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1、实验五 植物花药培养技术一、实验目的了解植物花药培养原理及在遗传育种上的意义,掌握植物花药培养技术。二、实验原理及相关内容说明利用花药培养技术,将配子培育成单倍体,经染色体加倍而成双单倍体纯合 个体,再经选择即可得到优异的纯系,从而可提高选择效率,缩短育种周期。此 外,花药培养在克服远缘杂种的不育性,快速高效地创造染色体工程的基础材料, 以及在细胞水平特别是单倍体细胞水平上进行诱变,提高诱变育种效率等方面也 具有很大的应用潜力。植物花药培养的一般程序是:镜检选取发育适期的花药并接种到诱导培养基 上,诱导出愈伤组织;然后将愈伤组织转移到适宜分化的培养基上,促使分化成 苗;最后将根系发育良好的健壮
2、幼苗移栽,培育成花粉植株以供选育。三、材料、仪器及药品1、材料大花紫薇或其它的植物。2、仪器用具超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、分析天平、锥形瓶、烧杯、量筒、移液 管、容量瓶、镊子、酒精灯、玻棒、棉花、牛皮纸、橡皮筋、pH精密试纸等。3、药品试剂培养基、 75%酒精、 95%酒精、 1%或2%的次氯酸钠溶液或 0.1的升汞、蒸 馏水、无菌水、培养基成分、6-苄氨基腺嘌吟(6-BA)、萘乙酸、吲哚乙酸等。四、方法步骤1、配制培养基( 1 )配制母液a. 大量元素母液(10X):按培养基配方分别称取10倍所需量的各种大量元素的无机盐,依次溶于重蒸水中,最后定容至1000毫升。b. 微量元素母液(1
3、00X):按培养基配方分别称取100倍所需量,同上。c. 有机附加物母液(1000X):同上。d. 生长素类物质母液:生长素类物质单独配成母液。IAA、NAA配制母液 时先用95%酒精溶解;6-BA需先用1摩尔/升HC1或NaOH溶解。e. 铁盐母液(100X):分别称取100倍用量的Na2EDTA和FeSO4.7H2O分 别溶解后混合定溶。f. 其他成份如蔗糖、琼脂等可在配制培养基时称取所需用量加入。g. 配制好的各母液,贴上标签,标明药品名称和母液含量,放入冰箱备用。(2)配制培养基a. 根据需配培养基的量,吸取所需母液量,加入蔗糖 6%10%、琼脂及附 加成分,定容到1000毫升,用1摩
4、尔/升NaOH或HC1调pH值为5.8。b. 趁热将培养基分装到培养瓶中,每瓶约装培养基 25 毫升,盖上瓶盖。(3)培养基的灭菌a. 将分装好的培养基、所需的无菌水及其他接种用具用牛皮纸包扎好后, 放入高压灭菌锅,在0.81.0千克/平方厘米下灭菌20分钟。b. 灭菌后取出培养基,放在温度相近的培养室冷却,以免因温差太大,使 培养基瓶中凝成过多的水珠,增加污染机会。2、花药培养(1)花粉发育时期的鉴定一般宜选用小孢子发育处于单核中、晚期的花药进行培养。a. 形态观察:观察不同发育时期的花蕾的形态特征。b. 镜检鉴定:将花药取出,在载玻片上,轻轻涂抹,滴1 滴醋酸洋红,盖 上盖玻片,镜检。如细
5、胞核位于中央,为单核早期;细胞核偏离中央,逐 步出现小液泡,为单核中期;当细胞核被挤到萌发孔对面,中央形成大液 泡,为单核晚期。(大部分小孢子处于单核中、晚期)c. 经过鉴定明确合适的花蕾长度,方便培养时取材。(2)花药的接种a. 洗净双手,用 75%酒精擦洗,花蕾先用 75%酒精浸泡30秒,再浸入1% 次氯酸钠1015分钟或0.1%升汞溶液中810分钟,无菌水冲洗3次。b. 用镊子将花药取出,去除花丝,放入装有培养基的培养瓶内,接种后盖 上盖子,封口并写明接种材料、日期、接种人。(锥形瓶)注意(3)胚状体或愈伤组织的诱导a. 愈伤组织诱导一般用 MS 基本培养基,附加一定量的生长素类和细胞
6、分裂素类物质,可加0.5-1.0毫克/升6-BA、2.0毫克/升IAA等。b. 将接种到愈伤组织诱导培养基上的花药置于2528C的恒温室内进行暗培养,约15天可陆续长出愈伤组织。(或胚状体)图片(4)愈伤组织的分化与移栽a. 分化培养基一般用MS基本培养基,加1.02.0毫克/升KT、或1.02.0 毫克/升6-BA、0.51.0毫克/升NAA,蔗糖浓度改为3%。b. 当愈伤组织长到直径 23 毫米大小时转移到分化培养基上,置于 2328C恒温室内,每天光照911小时,光强2000勒克斯以上。一般约在2周 后愈伤组织分化出绿芽或根。c. 待绿苗长到 510厘米时移栽,移栽前根部的培养基洗净,练苗。五 作业与思考题每人接种 1 瓶花药,根据自己的实验体会,总结花药培养过程中如何避免 污染?