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1、检验项目支原体检测方法汇总如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测？支原体的检测方 法有哪些？目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光 指示细胞法、PCR法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺 点。各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法 联合使用。一、培养法 培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来 进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检 查。_fun =宇-_（）材料与设备1.精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制， 高压除菌（加20胎牛血清） 。2. 支原体琼脂培养基 按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加 20胎牛血清）。3. 其
2、他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37C 培养箱。（二）操作步骤 1. 样品的储存。样品取材后，最好尽快进行 检测。样品如在24h以内进行支原体检测，可储存在28弋；如果超 过24h样品应放置于-20弋以下保存。-20弋保存的样品，进行检测 时需重新加入到对照培养细胞中，培养 72h 后，取上清直接进行接种 检测。2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。3. 将样品分别接种到 10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中 （已冷却至36弋），每支培养基接种样品0.5 1.0ml.每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。4. 接种6d后，取3支精氨酸肉汤
3、培养基中样品0.5 1.0ml.复 种于精氨酸肉汤培养基中。5. 36 C培养29d,每隔3d观察一次。记录实验结果。（三）结 果判断培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色 改变（粉色或黄色） 。半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀 二、荧光指示细胞法荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺， 易造成漏检。常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞 法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm （紫 夕卜激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA中富含A-T的 区域，由于支原体的 DNA 中 A-T 含量占多数（55
4、%80%），所以可 被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核夕与细胞周 围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体 DNA, 证明该细胞有 支原体污染。（一）材料与设备1. 荧光显微镜。2. CO2培养箱。3. 无菌小爬片。4. 无菌培养皿。5. 不含抗生素的完全培养液。6. 二苯甲酰胺荧光染料浓缩液（50g/ml）。称取5mg二苯甲酰胺 荧光染料加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中，在 室溫下用磁力搅拌3040min,使完全溶解，-20弋避光保存。7. 二苯甲酰胺荧光染料工作液（0.5ug/ml）。取1ml上述浓缩液， 加至100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks
5、溶液中，终浓度为0.5pg/ml。8. 固定液，即乙酸：甲醇（1 : 3）溶液为细胞固定液。9. 封 片 液 。 0.1mol/L 枸 橼 酸 22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO412H2O 27.8ml,丙三醇50.0ml，以上三者混匀，调pH至 5.5 。10. 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBS。经多种方法 检测确定为支原体阴性的VERO细胞。（二）操作步骤1. 无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。2. VERO 细胞爬片：将小爬片无菌置于小培养皿内，滴加 VERO 细胞悬液（细胞浓度约3x104个/ml） 23ml,置于CO2培养箱内培养 24h 使
6、其贴壁。3. 制备标本。向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对 照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h后（VERO 细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。4. 漂洗将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、 NaHCO3 的 Hanks溶液（或PBS）漂洗3次。5. 固定用乙酸：甲醇（1 : 3） 固定液固定 10 min。6. 漂洗待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。7. 染色一置于 Hoechst 33258 工作液（0.5ug/ml）中染色 10 min。8. 漂洗去离子水中漂洗3次，每次1 2min。9. 封片，紫外激发，观察。（三）结果判断 当阴性及阳性对照结果均
7、成立时，结果有效。1. 阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。2. 阳性结果 荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等 不规则的蓝色荧光小点和丝状点。（四）小结1. 严格配制工作液及封片液。2. 保证作为指示细胞的VERO细胞没有被支原体污染。3. 必须同时设立阳性及阴性对照， 注意重复，以排除假阳性和假 阴性结果。4. 应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体 还是支原体污染。5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异 性染色，如胞浆着色。三、PCR法PCR 法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细 胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种
8、支原体的污染， 是目前常用的检测手段。但其成本较高，条件要求严格，且有时易出 现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑的样品要经过3次PCR检测， 或用培养法检测。PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增实 验，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧 核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格，实验成本较高，有时还会出现假阳性的现象。200bp芒 Ezvwa *s 瓷冒SE 誉蔓上s peSLM 盏SP45V JW 呈 so(一)材料与设备支原体PCR检测试剂盒、dNTP、Ta
9、qDNA聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR仪、电泳仪、 凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。(二)操作步骤 1.样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液500|jl ,4弋保存待测。2. 模板的制作。在无菌的条件下，取细胞培养上清1 00pl于一无 菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子，95 C水浴加热5min。3. 打开盖子，向管内加StrataClean Resin 10pl,盖好盖子，旋涡 混悬器混合，离心 5 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制 作完毕，4C保存。4. PCR 反应。反应体系的最适条件为 10mmol/L Tr
10、is-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5 2.5 mmol/L MgCl, 200 pmol/L dNTP 2U Taq DNA聚合酶，总反应体系为50pl ,反应用去离子水均需用 紫外灯照射。(1)在0.5ml塑料离心管中加入35.2pl去离子水及5pl 10 xTaq 反应缓冲溶液。(2 )依次加入下列成分:0.4pl dNTP (25mmol/L)、0.4|jl Taq 酶(5U/ul )、2|jl 引物。(3) 加2pl去离子水，总体积45川。(4) 加5pl已制成的模板到反应体系中。(5 )阳性对照，内对照各5pl加入到各自的反应体系中。(6)取1支含
11、有以上反应体系的离心管，加入5pl去离子水作为 阴性对照管。(7 )在反应体系中加入100川矿物油。(8)PCR程序见下表。(程序循并次隸温度(OEFj间(min )5. 琼脂糖凝胶电泳。PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼 脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。 6.结果分析。 该方法为检测支原体的定性方法，在电泳泳道上，Marker、阳性对照、 内对照均会出现不同的电泳条带， 当被检样品泳道出现明亮条带，且 位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污 染。有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染 2 种以上支 原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀
12、疑有支原体污染，重做 该样品。三)注意事项 PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性，有时需多次重复。、扫描电子显微镜法扫描电子显微镜法：扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测（一）原理利用电子显微镜的超级放大功能， 直接观察培养细胞 中支原体污染情况。（二）材料与设备待检测细胞，0.05%胰蛋白酶/ 0.02%EDTA、 2.5%的戊二酸、1%锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.4 ），扫描 电镜及相关设备。（ 三）操作步骤1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片 的培养皿中。2. 37C , CO2培养箱中培养24h ,取出盖玻片。3. 以PBS洗涤3次。4 .以2 .5%戊二醛/PBS固定15min , PBS洗涤。5 以1%锇酸固定30min, PBS洗涤。6 .乙酸异戊酯脱水。7. CO2冰点干燥。8. 喷金。9 . 扫描电镜观察，照相。（四）结果分析支原体感染会使培养细 胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来 说每 1 至 3 个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规 化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
