，它决定了阳离子纳米脂质体的化学稳定性和生物 可降解性。醚键和C-N键的化学稳定性较高，但不易被生物降解，一般不适用于体内实验; 含有酯键的阳离子纳米脂质体较易被生物降解，细胞毒性小，但它们的化学稳定性通常较差。 通常采用的连接键是化学稳定性较高、但又可以生物降解的酰胺键和氨甲酰键等。常见的阳离子纳米脂质体的疏水烃尾主要有脂肪烃基链和胆固醇环。脂肪烃基链的碳原 子数通常为12至18个，以达到在生理温度下为脂双层提供足够的流动性，又能使脂双层膜 维持一定的刚性，以便为阳离子纳米脂质体在体内的脂质融合创造条件。对以脂肪链为尾部 的脂质体，碳链加长会导致转染效率降低，但在链内引入不饱
13、和键可提高效率。将胆固醇用 作疏水烃尾，效果常常优于脂肪链，因为由它参与形成的双分子层结构更稳定。表7-1内列 出了目前常用的一些阳离子纳米脂质9,10。2辅助脂质辅助脂质主要有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）等。二油酰 基磷脂酰乙醇胺（DOPE）是应用最广的一种辅助脂质，可与阳离子脂质形成稳定的纳米脂 质体，与DNA等具有良好的融合性。该脂质在阳离子脂质体与DNA形成复合物、复合物 进入细胞、复合物从内涵体脱离以及DNA与阳离子纳米脂质体分离的过程中都起着重要的 作用。因此，DOPE已被广泛应用于阳离子纳米脂质体基因转移系统中以提高基因的转染 效率。目前最常使用的
14、脂质体，如DOTMA/DOPE脂质体、DOSPA/DOPE脂质体、DDAB/DOPE脂质体都含有DOPE，其中DOTMA、DOSPA、DDAB作为阳离子脂质靠静电 作用与核苷酸结合，而DOPE则作为可融性脂质促进阳离子脂质与细胞膜的融合。若用 DOPC （二油酰基磷脂酰胆碱）代替DOPE，脂质体的融合性下降，转染效率也随之降低。 这正是DOPE成为“脂质伴侣”的原因11。而以Chol为辅助脂质的阳离子脂质体虽然稳定 性提高，但转染效率却降低。此外，加人大相对分子质量的阳离子聚合物，如聚赖氨酸（PLL）或硫酸鱼精蛋白，可 减小复合物的粒径，有效避免DNA被核酸酶降解，从而提高转染效率12,13。
15、表7-1用于制备阳离子纳米脂质体的常见阳离子脂质缩写名化学名DOTMA氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵DOTAP漠化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵DOSPA三氟乙酸二甲基-2, 3 -二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵DTAB漠化三甲基十二烷基铵TTAB漠化三甲基十四烷基铵CTAB漠化三甲基十六烷基铵DDAB漠化二甲基双十八烷基铵DORI漠化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵DORIE漠化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵DORIE-HP漠化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵DORIE-HB漠化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵DO
16、RIE-HPc漠化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵DPRIE漠化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵DSRIE漠化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵DMRIE漠化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵DOGSN-(2-精胺甲酰基)-N, N -双十八烷基甘氨酰胺DOSC1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯DC-Chol3B-N- (N，N-二甲基胺乙基)胺基甲酰基胆固醇LPLL脂质多聚-L -赖氨酸SA硬脂胺7.2.2阳离子纳米脂质体的结构脂质体的体内过程除与脂质的化学组成相关外，还与脂质体的大小和形状等特性有关。 脂质体的直径约在25 nm1000 nm范围内，甚至更大。它们可由单层双分子膜组成
